基于纳米材料负载的生物杀虫剂及其制备方法与流程

[0001]
本发明属于生物农药技术领域，涉及基于纳米材料负载的生物杀虫剂及其制备方法。


背景技术：

[0002]
人口的持续增长，需要农业不断提供足够的食物，这是全人类共同面对的挑战。然而，害虫、植物疾病和杂草给农业带来严重的减产。为了控制这些病虫害及杂草，大量的农药和生物活性药品已经被广泛使用，却随之造成的环境污染、食品安全等问题。据报导，直接喷洒在植株上的农药约有60～70％并没有得到有效的利用，而是直接流失到土壤中，污染地下水，或者部分残留在植物的叶子和果实上，进入人类的食物链，对食品安全造成威胁。
[0003]
此外，很多杀虫剂和生物活性药品都是脂溶性的，需要使用含氯多芳烃、烷烃、n-甲基吡咯烷酮等大量有机溶剂先将其溶解，才能实施喷洒，这些有机溶剂的使用也会对环境造成再次污染，给人类的健康造成损害。
[0004]
而且，杀虫剂的传统剂型是针对成分相对单一的化学农药开发的，而将活性成分复杂的植物源等生物农药开发成传统的乳油和水剂易受淋溶、蒸发、降解、生物等环境因素的影响，其有效利用率往往只有30～40％，导致防效下降、应用成本升高，且有机溶剂的大量应用不但对制剂有效活性有影响对环境的威胁也极大。
[0005]
专利申请cn108124889a公开了一种植物源杀虫剂及其制备方法，该杀虫剂含有植物杀虫剂、纳米碳材料增效剂和助剂。植物源杀虫剂为苦参碱和/或印楝素；纳米碳材料增效剂是粒径为10～40nm的无定形纳米石墨碳粉或碳粒径为10～40nm的纳米石墨碳溶胶。但是该杀虫剂负载效果欠佳，影响了杀虫剂的杀虫效果，持效时间也较短。


技术实现要素：

[0006]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于纳米材料负载的生物杀虫剂及其制备方法，杀虫效果好，且具有较长的持效时间。
[0007]
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0008]
1、基于纳米材料负载的生物杀虫剂的制备方法，具体步骤如下：
[0009]
(1)先以正硅酸乙酯和γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷为原料制备纳米微球；
[0010]
(2)然后在纳米微球表面修饰环糊精，得到改性纳米微球；
[0011]
(3)再将橘橙指孢囊菌培养得到发酵液，接着向发酵液中加入毛大叶臭花椒提取物、苦皮藤提取物，搅拌混匀得到混合液；
[0012]
(4)最后将步骤(3)所得混合液利用步骤(2)所得改性纳米微球进行负载，即得所述的生物杀虫剂；
[0013]
其中，所述毛大叶臭花椒提取物是以毛大叶臭花椒的叶或果皮提取得到；所述苦皮藤提取物是以苦皮藤的根皮或茎皮提取得到。
[0014]
优选的，以重量份计，所述毛大叶臭花椒提取物的制备方法如下：先将1份毛大叶臭花椒的叶或果皮粉碎至100～200目，然后倒入5～8份60～80℃温水中浸泡2～3小时，接着300～500w超声波振荡处理50～70分钟，再加入1～2份无水乙醇，500～700w超声波振荡50～80分钟，旋蒸浓缩，干燥，即得。
[0015]
优选的，以重量份计，所述苦皮藤提取物的制备方法如下：先将1份苦皮藤的根皮或茎皮粉碎至100～200目，然后倒入5～8份60～80℃温水中浸泡2～3小时，接着300～500w超声波振荡处理50～70分钟，再加入1～2份无水乙醇，500～700w超声波振荡50～80分钟，旋蒸浓缩，干燥，即得。
[0016]
优选的，以重量份计，步骤(1)的具体方法为：先将100份无水乙醇、11～12份蒸馏水、1.7～1.9份质量浓度25～27％浓氨水混合搅匀，然后加入2.2～2.5份正硅酸乙酯，搅拌20～23小时，接着加入1.3～1.5份γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷，继续搅拌18～22小时，离心，无水乙醇洗涤，真空干燥，即得所述的纳米微球。
[0017]
进一步优选的，搅拌转速为300～500r/min。
[0018]
优选的，以重量份计，步骤(2)的具体方法为：先向10份质量浓度12～15％β-环糊精水溶液中缓慢匀速滴加1～2份质量浓度30～40％氢氧化钠溶液，滴加完毕后在22～25℃和2000～3000r/min条件下搅拌2～4小时，接着在冰水浴条件下缓慢匀速滴加45～50份质量浓度10～13％对甲苯磺酰氯乙腈溶液，滴加完毕后在22～25℃和600～800r/min条件下搅拌2～3小时，得到反应液；然后将1～2份纳米微球加入反应液中，加入0.5～0.8份冰醋酸，80～90℃和300～500r/min条件下搅拌反应18～22小时，后处理，即得所述的改性纳米微球。
[0019]
