促进樱桃萝卜膨大及营养物质累积的叶面硒肥施用方法与流程

1.本发明涉及纳米农业技术领域，具体涉及促进樱桃萝卜膨大及营养物质累积的叶面硒肥施用方法。


背景技术：

2.樱桃萝卜(raphanus sativus l.var.radculus pers)是世界上最重要的块根蔬菜作物之一。其新鲜的主根含有丰富的营养物质，如维生素c、氨基酸、黄酮类化合物等，能够提高人体免疫能力，防止细胞的衰老，减低人体中癌症的发病率。因此，提高樱桃萝卜中营养物质的含量对人体健康非常有益的。目前，增加萝卜产量及营养物质的主要手段是施加外源肥料及人工合成激素。这些物质低的利用效率和在果实中的残留，严重威胁着农业生态环境和人们的食品安全。因此，迫切需要新技术应用到樱桃萝卜的生产中，以促进其绿色、可持续发展。
3.基于人工纳米材料形成的新型纳米农业技术，在提高作物抗性及产量，降低农业化学品投入方面，表现出了极大的应用潜力。硒(se)作为人体的必需元素，在保护免疫系统和抗氧化方面发挥着关键作用。因此，日常饮食中保障摄取足够的硒对人体健康非常重要。目前，研究人员主要使用亚硒酸盐(na2seo4)和硒酸盐(na2seo3)来生产富硒食品，但它们的生物利用度相对较低，容易造成新的生态毒害。与这些无机硒盐相比，se enms在农业应用表现出高效和低毒性等特点，已经广泛应用在烟草、胡椒、小麦等作物生产。但是，se enms农业技术应用在樱桃萝卜生产还未报道；尤其是其如何提高萝卜产量、营养物质及se含量，还未形成系统的技术。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种促进樱桃萝卜膨大及营养物质累积的叶面硒肥施用方法，明确了提高萝卜产量、营养物质及se含量的se enms农业技术应用在樱桃萝卜生产中的关键因素(se enms的粒径、施用量、施加时期和施加方式)，明确了通过植物光合作用、激素化合物的关键作用，增加碳水化合的合成与积累，促进萝卜形成层的分化和生长，加速营养物质的合成，从而达到增产提质的目标。
5.本发明通过如下技术方案实现上述目的：一种促进樱桃萝卜膨大及营养物质累积的叶面硒肥施用方法，包括以下步骤：
6.(1)将樱桃萝卜种子在5％次氯酸钠溶液中消毒10分钟，然后用去离子水冲洗3次，进行消毒；
7.(2)消毒完成后将种子在去离子水中浸泡4小时，然后将种子转移到5.0kg的土培器皿中，每天定时喷水；
8.(3)当种子幼苗长出，达到两叶一心时期时，叶面喷施10mg/l的se肥溶液70ml；
9.(4)继续进行培育，60天后收获小萝卜。
10.优选的，所述硒肥是零价se纳米材料，尺寸为30～80nm。
11.优选的，所述尺寸为40～70nm。
12.优选的，所述硒肥是以硒纳米颗粒溶液的形式施加，施加的浓度为5～50mgl-1
。
13.优选的，所述施加的浓度为10～25mgl-1
。
14.优选的，所述硒肥的施加体积为30～150ml/株。
15.优选的，所述硒肥的施加体积为60～100ml/株。
16.优选的，所述硒肥的施加时期为萝卜植株苗期，具体是植株两叶一心或四叶一心时期。
17.优选的，所述硒肥的施加方式是叶面喷施。
18.与现有技术相比，本发明促进樱桃萝卜膨大及营养物质累积的叶面硒肥施用方法的有益效果是：能够调控植物激素(生长素和细胞分裂素)合成基因的上表达，促进萝卜形成层细胞的分化和生长，增大萝卜个头，显著增加萝卜叶面的光合作用及碳水化合物的积累，加速碳水化合的转化，促进营养物质(黄酮类化合物、氨基酸、维生素c)的合成与积累，从而达到提高萝卜产量和营养物质的目标。
附图说明
19.附图1：实施例1中使用硒纳米材料的tem图；
20.附图2：实施例1中使用硒纳米材料调控生长素合成基因的上表达；
21.附图3：实施例1中使用硒纳米材料调控细胞分裂素合成基因的上表达；
22.附图4：实施例1中使用硒纳米材料促进萝卜形成层细胞的分化和生长；
23.附图5：实施例1中硒纳米材料对萝卜叶面的光合作用的增加；
24.附图6：实施例1中硒纳米材料对碳水化合物的积累；
25.附图7：实施例1中硒纳米材料对萝卜中黄酮类化合物、氨基酸、维生素c的增加；
26.附图8：实施例1中硒纳米材料对萝卜个头的增大；
27.附图9：实施例1中硒纳米材料对萝卜产量的提高；
28.附图10：实施例1中硒纳米材料对萝卜中se含量的提高。
具体实施方式
29.主要的测定方法：
30.(1)关键基因的测定：
31.使用cfx96
tm
实时系统(bio-rad，美国)对生长素和细胞分裂素的关键基因进行分析测定。使用植物rna提取试剂盒(takara minibest，日本)提取萝卜主根的总rna。根据逆转录试剂盒(easyquick rt mastermix，cw biotech co.,ltd.，江苏，中国)，使用t100tm热循环仪(bio-rad，美国)从提取的总rna中制备模板dna。每个qrt-pcr反应体系(50μl最终体积)包含2μl模板dna、1μl正向引物(10μm)、1μl反向引物(10μm)和25μl 2
