[0001]
本发明属于农业生物育种技术领域，具体涉及一种猪冷冻精液稀释液配方。
背景技术：
[0002]
过去几十年来由于大量国外猪种的引入和大规模饲养，导致我国地方猪品种数量锐减，而且品种内血统数也在不断减少，遗传多样性降低，使很多地方猪品种濒临灭绝。近年来随着保护地方品种资源的意识提高，开始采取多种措施对地方猪品种进行保护，而对公猪精液进行冷冻保存，则是一种方便有效的保存手段。冷冻精液是生物安全系数更高的精液来源。可在闲时储备，平衡供需。因为鲜精保存时间短，在旺季时供不应求，但在闲时却产能过剩导致闲置浪费。冷冻精液可以把合格的精液全部冻存，把不合格的精液及时清除，提高精液质量，平衡淡旺季的需求，也可以随时进行跨区域调配，平衡不同生产区域的需求，具有便捷运输的优点。也可以节约成本增加成效，降低公畜的饲养存栏量。冻精集成技术可以提高种公畜的利用率接近100 %，大幅减少种公畜的饲养存栏数量，节约场地建设、饲养管理成本等，还可以减少建设用地，减少粪污排放，缓解环保的压力。同样也是保种育种的重要手段。冷冻精液具有可长期保存的特点，可以延长种公畜遗传物质的使用时间，不受种公畜死亡等限制，在保留和恢复精液供应、血统更新、引种等方面均有重要意义，一直是保种育种的重要手段。
[0003]
20世纪80年代后期我国大量引进国外品种猪后，为追求高产肉量和短期经济效益，养猪户纷纷转向养殖外来品种猪，地方猪的饲养数量急剧下降。现阶段，猪精液的冷冻制作及保存关键技术研究受到了全球养猪业重视和关注，我国猪冷冻精液的研究虽然在技术上已经取得了一定的突破，但是也有很多研究报道了猪特别是地方猪品种的冷冻精液制作在技术上还有待进一步完善。由于地方猪品种精子的生物学特性，其精液冷冻制作技术要求不完全与商业猪的冷冻精液制作技术相同，主要是地方猪品种的精子在冷冻、解冻过程中更容易受到损伤。
[0004]
因此，深入系统地研究猪精液冷冻机理和生产过程的关键技术，探讨影响猪冻精活力及受精能力的因素，进一步改进猪精液冷冻技术及操作方法，已成为猪育种的关键技术问题，尤其是国内地方种猪育种生产中渴望解决的急迫问题。
技术实现要素：
[0005]
本发明的目的是提供一种猪冷冻精液基础稀释液配方及其制备方法，另一目的是提供该配方具体应用，以弥补现有技术的不足。
[0006]
为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：一种猪冷冻精液基础稀释液，包括葡萄糖、柠檬酸、胆固醇、l-脯氨酸、tris和双蒸馏水。
[0007]
进一步的，所述胆固醇优选为猪肝脏来源胆固醇。
[0008]
进一步的，所述猪冷冻精液基础稀释液，包括葡萄糖15.98
±
0.5 g/l、柠檬酸
19.67
±
0.5 g/l、胆固醇4.83
±
0.2 g/l、l-脯氨酸3.45
±
0.2 g/l、tris 35.2
±
0.5 g/l和双蒸馏水 1 l。
[0009]
一种猪冷冻精液冻存液中，除上述猪冷冻精液基础稀释液外，还包括以体积分数计，20% 新鲜卵黄、1
×
10
6 iu/l青霉素、1
×
10
6 iu/l链霉素和3%-4%甘油和1%-2% equex.stm。
[0010]
一种猪保鲜精稀释液中，除上述猪冷冻精液基础稀释液外，还包括等渗脱脂牛奶，添加等渗脱脂牛奶的量与猪冷冻精液基础稀释液体积比为1：1，再利用0.22 um的滤菌膜过滤。
[0011]
进一步的，所述等渗脱脂牛奶为市面上流通的脱脂牛奶即可。
[0012]