进一步优选的，在对甲苯磺酰氯乙腈溶液滴加完毕后先冰水浴静置25～35分钟，再搅拌反应。
[0020]
进一步优选的，氢氧化钠溶液、对甲苯磺酰氯乙腈溶液的滴加时间分别为30～40分钟、20～25分钟。
[0021]
进一步优选的，后处理的具体方法为：调节ph至中性，过滤，二甲基甲酰胺洗涤，真空干燥，即得所述的改性纳米微球。
[0022]
优选的，以重量份计，步骤(3)的具体方法为：先将1份橘橙指孢囊菌接种于pda培养基，26～28℃培养6～7天，产生分生孢子，然后用接种环将分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使得分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝，将孢子浓度调节至107～108cfu/ml，按照1～2％接种量(体积)接种到液体培养基中，26～28℃发酵培养2～3天，即得发酵液；最后向发酵液中加入2～3份毛大叶臭花椒提取物、1.2～1.8份苦皮藤提取物，搅拌混匀得到混合液。
[0023]
进一步优选的，所述pda培养基的配方为：土豆198～202g，葡萄糖10～12g，琼脂18～20g，na2hpo
4 4～6g，蒸馏水1000g，ph为7.0～7.5；所述液体培养基的配方为：麦麸5～6g，可溶性淀粉22～25g，硫酸铵2～3g，碳酸钙1～1.5g，磷酸氢二钾1～1.5g，蒸馏水1000g。
[0024]
优选的，步骤(4)中，混合液与改性纳米微球的质量比为10：0.8～1。
[0025]
优选的，步骤(4)的具体方法如下：
[0026]
(a)先在三聚磷酸钠的作用下，改性纳米微球与混合液混合搅拌，得到纳米粒和上清液；
[0027]
(b)然后向上清液中加入氯化钙，搅拌至完全溶解，接着边搅拌边加入海藻酸钠，搅拌得到悬浊液；
[0028]
(c)最后将纳米粒加入悬浊液中，在分散剂的作用下搅拌混匀，即得所述的生物杀虫剂。
[0029]
进一步优选的，步骤(a)的具体方法为：先将改性纳米微球加入混合液中，400～600r/min搅拌混匀，然后边搅拌边缓慢滴加质量浓度5～7％三聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后继续以400～600r/min搅拌30～50分钟，5000～6000r/min高速冷冻离心，即得纳米粒和上清液。
[0030]
更进一步优选的，三聚磷酸钠水溶液的用量为改性纳米微球重量的4～6％，其滴加时间为40～50分钟。
[0031]
进一步优选的，步骤(b)中，上清液、氯化钙和海藻酸钠的质量比为100：3～5：5～7。
[0032]
优选的，步骤(b)中，投料完毕后以200～300r/min搅拌3～5小时制成悬浊液。
[0033]
优选的，步骤(c)中，分散剂的用量为悬浊液重量的1～2％，搅拌速率为300～400r/min，搅拌时间为7～9小时。
[0034]
2、利用上述制备方法得到的基于纳米材料负载的生物杀虫剂。
[0035]
本发明的有益效果在于：
[0036]
本发明先以正硅酸乙酯和γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷为原料制备纳米微球；然后在纳米微球表面修饰环糊精，得到改性纳米微球；再将橘橙指孢囊菌培养得到发酵液，接着向发酵液中加入毛大叶臭花椒提取物、苦皮藤提取物，搅拌混匀得到混合液；最后将混合液利用改性纳米微球进行负载，得到一种生物杀虫剂，杀虫效果好，且具有较长的持效时间。
[0037]
其中，毛大叶臭花椒提取物是以毛大叶臭花椒的叶或果皮提取得到；苦皮藤提取物是以苦皮藤的根皮或茎皮提取得到；这两种植物提取物与橘橙指孢囊菌协同防治多种虫害，具有广泛适用性。苦皮藤提取物具有杀虫作用，毛大叶臭花椒提取物独特香气具有诱杀作用，结合橘橙指孢囊菌发酵产物、孢子等协同杀虫，强化杀虫效果。
[0038]
本发明以正硅酸乙酯和γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷为原料制备纳米微球，该纳米微球表面含有大量氨基，接着在纳米微球表面修饰环糊精，引入大量羟基，羟基与氨基之间形成氢键，改性纳米微球的孔隙更为丰富，对前述杀虫成分起到控释作用，延长持效时间。纳米尺寸促进杀虫剂的高效使用，避免药物损失，提高杀虫效果。
具体实施方式
[0039]
下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0040]
本发明涉及的橘橙指孢囊菌，atcc23491，购自上海复祥生物科技有限公司。
[0041]
实施例1：
[0042]
基于纳米材料负载的生物杀虫剂的制备方法，具体步骤如下：
[0043]
