一种苦荞芽苗提取物的应用的制作方法

本发明涉及茶树疾病防治
技术领域：
，特别是一种苦荞芽苗提取物的应用。
背景技术：
：茶树炭疽病在我国各产茶区均有发生，主要为害当年生成叶，病健组织分界明显，病斑大小常以中脉为界。病原称茶盘长孢，属半知菌亚门真菌。除危害茶树外，还危害油茶、山茶、茶梅等。茶树炭疽病的症状是：主要危害当年生成叶，老叶和嫩叶发病较少。先在叶尖或叶片边缘产生水渍状浅绿色至暗绿色病斑，后沿叶脉扩展为半透明黄褐色不规则病斑，边缘浸润性逐渐扩大，后期由褐色变为灰青色，病健组织分界明显，病斑大小常以中脉为界。病部生出黑色小粒点，即病原菌的子实体分生孢子盘。早春老叶上有病斑，多是越冬后期病斑。茶树炭疽病的病原是：gloeosporiumtheaesinesismiyake称茶盘长孢，属半知菌亚门真菌。分生孢子盘底部平坦略薄，形成子座，初埋生在表皮下面，后露出。分生孢子盘圆形，黑色，大小80—150um，分生孢子梗丝状，单胞无色，大小10—20×1.5—2(um)，顶生分生孢子1个。分生孢子单胞，两端尖，纺锤形，大小3—6×2.5(um)，两端各具油球1个。病菌生长适温25—27℃，最适ph5.3。目前对茶树炭疽病已经有多种有效防治方法。常用的方法是：茶树新梢一芽一叶期喷洒50％苯菌灵可湿性粉剂1500倍液或36％甲基硫菌灵悬浮剂600倍液、25％炭特灵可湿性粉剂600倍液、75％百菌清可湿性粉剂800倍液、40％百菌清悬浮剂(顺天星1号)600倍液(北京顺义县农药厂)。或是非采茶期喷洒12％绿乳铜乳油600倍液或30％绿得保悬浮剂400一500倍液、47％加瑞农可湿性粉剂800倍液、0.7％石灰半量式波尔多液。但是随着环境的恶化和致病菌耐药性的增强，使农药防病效果极大降低，无法从根本上预防与控制茶炭疽病。而且，茶农对农药认识不够而存在滥用、错用农药，导致茶叶农药残留超标等问题。然而，茶叶是人们直接的饮品，其质量安全保证尤为重要。因此，探索行之有效的绿色防控技术，以有效控制和降低茶炭疽病的发生和流行，并治理茶树疽病的抗药性很有意义。苦荞作为一种生态特色食品，是中国古老的栽培作物之一。其籽粒、根、茎、花叶含有丰富的生物类黄酮，如芦丁、槲皮素、槲皮素-3-葡萄糖、牡荆素、表儿茶素等，具有扩张冠状血管和降低血管脆性、止咳、平喘、祛痰等防病治病作用。另外苦荞籽粒中含有丰富的矿物质和维生素c，具有保肝、补肾造血及增加免疫功能作用。经试验验证，苦荞萌发后营养价值大幅提高，特别是黄酮类物质的含量有明显的提高，但现阶段苦荞制品主要集中于对苦荞籽粒的开发利用，而对于营养价值更高的苦荞芽苗研究报道较少。研究发现，荞麦黄酮类物质具有杀菌、消炎的作用，因而对植物真菌性病害具有潜在的应用效果，但目前尚未发现有将苦荞及其相关提取物用于防治茶树炭疽病的研究或报道。技术实现要素：本发明的目的在于，提供一种苦荞芽苗提取物的应用。本发明提出的将苦荞芽苗提取物用于防治茶树炭疽病可有效降低茶树的茶树炭疽病发病率，可降低70％左右的发病率；并且本发明给出了苦荞芽苗提取物的制备方法，不仅制备方法简单，所得苦荞芽苗提取物也有抑菌效果好的优点。本发明的技术方案：一种苦荞芽苗提取物的应用，将苦荞芽苗提取物用于防治茶树炭疽病。前述的苦荞芽苗提取物的应用中，在5-6月份及9-10月份均匀喷施用水稀释10-200倍的苦荞芽苗提取物于茶树叶片和枝条上用于防治茶树炭疽病。前述的苦荞芽苗提取物的应用中，所述用水稀释10-200倍的苦荞芽苗提取物是稀释50倍。前述的苦荞芽苗提取物的应用中，所述喷施是在晴天清晨或傍晚进行，每隔5～7天喷施一次，喷施4～6次。