上述猪冷冻精液基础稀释液的制备方法为：称取葡萄糖、柠檬酸、tris，猪肝脏来源胆固醇、 l-脯氨酸，双蒸馏水，将它们放入烧杯内混合，加热，使上述物质完全溶解并降温。
[0013]
上述猪冷冻精液冻存液的制备方法包括：首先称取葡萄糖、柠檬酸、tris，猪肝脏来源胆固醇、 l-脯氨酸，双蒸馏水，将它们放入烧杯内混合，加热，使上述物质完全溶解并降温后，再取该稀释液加入新鲜卵黄、青霉素、链霉素，混匀后降温，静置沉淀存放, 取上清液离心后，去掉离心后稀释液的表面油膜并加入甘油、equex.stm抗冻剂，即为冻存液。
[0014]
进一步的，上述制备方法中，混匀后降温至4℃，静置沉淀存放8 h
ꢀ-
12h, 该步骤能都将蛋黄中固态杂质充分沉降；取上清液3850 rpm
-ꢀ
4000 rpm离心90min后使用5ml移液器吸除表面油性杂质，此步骤能够将蛋黄中油性杂质彻底分离至稀释液的表面。
[0015]
上述猪保鲜精稀释液的制备方法为：称取葡萄糖、柠檬酸、tris，猪肝脏来源胆固醇、 l-脯氨酸、双蒸馏水，放入烧杯内混合，加热至98 ℃，使上述物质完全溶解并降温至35 ℃后与等渗脱脂牛奶体积比1:1混合即制成猪保鲜精稀释液。
[0016]
利用上述猪冷冻精液基础稀释液进行猪冷冻精液制备的方法，包括以下步骤：（1）采精：采取猪中段精液并用滤纸过滤；采精的同时进行密度测定，原精密度小于1亿/ml的精液直接淘汰，大于1亿/ml的精液进行稀释调整；（2）稀释：步骤（1）采取的精液与所述猪保鲜精稀释液体积比1：1混合，后于17℃平衡，猪保鲜精稀释液提供充足的能源与营养物质，能最大程度的保持精子活力；（3）离心悬浮：将步骤（2）得到的混合精液稀释液进行离心，弃上清，再往沉淀里加入所述猪冷冻精液冻存液，静置10-15 min，使活力较好的精子上浮，以进一步淘汰活力不好的精子和死精；（4）灌装；（5）冷藏平衡：灌装后的精液放入4 ℃平衡柜内平衡3-4 h，以增加其稳定性，为冷冻做准备；（6）冷冻：平衡结束后，先测活力（≥90%）然后进行冷冻，使用冷冻曲线冷冻。
[0017]
进一步的，所述步骤（2）后，还包括分析精子活力：混加稀释液的精液先轻轻混匀后再测活力，活力较差的直接舍弃，以达到运输后精子活力在90%以上的效果。
[0018]
进一步的，所述步骤（3）中，离心条件为：转速为1850 rpm，时间为10 min。
[0019]
进一步的，所述步骤（6）中使用冷冻曲线冷冻过程，不可过度偏移；所述冷冻曲线为开始温度5℃，-6℃ 200秒，-6℃ 60秒，-100℃ 160秒，-140℃ 80秒，-140℃ 180秒。
[0020]
基于上述猪冷冻精液的解冻方法为：将冷冻的精液于37 ℃下水浴20 s，之后孵育10 min，再检测其活力。
[0021]
上述猪冷冻精液基础稀释液，以及基于该稀释液配置的冻存液和保鲜精稀释液，能够应用于猪冷冻精液的制备，尤其是应用于中国地方品种猪的冷冻精液制备。
[0022]
当然，适用于地方品种猪的精液冷冻技术也适用于进口品种猪及其他品种猪的精液冷冻技术。
[0023]
本发明的优点和技术效果：本发明能有效维持地方品种猪鲜精在长途运输过程中的存活率（存活率可达95%以上），并通过加入猪肝脏来源胆固醇、 l-脯氨酸以及抗冻剂equex.stm防止或显著降低猪精子在冷冻过程中的损害；且通过有效的解冻方法，操作方便，提高精子活力与质量（解冻后活力最高可达90%）。
[0024]
本发明精液稀释液、冻存液等配置简单，方法操作方便，成本较低，能够得到高质量的猪冷冻精液。