(1)先以正硅酸乙酯和γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷为原料制备纳米微球；
[0044]
(2)然后在纳米微球表面修饰环糊精，得到改性纳米微球；
[0045]
(3)再将橘橙指孢囊菌atcc23491培养得到发酵液，接着向发酵液中加入毛大叶臭
花椒提取物、苦皮藤提取物，搅拌混匀得到混合液；
[0046]
(4)最后将步骤(3)所得混合液利用步骤(2)所得改性纳米微球进行负载，即得所述的生物杀虫剂；
[0047]
其中，所述毛大叶臭花椒提取物是以毛大叶臭花椒的叶或果皮提取得到；所述苦皮藤提取物是以苦皮藤的根皮或茎皮提取得到。
[0048]
所述毛大叶臭花椒提取物的制备方法如下：先将1kg毛大叶臭花椒的叶或果皮粉碎至100目，然后倒入8kg 60℃温水中浸泡3小时，接着300w超声波振荡处理70分钟，再加入1kg无水乙醇，700w超声波振荡50分钟，旋蒸浓缩，干燥，即得。
[0049]
所述苦皮藤提取物的制备方法如下：先将1kg苦皮藤的根皮或茎皮粉碎至200目，然后倒入5kg 80℃温水中浸泡2小时，接着500w超声波振荡处理50分钟，再加入2kg无水乙醇，500w超声波振荡80分钟，旋蒸浓缩，干燥，即得。
[0050]
步骤(1)的具体方法为：先将100kg无水乙醇、11kg蒸馏水、1.9kg质量浓度25％浓氨水混合搅匀，然后加入2.5kg正硅酸乙酯，搅拌20小时，接着加入1.5份γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷，继续搅拌18小时，离心，无水乙醇洗涤，真空干燥，即得所述的纳米微球。其中，搅拌转速为500r/min。
[0051]
步骤(2)的具体方法为：先向10kg质量浓度12％β-环糊精水溶液中缓慢匀速滴加2kg质量浓度30％氢氧化钠溶液，滴加完毕后在25℃和2000r/min条件下搅拌4小时，接着在冰水浴条件下缓慢匀速滴加45kg质量浓度13％对甲苯磺酰氯乙腈溶液，滴加完毕后在22℃和800r/min条件下搅拌2小时，得到反应液；然后将2kg纳米微球加入反应液中，加入0.5kg冰醋酸，90℃和300r/min条件下搅拌反应22小时，后处理，即得所述的改性纳米微球。
[0052]
在对甲苯磺酰氯乙腈溶液滴加完毕后先冰水浴静置25分钟，再搅拌反应。氢氧化钠溶液、对甲苯磺酰氯乙腈溶液的滴加时间分别为40分钟、20分钟。后处理的具体方法为：调节ph至中性，过滤，二甲基甲酰胺洗涤，真空干燥，即得所述的改性纳米微球。
[0053]
步骤(3)的具体方法为：先将1kg橘橙指孢囊菌atcc23491接种于pda培养基，28℃培养6天，产生分生孢子，然后用接种环将分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使得分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝，将孢子浓度调节至108cfu/ml，按照1％接种量(体积)接种到液体培养基中，28℃发酵培养2天，即得发酵液；最后向发酵液中加入3kg毛大叶臭花椒提取物、1.2kg苦皮藤提取物，搅拌混匀得到混合液。
[0054]
所述pda培养基的配方为：土豆202g，葡萄糖10g，琼脂20g，na2hpo
4 4g，蒸馏水1000g，ph为7.5；所述液体培养基的配方为：麦麸5g，可溶性淀粉25g，硫酸铵2g，碳酸钙1.5g，磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000g。
[0055]
步骤(4)中，混合液与改性纳米微球的质量比为10：1。
[0056]
步骤(4)的具体方法如下：
[0057]
(a)先在三聚磷酸钠的作用下，改性纳米微球与混合液混合搅拌，得到纳米粒和上清液；
[0058]
(b)然后向上清液中加入氯化钙，搅拌至完全溶解，接着边搅拌边加入海藻酸钠，搅拌得到悬浊液；
[0059]
(c)最后将纳米粒加入悬浊液中，在分散剂的作用下搅拌混匀，即得所述的生物杀虫剂。
[0060]
步骤(a)的具体方法为：先将改性纳米微球加入混合液中，400r/min搅拌混匀，然后边搅拌边缓慢滴加质量浓度7％三聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后继续以400r/min搅拌50分钟，5000r/min高速冷冻离心，即得纳米粒和上清液。三聚磷酸钠水溶液的用量为改性纳米微球重量的6％，其滴加时间为40分钟。
[0061]
步骤(b)中，上清液、氯化钙和海藻酸钠的质量比为100：5：5。投料完毕后以300r/min搅拌3小时制成悬浊液。
[0062]
步骤(c)中，分散剂的用量为悬浊液重量的2％，搅拌速率为300r/min，搅拌时间为9小时。