×
ultra sybr混合物。反应程序为95℃10min，95℃15s，60℃1min，40个循环。每种生物处理均重复五次进行评估。使用2-δδct
方法计算相对基因表达。
32.(2)关键营养物质的测定：
33.将采集的新鲜萝卜根立即用液氮冷冻，取100mg鲜样于液氮中研磨均匀后置于2ml离心管内，加入1.5ml提取液(80％甲醇水溶液(内含0.1％甲酸和内标)，置于4℃冰箱预冷
保存)涡旋混匀；冰浴超声30min(35khz)；之后在4℃、12000rpm条件下离心15min，取上清液用旋转蒸发浓缩仪(接冷井)真空旋干，并用200μl甲醇乙腈水(4:4:2)复溶，在4℃、12000rpm条件下离心10min取上清液。上清液置于4℃环境临时保存，然后将处理好的样品上机测试，若长期保存需置于-20℃。
34.仪器型号：thermo scientific uplc vanquish。
[0035][0036]
流动相：水相a：0.1％甲酸水溶液
ꢀꢀ
有机相b：0.1％甲酸乙腈溶液
[0037]
流动相流速：0.35ml/min
[0038]
进样量：5μl
[0039]
柱温：35℃
[0040]
柱型：acquityuplc hss t3(2.1
×
100mm,1.8μm)
[0041]
(3)形成层细胞的测定：
[0042]
将萝卜根在福尔马林-醋酸-酒精(faa)固定液(福尔马林/醋酸/70％酒精(v：v：v)＝1：1：16)中固定48小时。将厚度为3mm的主根样品浸入70％乙醇中过夜(真空条件)。然后按以下顺序处理样品：在乙醇中梯度脱水(85％、95％、100％、各2h)和透明(50％二甲苯、100％二甲苯，各2h)。随后，进行蜡浸，然后将样品包埋在石蜡中。用leica rm 2235(德国)旋转切片机将包埋快切片(每次厚度为15μm)。通过荧光显微镜(nikon，eclipse ni，日本)观察萝卜根形成层区域。
[0043]
实施例1
[0044]
一种促进樱桃萝卜膨大及营养物质累积的叶面硒肥施用方法，包括如下步骤：
[0045]
(1)将樱桃萝卜种子在5％次氯酸钠溶液中消毒10分钟，然后用去离子水冲洗3次，进行消毒；
[0046]
(2)消毒完成后将种子在去离子水中浸泡4小时，然后将种子转移到5.0kg的土培器皿中，每天定时喷水；
[0047]
(3)当种子幼苗长出，达到两叶一心时期时，叶面喷施10mg/l的se肥(粒径60nm，图1)溶液70ml；
[0048]
(4)继续进行培育，60天后收获小萝卜。
[0049]
测试结果如下：萝卜根部生长素(图2)和细胞分裂素(图3)合成基因显著上表达；
形成层细胞增多(图4)；光合作用增加34.0％(图5)；碳水化合物增加25.6％(图6)；萝卜中黄酮类化合物、氨基酸、维生素c分别增加3.2、2.3和1.7倍(图7)；萝卜个头增大(图8)；产量提高49.1％(图9)；均与未施加纳米材料的萝卜，作为空白对照。
[0050]
实施例2
[0051]
调整实施例1中硒纳米材料的尺寸，分别为30和80nm，其他参数和实施例1保持一致，进行测试。
[0052]
测试结果如下表1：
[0053]
表1实施例2的测试结果
[0054][0055]
实施例3
[0056]
调整实施例1中硒纳米材料的施加体积，分别为30,100和150ml/株，其他参数和实施例1保持一致，进行测试。
[0057]
测试结果如下表1：
[0058]
表2实施例3的测试结果
[0059][0060]
实施例4
[0061]
调整实施例1中硒纳米材料的施加浓度，分别为5,25和50mg/l，其他参数和实施例1保持一致，进行测试。
[0062]
测试结果如下表1：
[0063]
表3实施例4的测试结果
[0064][0065]
实施例5
[0066]
调整实施例1中纳米材料的施加方式为根部加入，其他参数和实施例1保持一致，其光合提升13.2％；碳水化合物积累8.6％；黄酮类化合物，氨基酸、维生素c分别提升1.6、1.3和1.1倍；产量增加15.3％。
[0067]
实施例6
[0068]
调整实施例1中纳米材料为亚硒酸钠，其他参数和实施例1保持一致，其光合提升21.2％；碳水化合物积累16.7％；黄酮类化合物，氨基酸、维生素c分别提升1.6、1.4和1.2倍；产量增加18.2％。
[0069]
本发明能够调控植物激素(生长素和细胞分裂素)合成基因的上表达，促进萝卜形成层细胞的分化和生长，增大萝卜个头，显著增加萝卜叶面的光合作用及碳水化合物的积累，加速碳水化合的转化，促进营养物质(黄酮类化合物、氨基酸、维生素c)的合成与积累，从而达到提高萝卜产量和营养物质的目标。
[0070]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
[0071]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。