具体实施方式
[0025]
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0026]
实施例1：一种猪冷冻精液基础稀释液的制备方法为：称取葡萄糖、柠檬酸、tris，猪肝脏来源胆固醇、 l-脯氨酸，双蒸馏水，将它们放入烧杯内混合，加热，使上述物质完全溶解并降温。
[0027]
可以称取葡萄糖1.598g、柠檬酸1.967g、tris 3.52g，猪肝脏来源胆固醇 0.483g、 l-脯氨酸0.345g，双蒸馏水100ml。
[0028]
一种猪冷冻精液冻存液的制备方法包括：首先称取葡萄糖、柠檬酸、tris，猪肝脏来源胆固醇、 l-脯氨酸，双蒸馏水，将它们放入烧杯内混合，加热，使上述物质完全溶解并降温后，再取该稀释液加入20%新鲜卵黄、青霉素、链霉素，混匀后降温至4℃，静置沉淀存放12h, 取上清液3850 rpm离心90min，再取离心后的上清液并加入4%的甘油和1 %的equex.stm（nova chemical sales, scituate, ma, usa）抗冻剂，即为冻存液。
[0029]
一种猪保鲜精稀释液的制备方法为：称取葡萄糖、柠檬酸、tris，猪肝脏来源胆固醇、 l-脯氨酸、双蒸馏水，放入烧杯内混合，加热至98 ℃，使上述物质完全溶解并降温至35 ℃后与脱脂牛奶体积比1:1混合即制成猪保鲜精稀释液。
[0030]
利用上述猪冷冻精液基础稀释液进行猪冷冻精液制备的方法，包括以下步骤：（1）采精：采取猪中段精液并用滤纸过滤；采精的同时进行密度测定，原精密度小于1亿/ml的精液直接淘汰，大于1亿/ml的精液进行稀释调整；（2）稀释：步骤（1）采取的精液与所述猪保鲜精稀释液体积比1：1混合，后于17℃平衡，保鲜精稀释液提供充足的能源与营养物质，能最大程度的保持精子活力；混加稀释液的精液先轻轻混匀后再测活力，活力较差的直接舍弃，以达到运输后精子活力在90%以上的效果；（3）离心悬浮：将步骤（2）得到的混合稀释液进行离心（转速为1850 rpm，时间为10 min），弃上清，再往沉淀里加入所述冻存液，静置10-15 min，使精子上浮，以进一步淘汰活力不好的精子和死精；
（4）
ꢀꢀꢀꢀ
灌装；（5）
ꢀꢀꢀꢀ
冷藏平衡：灌装后的精液放入4 ℃平衡柜内平衡3-4 h，以增加其稳定性，为冷冻做准备；（6）冷冻：平衡结束后，先测活力（≥90%）然后开始冷冻；使用冷冻曲线冷冻过程，不可过度偏移；所述冷冻曲线为开始温度5℃，-6℃ 200秒，-6℃ 60秒，-100℃ 160秒，-140℃ 80秒，-140℃ 180秒。
[0031]
基于上述猪冷冻精液的解冻方法为：将冷冻的精液于37 ℃下水浴20 s，之后孵育10 min，再检测解冻后的精子活力。
[0032]
实施例2：该实施例中所用地方猪品种为莱芜黑猪、大蒲莲猪和里岔黑猪。
[0033]
以实施例1的猪冷冻精液冻存液、保鲜精稀释液，及其制备方法为基础进行实验。
[0034]
1、制备猪冷冻精液冻存液采精的前一天要配好卵黄液，根据第二天所采的动物头数进行预估，一头地方品种猪一次射精大概能做200-300支0.5 ml细管的冻精。以猪冷冻精液基础稀释液为基础配置冻存液（具体见实施例1）。
[0035]