[0063]
实施例2：
[0064]
基于纳米材料负载的生物杀虫剂的制备方法，具体步骤如下：
[0065]
(1)先以正硅酸乙酯和γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷为原料制备纳米微球；
[0066]
(2)然后在纳米微球表面修饰环糊精，得到改性纳米微球；
[0067]
(3)再将橘橙指孢囊菌atcc23491培养得到发酵液，接着向发酵液中加入毛大叶臭花椒提取物、苦皮藤提取物，搅拌混匀得到混合液；
[0068]
(4)最后将步骤(3)所得混合液利用步骤(2)所得改性纳米微球进行负载，即得所述的生物杀虫剂；
[0069]
其中，所述毛大叶臭花椒提取物是以毛大叶臭花椒的叶或果皮提取得到；所述苦皮藤提取物是以苦皮藤的根皮或茎皮提取得到。
[0070]
所述毛大叶臭花椒提取物的制备方法如下：先将1kg毛大叶臭花椒的叶或果皮粉碎至200目，然后倒入5kg 80℃温水中浸泡2小时，接着500w超声波振荡处理50分钟，再加入2kg无水乙醇，500w超声波振荡80分钟，旋蒸浓缩，干燥，即得。
[0071]
所述苦皮藤提取物的制备方法如下：先将1kg苦皮藤的根皮或茎皮粉碎至100目，然后倒入8kg 60℃温水中浸泡3小时，接着300w超声波振荡处理70分钟，再加入1kg无水乙醇，700w超声波振荡50分钟，旋蒸浓缩，干燥，即得。
[0072]
步骤(1)的具体方法为：先将100kg无水乙醇、12kg蒸馏水、1.7kg质量浓度27％浓氨水混合搅匀，然后加入2.2kg正硅酸乙酯，搅拌23小时，接着加入1.3份γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷，继续搅拌22小时，离心，无水乙醇洗涤，真空干燥，即得所述的纳米微球。其中，搅拌转速为300r/min。
[0073]
步骤(2)的具体方法为：先向10kg质量浓度15％β-环糊精水溶液中缓慢匀速滴加1kg质量浓度40％氢氧化钠溶液，滴加完毕后在22℃和3000r/min条件下搅拌2小时，接着在冰水浴条件下缓慢匀速滴加50kg质量浓度10％对甲苯磺酰氯乙腈溶液，滴加完毕后在25℃和600r/min条件下搅拌3小时，得到反应液；然后将1kg纳米微球加入反应液中，加入0.8kg冰醋酸，80℃和500r/min条件下搅拌反应18小时，后处理，即得所述的改性纳米微球。
[0074]
在对甲苯磺酰氯乙腈溶液滴加完毕后先冰水浴静置35分钟，再搅拌反应。氢氧化钠溶液、对甲苯磺酰氯乙腈溶液的滴加时间分别为30分钟、25分钟。后处理的具体方法为：调节ph至中性，过滤，二甲基甲酰胺洗涤，真空干燥，即得所述的改性纳米微球。
[0075]
步骤(3)的具体方法为：先将1kg橘橙指孢囊菌atcc23491接种于pda培养基，26℃培养7天，产生分生孢子，然后用接种环将分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使得分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝，将孢子浓度调节至107cfu/ml，按照
2％接种量(体积)接种到液体培养基中，26℃发酵培养3天，即得发酵液；最后向发酵液中加入2kg毛大叶臭花椒提取物、1.8kg苦皮藤提取物，搅拌混匀得到混合液。
[0076]
所述pda培养基的配方为：土豆198g，葡萄糖12g，琼脂18g，na2hpo
4 6g，蒸馏水1000g，ph为7.0；所述液体培养基的配方为：麦麸6g，可溶性淀粉22g，硫酸铵3g，碳酸钙1g，磷酸氢二钾1.5g，蒸馏水1000g。
[0077]
步骤(4)中，混合液与改性纳米微球的质量比为10：0.8。
[0078]
步骤(4)的具体方法如下：
[0079]
(a)先在三聚磷酸钠的作用下，改性纳米微球与混合液混合搅拌，得到纳米粒和上清液；
[0080]
(b)然后向上清液中加入氯化钙，搅拌至完全溶解，接着边搅拌边加入海藻酸钠，搅拌得到悬浊液；
[0081]
(c)最后将纳米粒加入悬浊液中，在分散剂的作用下搅拌混匀，即得所述的生物杀虫剂。
[0082]
步骤(a)的具体方法为：先将改性纳米微球加入混合液中，600r/min搅拌混匀，然后边搅拌边缓慢滴加质量浓度5％三聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后继续以600r/min搅拌30分钟，6000r/min高速冷冻离心，即得纳米粒和上清液。三聚磷酸钠水溶液的用量为改性纳米微球重量的4％，其滴加时间为50分钟。
[0083]
步骤(b)中，上清液、氯化钙和海藻酸钠的质量比为100：3：7。投料完毕后以200r/min搅拌5小时制成悬浊液。
[0084]