前述的苦荞芽苗提取物的应用中，所述苦荞芽苗提取物的制备方法包括如下步骤：(1)萌发苦荞芽苗；萌发苦荞芽苗步骤包括：选种，清洗，浸种，催芽培养，采收；(2)提取苦荞芽苗提取物；提取步骤包括：称取萌发苦荞芽苗，加乙醇浸泡，回流提取，合并滤液，残渣用乙醇洗至无色后一并纳入滤液，减压浓缩至浸膏，甲醇溶解，即得。前述的苦荞芽苗提取物的应用中，所述步骤(1)萌发苦荞芽苗的步骤包括：筛选子粒饱满、无污染的苦荞种子，用1.6-2.4％次氯酸钠浸泡2-10min，以种子体积2-5倍的28-32℃水浸泡4-8h，在23-27℃催芽培养，苦荞芽苗萌发后采收。前述的苦荞芽苗提取物的应用中，所述步骤(1)萌发苦荞芽苗的步骤包括：筛选子粒饱满、无污染的苦荞种子，用2％次氯酸钠浸泡5min，以种子体积2-3倍的30℃水浸泡6h，在25℃催芽培养，苦荞芽苗萌发后采收。前述的苦荞芽苗提取物的应用中，所述步骤(2)中，称取萌发5-15d的苦荞芽苗，加5-15倍苦荞芽苗重量的95％乙醇浸泡0.5-1.5h，回流提取2-5次,每次60-100min，合并滤液，残渣用95％乙醇洗至无色后一并纳入滤液，减压浓缩至浸膏，甲醇溶解，即得。前述的苦荞芽苗提取物的应用中，所述步骤(2)中，称取萌发8-12d的苦荞芽苗，加8-12倍苦荞芽苗重量的95％乙醇浸泡0.8-1.2h，回流提取2-3次,每次70-90min，合并滤液，残渣用95％乙醇洗至无色后一并纳入滤液，减压浓缩至浸膏，甲醇溶解，即得。前述的苦荞芽苗提取物的应用中，所述步骤(2)中，称取萌发10d的苦荞芽苗，加10倍苦荞芽苗重量的95％乙醇浸泡1h，回流提取2次,每次80min，合并滤液，残渣用95％乙醇洗至无色后一并纳入滤液，减压浓缩至浸膏，甲醇溶解，即得。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:1、本发明提出的将苦荞芽苗提取物用于防治茶树炭疽病可有效降低茶树的70％左右的茶树炭疽病发病率。2、本发明还给出了苦荞芽苗提取物的制备方法，制备步骤仅包括萌发苦荞芽苗和提取苦荞芽苗提取物，制备方法简单，且制得苦荞芽苗提取物的抑菌效果达到89.46％，抑菌效果好。3、本发明中选择5-6月份及9-10月份喷施苦荞芽苗提取物稀释液，是因为这几个月份是茶树炭疽病多发时期，在此期间喷施苦荞芽苗提取物稀释液可更好的防治茶树炭疽病。4、本发明中优选用水稀释10-200倍的苦荞芽苗提取物进行防治茶树炭疽病，是因为该稀释倍数下的苦荞芽苗提取物稀释液能够取得较好的防治效果，当稀释50倍左右时，防治效果最佳。5、本发明中选择喷施苦荞芽苗提取物稀释液在晴天清晨或傍晚进行，每隔5～7天喷施一次，喷施4～6次，如此可实现较好的茶树炭疽病防治效果。综上所述：本发明提出的将苦荞芽苗提取物用于防治茶树炭疽病可有效降低茶树的茶树炭疽病发病率，可降低70％左右的发病率；并且本发明给出了苦荞芽苗提取物的制备方法，不仅制备方法简单，所得苦荞芽苗提取物也有抑菌效果好的优点。附图说明图1是各苦荞提取液抑制茶炭疽菌的实验结果图；图1中标记说明：a是ck；b是苦荞粗酶液抑制茶炭疽菌；c是去除色素后的粗酶液抑制茶炭疽菌；d是黄酮提取原液抑制茶炭疽菌。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。实施例1。一种苦荞芽苗提取物的应用，制备苦荞芽苗提取物的步骤如下：(1)萌发苦荞芽苗；萌发苦荞芽苗的步骤为：筛选子粒饱满、无污染的苦荞种子，用1.6％次氯酸钠浸泡2min，以种子体积2倍的28℃水浸泡4h，在23℃催芽培养，苦荞芽苗萌发后定时采收。