2、制备保鲜精稀释液采精的前一天要配好保鲜精稀释液，以猪冷冻精液基础稀释液为基础(葡萄糖1.598g、柠檬酸1.967g、tris 3.52g、猪肝脏来源胆固醇 0.483g、 l-脯氨酸0.345g，双蒸馏水100ml，将它们放入到一个合适烧杯内，加热至98 ℃，使上述物质完全溶解并降温至35 ℃后与等渗脱脂牛奶1:1混合即制成保鲜精稀释液)，需要精液和保鲜精稀释液体积比1：1混合使用，通常在配好稀释液之后将其用0.22 um的滤菌膜过滤，避免杂质影响精子的活力。
[0036]
3、采精与稀释采精 (注意采精频率，1周采2-3次，隔2-3天采一次)，一般取中段精液，采精后需要用滤纸过滤，17℃平衡25-30 min，与保鲜精稀释液1：1混合（与鲜精同时17℃平衡），17℃运输( 3-4 h)。
[0037]
4、密度测定和分析精子活力采精同时采2-3 ml原精，到达冻精生产车间需首先用全自动精子密度测定仪测原精的密度，混匀原精液，吸取中段的精液进行测定，原精密度小于1亿/ml的精液直接淘汰，大于1亿/ml的精液需要进行密度的稀释调整。
[0038]
用相衬显微镜自动分析软件结合显微镜分析精子活力，加了稀释液的精液先轻轻混匀后测活力，载玻片和盖玻片要事先预热，防止温度过低刺激精子，运输后精子活力可达到95%以上。
[0039]
5、离心悬浮设置离心机转速为1850 rpm，时间为10 min，进行离心。离心之后吸去上清，再往沉淀里加入5-6 ml冻存液，静置10-15 min，使精子上浮。
[0040]
6、卵黄稀释将同一品种上浮的精子混合在灭菌之后的50 ml离心管内，在显微镜下观察活力状态并调整其密度(1 亿/毫升)，如密度太大加冻存液稀释。处理好的精液要在离心管上标记好品种编号，避免和其它的混合。
[0041]
7、全自动灌装打印密度调整好的精液要在全自动灌装打印机上进行分装打印(0.5 ml细管)，进行品种号和耳号打印，细管上印有品种号，日期和动物耳号。
[0042]
8、细管上架将灌装好的同一品种和耳号的细管，摆放至细管架上，注意不同品种和耳号的细管要分开上架。
[0043]
9、冷藏平衡在灌装打印的时候，每一个品种和耳号之后都要预留1-2支细管放入盘子中，便于平衡后活力的检测。放入4 ℃平衡柜内平衡3-4 h。
[0044]
10、全自动程序冷冻10.1开始冷冻前先准备好液氮罐、提桶、泡沫盒子、拇指管、无菌纱布袋(长约15 cm,宽约5 cm)细线、镊子、标签纸以及剪刀等，将提桶放入泡沫盒子装满液氮备用。
[0045]
10.2平衡结束后先测活力（≥90%）然后开始冷冻，按照前述冷冻曲线，将0.5 ml细管由平衡柜取出放入冻精柜，大约需要冷冻10 min，冷冻过程需要按照冷冻曲线走，不可过度偏移。
[0046]
10.3冷冻结束后将细管快速放置。
[0047]
11、装管将0.5 ml细管装至拇指管内，再将拇指管装入无菌纱布袋内，每袋十根，两袋一系绑绳子，袋子和标签纸上都应标注好信息(品种编号，动物耳号，准确支数，日期，单位名称)，标签纸贴在绳子末端往上30-40 cm处，放入液氮罐中，用提桶按压样品，使其完全浸没在液氮中。
[0048]
12、测活力每周都会将当周做的冻精再检测一遍活力，观察活力是否达标，若有不达标的及时淘汰。分罐出库时将再测一遍活力，以确保精液品质合格。
[0049]
解冻方法：经过多次反复实验，最终确定解冻方法为将细管在37 ℃下水浴20 s，之后剪开细管在离心管中孵育10 min，之后检测其活力。
[0050]
结果分析：使用本发明的猪冷冻精液基础稀释液、冻存液等配方，及本发明提供的流程制作的猪细管冻精为实验组，使用市场现有的猪细管冻精制作试剂盒制作的猪细管冻精为对照组，解冻后实验组和对照组的数据比较如下：表1 猪(里岔黑猪)细管冻精解冻效果对比