步骤(c)中，分散剂的用量为悬浊液重量的1％，搅拌速率为400r/min，搅拌时间为7小时。
[0085]
实施例3：
[0086]
基于纳米材料负载的生物杀虫剂的制备方法，具体步骤如下：
[0087]
(1)先以正硅酸乙酯和γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷为原料制备纳米微球；
[0088]
(2)然后在纳米微球表面修饰环糊精，得到改性纳米微球；
[0089]
(3)再将橘橙指孢囊菌atcc23491培养得到发酵液，接着向发酵液中加入毛大叶臭花椒提取物、苦皮藤提取物，搅拌混匀得到混合液；
[0090]
(4)最后将步骤(3)所得混合液利用步骤(2)所得改性纳米微球进行负载，即得所述的生物杀虫剂；
[0091]
其中，所述毛大叶臭花椒提取物是以毛大叶臭花椒的叶或果皮提取得到；所述苦皮藤提取物是以苦皮藤的根皮或茎皮提取得到。
[0092]
所述毛大叶臭花椒提取物的制备方法如下：先将1kg毛大叶臭花椒的叶或果皮粉碎至200目，然后倒入6kg 70℃温水中浸泡2.5小时，接着400w超声波振荡处理60分钟，再加入1.5kg无水乙醇，600w超声波振荡70分钟，旋蒸浓缩，干燥，即得。
[0093]
所述苦皮藤提取物的制备方法如下：先将1kg苦皮藤的根皮或茎皮粉碎至200目，然后倒入6kg 70℃温水中浸泡2.5小时，接着400w超声波振荡处理60分钟，再加入1.5kg无水乙醇，600w超声波振荡70分钟，旋蒸浓缩，干燥，即得。
[0094]
步骤(1)的具体方法为：先将100kg无水乙醇、11.5kg蒸馏水、1.8kg质量浓度26％浓氨水混合搅匀，然后加入2.4kg正硅酸乙酯，搅拌22小时，接着加入1.4份γ-氨乙基氨丙
基三甲氧基硅烷，继续搅拌20小时，离心，无水乙醇洗涤，真空干燥，即得所述的纳米微球。其中，搅拌转速为400r/min。
[0095]
步骤(2)的具体方法为：先向10kg质量浓度13％β-环糊精水溶液中缓慢匀速滴加1.5kg质量浓度35％氢氧化钠溶液，滴加完毕后在23℃和2500r/min条件下搅拌3小时，接着在冰水浴条件下缓慢匀速滴加48kg质量浓度11％对甲苯磺酰氯乙腈溶液，滴加完毕后在23℃和700r/min条件下搅拌2.5小时，得到反应液；然后将1.5kg纳米微球加入反应液中，加入0.6kg冰醋酸，85℃和400r/min条件下搅拌反应20小时，后处理，即得所述的改性纳米微球。
[0096]
在对甲苯磺酰氯乙腈溶液滴加完毕后先冰水浴静置30分钟，再搅拌反应。氢氧化钠溶液、对甲苯磺酰氯乙腈溶液的滴加时间分别为35分钟、22分钟。后处理的具体方法为：调节ph至中性，过滤，二甲基甲酰胺洗涤，真空干燥，即得所述的改性纳米微球。
[0097]
步骤(3)的具体方法为：先将1kg橘橙指孢囊菌atcc23491接种于pda培养基，27℃培养6天，产生分生孢子，然后用接种环将分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使得分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝，将孢子浓度调节至108cfu/ml，按照1.5％接种量(体积)接种到液体培养基中，27℃发酵培养3天，即得发酵液；最后向发酵液中加入2.5kg毛大叶臭花椒提取物、1.5kg苦皮藤提取物，搅拌混匀得到混合液。
[0098]
所述pda培养基的配方为：土豆200g，葡萄糖11g，琼脂19g，na2hpo
4 5g，蒸馏水1000g，ph为7.3；所述液体培养基的配方为：麦麸5.5g，可溶性淀粉24g，硫酸铵2.5g，碳酸钙1.2g，磷酸氢二钾1.2g，蒸馏水1000g。
[0099]
步骤(4)中，混合液与改性纳米微球的质量比为10：0.9。
[0100]
步骤(4)的具体方法如下：
[0101]
(a)先在三聚磷酸钠的作用下，改性纳米微球与混合液混合搅拌，得到纳米粒和上清液；
[0102]
(b)然后向上清液中加入氯化钙，搅拌至完全溶解，接着边搅拌边加入海藻酸钠，搅拌得到悬浊液；
[0103]
(c)最后将纳米粒加入悬浊液中，在分散剂的作用下搅拌混匀，即得所述的生物杀虫剂。
[0104]
步骤(a)的具体方法为：先将改性纳米微球加入混合液中，500r/min搅拌混匀，然后边搅拌边缓慢滴加质量浓度6％三聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后继续以500r/min搅拌40分钟，5500r/min高速冷冻离心，即得纳米粒和上清液。三聚磷酸钠水溶液的用量为改性纳米微球重量的5％，其滴加时间为45分钟。
[0105]
步骤(b)中，上清液、氯化钙和海藻酸钠的质量比为100：4：6。投料完毕后以250r/min搅拌4小时制成悬浊液。