(2)提取苦荞芽苗提取物；提取苦荞芽苗提取物的步骤为：称取萌发5d的苦荞芽苗，加5倍苦荞芽苗重量的95％乙醇浸泡0.5h，回流提取2次,每次60min，合并滤液，残渣用95％乙醇洗至无色后一并纳入滤液，减压浓缩至浸膏，甲醇溶解，即得。将制得苦荞芽苗提取物用水稀释130倍后喷施于茶树叶片和枝条上用于防治茶树炭疽病，具体在当年5月10号起开始喷施，每7天喷施一次，共喷施4次。结果表明，按照本方法防治茶树炭疽病的茶树，与未施本苦荞芽苗提取物稀释制剂的茶树相比，茶树炭疽病发病率可降低69％。实施例2。一种苦荞芽苗提取物的应用，步骤如下：(1)萌发苦荞芽苗；萌发苦荞芽苗的步骤为：筛选子粒饱满、无污染的苦荞种子，用2.4％次氯酸钠浸泡10min，以种子体积5倍的32℃水浸泡8h，在27℃催芽培养，苦荞芽苗萌发后定时采收。(2)提取苦荞芽苗提取物；提取苦荞芽苗提取物的步骤为：称取萌发15d的苦荞芽苗，加15倍苦荞芽苗重量的95％乙醇浸泡1.5h，回流提取5次,每次100min，合并滤液，残渣用95％乙醇洗至无色后一并纳入滤液，减压浓缩至浸膏，甲醇溶解，即得。将制得苦荞芽苗提取物用水稀释200倍后喷施于茶树叶片和枝条上用于防治茶树炭疽病，具体在当年6月1号起开始喷施，每6天喷施一次，共喷施4次。结果表明，按照本方法防治茶树炭疽病的茶树，与未施本苦荞芽苗提取物稀释制剂的茶树相比，茶树炭疽病发病率可降低64％。实施例3。一种苦荞芽苗提取物的应用，步骤如下：(1)萌发苦荞芽苗；萌发苦荞芽苗的步骤为：筛选子粒饱满、无污染的苦荞种子，用2％次氯酸钠浸泡5min，以种子体积2.5倍的30℃水浸泡6h，在25℃催芽培养，苦荞芽苗萌发后采收。(2)提取苦荞芽苗提取物；提取苦荞芽苗提取物的步骤为：称取萌发8d的苦荞芽苗，加8倍苦荞芽苗重量的95％乙醇浸泡0.8h，回流提取2次,每次70min，合并滤液，残渣用95％乙醇洗至无色后一并纳入滤液，减压浓缩至浸膏，甲醇溶解，即得。将制得苦荞芽苗提取物用水稀释100倍后喷施于茶树叶片和枝条上用于防治茶树炭疽病，具体在当年9月10号起开始喷施，每6天喷施一次，共喷施6次。结果表明，按照本方法防治茶树炭疽病的茶树，与未施本苦荞芽苗提取物稀释制剂的茶树相比，茶树炭疽病发病率可降低68％。实施例4。一种苦荞芽苗提取物的应用，步骤如下：(1)萌发苦荞芽苗；萌发苦荞芽苗的步骤为：筛选子粒饱满、无污染的苦荞种子，用2％次氯酸钠浸泡5min，以种子体积3倍的30℃水浸泡6h，在25℃催芽培养，苦荞芽苗萌发后采收。(2)提取苦荞芽苗提取物；提取苦荞芽苗提取物的步骤为：称取萌发12d的苦荞芽苗，加12倍苦荞芽苗重量的95％乙醇浸泡1.2h，回流提取3次,每次90min，合并滤液，残渣用95％乙醇洗至无色后一并纳入滤液，减压浓缩至浸膏，甲醇溶解，即得。将制得苦荞芽苗提取物用水稀释10倍后喷施于茶树叶片和枝条上用于防治茶树炭疽病，具体在当年5月20号起开始喷施，每6天喷施一次，共喷施5次，结果表明，按照本方法防治茶树炭疽病的茶树，与未施本苦荞芽苗提取物稀释制剂的茶树相比，茶树炭疽病发病率可降低74％。实施例5。一种苦荞芽苗提取物的应用，步骤如下：(1)萌发苦荞芽苗；萌发苦荞芽苗的步骤为：筛选子粒饱满、无污染的苦荞种子，用2％次氯酸钠浸泡5min，以种子体积2倍的30℃水浸泡6h，在25℃催芽培养，苦荞芽苗萌发后采收。(2)提取苦荞芽苗提取物；提取苦荞芽苗提取物的步骤为：称取萌发10d的苦荞芽苗，加10倍苦荞芽苗重量的95％乙醇浸泡1h，回流提取2次,每次80min，合并滤液，残渣用95％乙醇洗至无色后一并纳入滤液，减压浓缩至浸膏，甲醇溶解，即得。