组别实验次数原精活力解冻后平均活力解冻后平均畸形率对照组100≥90%48.69
±
3.21%16.29
±
4.18%实验组（里岔黑猪）100≥90%80.35
±
4.07
aa
%13.87
±
2.65%
注：实验组上标a与对照组比较差异显著，上标aa与对照组比较差异极其显著，无上标表示实验组与对照组之间差异不显著。
[0051]
表2 猪(莱芜黑猪)细管冻精解冻效果对比
组别实验次数原精活力解冻后平均活力解冻后平均畸形率
对照组100≥90%35.87
±
3.42%18.31
±
3.98%实验组（莱芜黑猪）100≥90%78.72
±
2.13
aa
%14.19
±
1.13%
注：实验组上标a与对照组比较差异显著，上标aa与对照组比较差异极其显著，无上标表示实验组与对照组之间差异不显著。
[0052]
表3 猪(大蒲莲猪)细管冻精解冻效果对比
组别实验次数原精活力解冻后平均活力解冻后平均畸形率对照组100≥85%28.71
±
4.05%13.87
±
3.06%实验组（大蒲莲猪）100≥85%75.35
±
5.76
aa
%15.90
±
3.11%
注：实验组上标a与对照组比较差异显著，上标aa与对照组比较差异极其显著，无上标表示实验组与对照组之间差异不显著。
[0053]
由表1-3实验结果表明，地方品种（里岔黑猪）细管冻精解冻活力实验组与对照组差异极显著，且另外两个地方品种（莱芜黑猪和大蒲莲猪）结果与里岔黑猪实验结果一致。
[0054]
用本发明的保鲜精稀释液运输猪鲜精为实验组，使用市场现有的猪鲜精稀释液运输猪鲜精为对照组，3-4小时长途运输后实验组和对照组的鲜精活力数据比较如下：表4 猪(里岔黑猪)鲜精长途运输效果对比
组别实验次数原精活力运输后平均活力运输后平均畸形率对照组30≥90%69.32
±
2.01%3.19
±
1.28%实验组（里岔黑猪）30≥90%93.25
±
2.87
aa
%2.14
±
0.93%
注：实验组上标a与对照组比较差异显著，上标aa与对照组比较差异极其显著，无上标表示实验组与对照组之间差异不显著。
[0055]
表5 猪(莱芜黑猪)鲜精长途运输效果对比
组别实验次数原精活力运输后平均活力运输后平均畸形率对照组30≥90%71.90
±
4.11%5.51
±
0.63%实验组（莱芜黑猪）30≥90%90.09
±
5.71
aa
%6.45
±
1.07%
注：实验组上标a与对照组比较差异显著，上标aa与对照组比较差异极其显著，无上标表示实验组与对照组之间差异不显著。
[0056]
表6 猪(大蒲莲猪)鲜精长途运输效果对比
组别实验次数原精活力运输后平均活力运输后平均畸形率对照组30≥85%59.31
±
4.31%5.73
±
1.14%实验组（大蒲莲猪）30≥85%90.25
±
5.76
aa
%6.89
±
0.36%
注：实验组上标a与对照组比较差异显著，上标aa与对照组比较差异极其显著，无上标表示实验组与对照组之间差异不显著。
[0057]
由表4-6实验结果表明，地方品种（里岔黑猪）鲜精长途运输实验组与对照组差异极显著，且另外两个地方品种（莱芜黑猪和大蒲莲猪）结果与里岔黑猪实验结果一致。
[0058]
上述实验结果分析可得，本发明提供的猪冷冻精液基础稀释液、猪冷冻精液冻存液、猪保鲜精稀释液，以及猪冷冻精液制备和解冻方法，与现有技术相比，能够显著提高猪精液的活力，显著降低精液畸形率，即本发明能够有效提高猪冷冻精液的质量。