[0106]
步骤(c)中，分散剂的用量为悬浊液重量的1.5％，搅拌速率为350r/min，搅拌时间为8小时。
[0107]
对比例1
[0108]
基于纳米材料负载的生物杀虫剂的制备方法，具体步骤如下：
[0109]
(1)先以正硅酸乙酯和γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷为原料制备纳米微球；
[0110]
(2)然后在纳米微球表面修饰环糊精，得到改性纳米微球；
[0111]
(3)再将橘橙指孢囊菌atcc23491培养得到发酵液，接着向发酵液中加入苦皮藤提
取物，搅拌混匀得到混合液；
[0112]
(4)最后将步骤(3)所得混合液利用步骤(2)所得改性纳米微球进行负载，即得所述的生物杀虫剂；
[0113]
其中，所述毛大叶臭花椒提取物是以毛大叶臭花椒的叶或果皮提取得到；所述苦皮藤提取物是以苦皮藤的根皮或茎皮提取得到。
[0114]
所述毛大叶臭花椒提取物的制备方法如下：先将1kg毛大叶臭花椒的叶或果皮粉碎至100目，然后倒入8kg 60℃温水中浸泡3小时，接着300w超声波振荡处理70分钟，再加入1kg无水乙醇，700w超声波振荡50分钟，旋蒸浓缩，干燥，即得。
[0115]
所述苦皮藤提取物的制备方法如下：先将1kg苦皮藤的根皮或茎皮粉碎至200目，然后倒入5kg 80℃温水中浸泡2小时，接着500w超声波振荡处理50分钟，再加入2kg无水乙醇，500w超声波振荡80分钟，旋蒸浓缩，干燥，即得。
[0116]
步骤(1)的具体方法为：先将100kg无水乙醇、11kg蒸馏水、1.9kg质量浓度25％浓氨水混合搅匀，然后加入2.5kg正硅酸乙酯，搅拌20小时，接着加入1.5份γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷，继续搅拌18小时，离心，无水乙醇洗涤，真空干燥，即得所述的纳米微球。其中，搅拌转速为500r/min。
[0117]
步骤(2)的具体方法为：先向10kg质量浓度12％β-环糊精水溶液中缓慢匀速滴加2kg质量浓度30％氢氧化钠溶液，滴加完毕后在25℃和2000r/min条件下搅拌4小时，接着在冰水浴条件下缓慢匀速滴加45kg质量浓度13％对甲苯磺酰氯乙腈溶液，滴加完毕后在22℃和800r/min条件下搅拌2小时，得到反应液；然后将2kg纳米微球加入反应液中，加入0.5kg冰醋酸，90℃和300r/min条件下搅拌反应22小时，后处理，即得所述的改性纳米微球。
[0118]
在对甲苯磺酰氯乙腈溶液滴加完毕后先冰水浴静置25分钟，再搅拌反应。氢氧化钠溶液、对甲苯磺酰氯乙腈溶液的滴加时间分别为40分钟、20分钟。后处理的具体方法为：调节ph至中性，过滤，二甲基甲酰胺洗涤，真空干燥，即得所述的改性纳米微球。
[0119]
步骤(3)的具体方法为：先将1kg橘橙指孢囊菌atcc23491接种于pda培养基，28℃培养6天，产生分生孢子，然后用接种环将分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使得分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝，将孢子浓度调节至108cfu/ml，按照1％接种量(体积)接种到液体培养基中，28℃发酵培养2天，即得发酵液；最后向发酵液中加入1.2kg苦皮藤提取物，搅拌混匀得到混合液。
[0120]
所述pda培养基的配方为：土豆202g，葡萄糖10g，琼脂20g，na2hpo
4 4g，蒸馏水1000g，ph为7.5；所述液体培养基的配方为：麦麸5g，可溶性淀粉25g，硫酸铵2g，碳酸钙1.5g，磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000g。
[0121]
步骤(4)中，混合液与改性纳米微球的质量比为10：1。
[0122]
步骤(4)的具体方法如下：
[0123]
(a)先在三聚磷酸钠的作用下，改性纳米微球与混合液混合搅拌，得到纳米粒和上清液；
[0124]
(b)然后向上清液中加入氯化钙，搅拌至完全溶解，接着边搅拌边加入海藻酸钠，搅拌得到悬浊液；
[0125]
(c)最后将纳米粒加入悬浊液中，在分散剂的作用下搅拌混匀，即得所述的生物杀虫剂。
[0126]
步骤(a)的具体方法为：先将改性纳米微球加入混合液中，400r/min搅拌混匀，然后边搅拌边缓慢滴加质量浓度7％三聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后继续以400r/min搅拌50分钟，5000r/min高速冷冻离心，即得纳米粒和上清液。三聚磷酸钠水溶液的用量为改性纳米微球重量的6％，其滴加时间为40分钟。
[0127]