将制得苦荞芽苗提取物用水稀释40倍后喷施于茶树叶片和枝条上用于防治茶树炭疽病，具体在当年9月20号起开始喷施，每6天喷施一次，共喷施6次。结果表明，按照本方法防治茶树炭疽病的茶树，与未施本苦荞芽苗提取物稀释制剂的茶树相比，茶树炭疽病发病率可降低73％。实施例6。一种苦荞芽苗提取物的应用，步骤如下：(1)萌发苦荞芽苗；萌发苦荞芽苗的步骤为：筛选子粒饱满、无污染的苦荞种子，用2％次氯酸钠浸泡5min，以种子体积2.5倍的30℃水浸泡6h，在25℃催芽培养，苦荞芽苗萌发后采收。(2)提取苦荞芽苗提取物；提取苦荞芽苗提取物的步骤为：称取新鲜萌发10d的苦荞芽1g，加10倍量95％乙醇，浸泡1h，回流提取2次，每次80min，合并滤液，残渣用95％乙醇洗至无色，一并纳入滤液，减压浓缩至浸膏，加甲醇溶解，并定容于50ml容量瓶中，即得。将制得苦荞芽苗提取物用水稀释50倍后喷施于茶树叶片和枝条上用于防治茶树炭疽病，具体在当年5月起开始喷施，每7天喷施一次，共喷施6次结果表明，按照本方法防治茶树炭疽病的茶树，与未施本苦荞芽苗提取物稀释制剂的茶树相比，茶树炭疽病发病率可降低76％。实验例。为验证本发明效果，发明人做了大量实验，部分实验记录如下：实验一，苦荞芽苗提取物抑菌效果考察。1.1苦荞芽萌发方法选种(筛选子粒饱满、无污染的苦荞种子)→清洗(用2％次氯酸钠浸泡5min，再用去离子水洗净)→浸种(以种子体积2-3倍的30℃水浸泡6h)→催芽培养(25℃)→定时采收1.2苦荞芽粗酶液的制备取新鲜的萌发10d的苦荞芽，清理去杂，准确称取1g，加入酶提取液，提取液为10ml预冷的磷酸缓冲液c(pbs,50mmol/l,ph7.8)，内含1％0.1mmol/ledta，4％pvp。再加入少量石英砂，冰浴充分研磨，在冷冻离心机上以10000r/min冷冻离心30min，上清液即为粗酶提取液，冷藏备用。1.3苦荞芽粗酶液色素去除(活性炭吸附法)称取颗粒活性炭4g，放入锥形瓶中，加入20ml粗酶液，将锥形瓶在55℃的恒温水浴锅内震荡75min，将颗粒活性炭过滤后，继续加入活性炭，重复3次，得到脱色后的酶液。1.4苦荞芽粗酶液中的黄酮提纯(乙醇回流法)称取新鲜萌发10d的苦荞芽1g，加10倍量95％乙醇，浸泡1h，回流提取2次，每次80min，合并滤液，残渣用95％乙醇洗至无色，一并纳入滤液，减压浓缩至浸膏，加甲醇溶解，并定容于50ml量瓶中，备用。1.5苦荞芽提取物对炭疽菌菌丝生长的抑制采用菌丝生长速率法：测定不同浓度的提取物的抑菌活性。将以上三种提取物粗酶液、脱色后的酶液、提纯后的酶液，在无菌条件下，用0.22μm滤膜过滤。向50ml已灭菌的烧杯中加入3ml各提取物，再加入27ml融化了的冷却至50℃左右的pda培养基，充分摇匀后倒入培养皿中制成平板，每板10ml，3次重复。此时的浓度为原浓度的1/10。以加入等量的磷酸缓冲液、乙醇、水的培养基作对照。接入长势一致的6mm菌饼，于25℃培养箱中培养。培养120h时用十字交叉法测量菌落直径，并计算菌丝生长抑菌率采用120h的菌丝生长抑制率。1.6实验结果与分析根据上述1.5步骤，实验结果图示如图1所示，具体结果如下表1所示：表1项目抑菌直径(cm)抑菌率(％)粗酶液6.61±0.04c7.32±0.89c去除色素后的粗酶液7.80±0.08a-11.05±3.01a黄酮提取原液1.28±0.18b89.46±2.79b注：表中数据均为平均数±标准差。不同字母表示经duncan氏新复极差法检验在p＜0.05水平差异显著。根据实验结果表明：苦荞苗所制备的粗酶液、黄酮提取原液对茶炭疽菌有抑制作用，粗酶液的抑菌率为7.32％，黄酮提取原液的抑菌率达到89.46％。当前第1页12