步骤(b)中，上清液、氯化钙和海藻酸钠的质量比为100：5：5。投料完毕后以300r/min搅拌3小时制成悬浊液。
[0128]
步骤(c)中，分散剂的用量为悬浊液重量的2％，搅拌速率为300r/min，搅拌时间为9小时。
[0129]
对比例2
[0130]
基于纳米材料负载的生物杀虫剂的制备方法，具体步骤如下：
[0131]
(1)先以正硅酸乙酯和γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷为原料制备纳米微球；
[0132]
(2)然后在纳米微球表面修饰环糊精，得到改性纳米微球；
[0133]
(3)再向蒸馏水中加入毛大叶臭花椒提取物、苦皮藤提取物，搅拌混匀得到混合液；
[0134]
(4)最后将步骤(3)所得混合液利用步骤(2)所得改性纳米微球进行负载，即得所述的生物杀虫剂；
[0135]
其中，所述毛大叶臭花椒提取物是以毛大叶臭花椒的叶或果皮提取得到；所述苦皮藤提取物是以苦皮藤的根皮或茎皮提取得到。
[0136]
所述毛大叶臭花椒提取物的制备方法如下：先将1kg毛大叶臭花椒的叶或果皮粉碎至100目，然后倒入8kg 60℃温水中浸泡3小时，接着300w超声波振荡处理70分钟，再加入1kg无水乙醇，700w超声波振荡50分钟，旋蒸浓缩，干燥，即得。
[0137]
所述苦皮藤提取物的制备方法如下：先将1kg苦皮藤的根皮或茎皮粉碎至200目，然后倒入5kg 80℃温水中浸泡2小时，接着500w超声波振荡处理50分钟，再加入2kg无水乙醇，500w超声波振荡80分钟，旋蒸浓缩，干燥，即得。
[0138]
步骤(1)的具体方法为：先将100kg无水乙醇、11kg蒸馏水、1.9kg质量浓度25％浓氨水混合搅匀，然后加入2.5kg正硅酸乙酯，搅拌20小时，接着加入1.5份γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷，继续搅拌18小时，离心，无水乙醇洗涤，真空干燥，即得所述的纳米微球。其中，搅拌转速为500r/min。
[0139]
步骤(2)的具体方法为：先向10kg质量浓度12％β-环糊精水溶液中缓慢匀速滴加2kg质量浓度30％氢氧化钠溶液，滴加完毕后在25℃和2000r/min条件下搅拌4小时，接着在冰水浴条件下缓慢匀速滴加45kg质量浓度13％对甲苯磺酰氯乙腈溶液，滴加完毕后在22℃和800r/min条件下搅拌2小时，得到反应液；然后将2kg纳米微球加入反应液中，加入0.5kg冰醋酸，90℃和300r/min条件下搅拌反应22小时，后处理，即得所述的改性纳米微球。
[0140]
在对甲苯磺酰氯乙腈溶液滴加完毕后先冰水浴静置25分钟，再搅拌反应。氢氧化钠溶液、对甲苯磺酰氯乙腈溶液的滴加时间分别为40分钟、20分钟。后处理的具体方法为：调节ph至中性，过滤，二甲基甲酰胺洗涤，真空干燥，即得所述的改性纳米微球。
[0141]
步骤(3)的具体方法为：向10kg水中加入3kg毛大叶臭花椒提取物、1.2kg苦皮藤提取物，搅拌混匀得到混合液。
[0142]
步骤(4)中，混合液与改性纳米微球的质量比为10：1。
[0143]
步骤(4)的具体方法如下：
[0144]
(a)先在三聚磷酸钠的作用下，改性纳米微球与混合液混合搅拌，得到纳米粒和上清液；
[0145]
(b)然后向上清液中加入氯化钙，搅拌至完全溶解，接着边搅拌边加入海藻酸钠，搅拌得到悬浊液；
[0146]
(c)最后将纳米粒加入悬浊液中，在分散剂的作用下搅拌混匀，即得所述的生物杀虫剂。
[0147]
步骤(a)的具体方法为：先将改性纳米微球加入混合液中，400r/min搅拌混匀，然后边搅拌边缓慢滴加质量浓度7％三聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后继续以400r/min搅拌50分钟，5000r/min高速冷冻离心，即得纳米粒和上清液。三聚磷酸钠水溶液的用量为改性纳米微球重量的6％，其滴加时间为40分钟。
[0148]
步骤(b)中，上清液、氯化钙和海藻酸钠的质量比为100：5：5。投料完毕后以300r/min搅拌3小时制成悬浊液。
[0149]
步骤(c)中，分散剂的用量为悬浊液重量的2％，搅拌速率为300r/min，搅拌时间为9小时。
[0150]
对比例3
[0151]
基于纳米材料负载的生物杀虫剂的制备方法，具体步骤如下：
[0152]
(1)先以正硅酸乙酯和γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷为原料制备纳米微球；
[0153]
(2)再将橘橙指孢囊菌atcc23491培养得到发酵液，接着向发酵液中加入毛大叶臭花椒提取物、苦皮藤提取物，搅拌混匀得到混合液；
[0154]
(3)最后将步骤(2)所得混合液利用步骤(1)所得纳米微球进行负载，即得所述的生物杀虫剂；
[0155]
其中，所述毛大叶臭花椒提取物是以毛大叶臭花椒的叶或果皮提取得到；所述苦皮藤提取物是以苦皮藤的根皮或茎皮提取得到。
[0156]
所述毛大叶臭花椒提取物的制备方法如下：先将1kg毛大叶臭花椒的叶或果皮粉碎至100目，然后倒入8kg 60℃温水中浸泡3小时，接着300w超声波振荡处理70分钟，再加入1kg无水乙醇，700w超声波振荡50分钟，旋蒸浓缩，干燥，即得。
[0157]
所述苦皮藤提取物的制备方法如下：先将1kg苦皮藤的根皮或茎皮粉碎至200目，然后倒入5kg 80℃温水中浸泡2小时，接着500w超声波振荡处理50分钟，再加入2kg无水乙醇，500w超声波振荡80分钟，旋蒸浓缩，干燥，即得。
[0158]
步骤(1)的具体方法为：先将100kg无水乙醇、11kg蒸馏水、1.9kg质量浓度25％浓氨水混合搅匀，然后加入2.5kg正硅酸乙酯，搅拌20小时，接着加入1.5份γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷，继续搅拌18小时，离心，无水乙醇洗涤，真空干燥，即得所述的纳米微球。其中，搅拌转速为500r/min。
[0159]
步骤(2)的具体方法为：先将1kg橘橙指孢囊菌atcc23491接种于pda培养基，28℃培养6天，产生分生孢子，然后用接种环将分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使得分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝，将孢子浓度调节至108cfu/ml，按照1％接种量(体积)接种到液体培养基中，28℃发酵培养2天，即得发酵液；最后向发酵液中加入3kg毛大叶臭花椒提取物、1.2kg苦皮藤提取物，搅拌混匀得到混合液。
[0160]
所述pda培养基的配方为：土豆202g，葡萄糖10g，琼脂20g，na2hpo
4 4g，蒸馏水1000g，ph为7.5；所述液体培养基的配方为：麦麸5g，可溶性淀粉25g，硫酸铵2g，碳酸钙1.5g，磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000g。
[0161]
步骤(3)中，混合液与纳米微球的质量比为10：1。
[0162]
步骤(3)的具体方法如下：
[0163]
(a)先在三聚磷酸钠的作用下，纳米微球与混合液混合搅拌，得到纳米粒和上清液；
[0164]
(b)然后向上清液中加入氯化钙，搅拌至完全溶解，接着边搅拌边加入海藻酸钠，搅拌得到悬浊液；
[0165]
(c)最后将纳米粒加入悬浊液中，在分散剂的作用下搅拌混匀，即得所述的生物杀虫剂。
[0166]
步骤(a)的具体方法为：先将纳米微球加入混合液中，400r/min搅拌混匀，然后边搅拌边缓慢滴加质量浓度7％三聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后继续以400r/min搅拌50分钟，5000r/min高速冷冻离心，即得纳米粒和上清液。三聚磷酸钠水溶液的用量为改性纳米微球重量的6％，其滴加时间为40分钟。
[0167]
步骤(b)中，上清液、氯化钙和海藻酸钠的质量比为100：5：5。投料完毕后以300r/min搅拌3小时制成悬浊液。
[0168]
步骤(c)中，分散剂的用量为悬浊液重量的2％，搅拌速率为300r/min，搅拌时间为9小时。
[0169]
试验例
[0170]
实施例1～3和对比例1～3所得生物杀虫剂，各取1g，分别用1kg水稀释，搅拌溶解，得到药液，进行杀虫率比较。
[0171]
其中，供试害虫包括：粘虫、白粉虱、蚧壳虫，均为田间采集而得；具体实验方法是将药液均匀喷洒于害虫体表，喷洒量为10ml，清水作为对照组，每组害虫初始数量为100个，每12小时再次补充100个，直至试验结束。喷药后6小时、1天、3天考察死亡率(考察时间新补充害虫不计入死亡率计算，即死亡害虫在刨除新补充害虫的害虫总数中的百分占比)，结果见表1。
[0172]
表1.害虫死亡率比较
[0173][0174]
由表1可知，实施例1～3所得生物杀虫剂对粘虫、白粉虱、蚧壳虫在喷药后6小时即可百分百杀灭，杀虫率高，且在3天后仍具有较高的杀虫率，持效时间长。
[0175]
对比例1略去毛大叶臭花椒提取物，对比例2略去橘橙指孢囊菌atcc23491，对比例3略去步骤(2)，产品的杀虫效果明显变差，对比例3的持效时间明显变短。说明毛大叶臭花椒提取物、苦皮藤提取物、橘橙指孢囊菌atcc23491协同起到杀虫作用，纳米材料直接影响
杀虫效果和持效时间长短。
[0176]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。