金针菇菌渣提取物在制备除草剂中的应用的制作方法

1.本发明属于农药除草剂技术领域，具体涉及金针菇菌渣提取物在制备除草剂中的应用。


背景技术：

2.随着人们日益增强的环保意识，社会对农药产品提出了越来越高的要求。开发适销对路的新产品难度不断加大，高昂的开发费用使许多厂商却步，但农药新产品开发与应用带来的巨大利润却始终吸引着众多研究院所、厂家商家关注的目光。积极发现和寻找有生物活性、结构新型的化合物，开发具有自主知识产权的新品种是创制新农药的关键，也是目前各大农药公司和科研单位的兴趣所在和研究热点。
3.在实用性方面，2005～2019年来农药市场持续增长，除草剂和杀虫剂的市场销售份额也都不断提升。相对来说，除草剂增速稳定，杀虫剂增速较缓，并已被杀菌剂所超越。尽管转基因作物的发展对除草剂产品有一定冲击，但除草剂仍是需要的，是最重要的作物保护手段，纵观除草剂的发展其市场份额均为上升趋势。
4.目前国内除草剂研发的技术缺点为：不仅新产品少，自主知识产权的新农药更少，针对国内农药市场的窘境，国内科研院所和厂商纷纷投入了大量人力和财力进行新农药开发工作，但收效甚微。其主要原因在于，很难筛选到合适的活性物质。当前活性物质筛选工作主要靠海选，一类是研究创造新的化合物后，逐一进行活性试验，另一类是从种类繁多的天然产物中，分离纯化后进行生物活性试验，然后选取活性较高的物质作为后备材料进行研发工作，往往上万个物质中难以获得一个合适的材料，因此，高昂的开发费用使许多厂商却步。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于发现金针菇菌渣提取物能抑制植物生长活性，以在生物除草剂农药方面提供一个新的选择，也为新品种农药开发奠定坚实基础。
6.本发明的第一个目的是提供金针菇菌渣提取物在制备除草剂中的应用，所述金针菇菌渣提取物提取方法为：
7.s1、称取干燥的金针菇菌渣，加入乙酸乙酯进行提取获得膏体；然后用碳酸钠除去乙酸后与80～100目的硅胶进行混合，获得混合物；
8.s2、将s1得到的混合物置于石油醚和乙酸乙酯的混合溶液中，通过过滤分离柱进行分离，得到一次分离的提取物。
9.优选的，s2中，还包括：将所述提取物进行薄层层析、减压浓缩后得到w1、w2、w3、w4不同极性的物质，将w4与200～300目的硅胶混合，通过石油醚和乙酸乙酯的混合液体进行梯度冲洗后，将冲洗的混合液体通过过滤分离柱进行层析分离，得到二次分离的提取物w4-1。
10.优选的，所述提取物或提取物w4-1通过抑制种子萌发和根系生长达到除草的目
的。
11.优选的，将所述提取物或w4-1用水进行稀释后使用，或者在制备除草剂制剂时添加所述提取物进行制剂制备。
12.优选的，用水进行稀释至0～2000倍。
13.优选的，s1中，所述金针菇菌渣与乙酸乙酯的质量体积比为1g:10ml。
14.优选的，s1中，所述膏体和硅胶的质量比为1:1～1.5。
15.优选的，s2中，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为5:1。
16.优选的，所述w4和硅胶的质量比为1:1～1.5。
17.优选的，制备提取物w4-1时，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为2:1。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
19.(1)本发明首次发现金针菇菌渣提取物的除草活性作用，对植物生长抑制作用明显，将其用于除草剂农药产品开发，具备开发成商品的潜力，不仅为国产新农药产品开发提供一个新的选择，且极大地降低了新农药研发成本，经济效益高，弥补了新成分农药相关领域空白，为国内自主产权的产品研发奠定基础。
20.(2)本发明采用的金针菇菌渣提取物为天然产物，与人工纯合成新化合物相比，为生物源活性物质，其对生物的致畸致癌致突变的可能性大大降低，无污染，对环境友好，可以极大地提升产品品质，提高农业产品的附加值，具有良好的社会及生态效益，是理想的生物农药产品。
附图说明
21.图1为本发明粗提取物在流动相石油醚：乙酸乙酯比为2:1时的薄层层析硅胶板图；
22.图2为本发明粗提取物在低浓度和高浓度的薄层层析硅胶板图；
23.图3为本发明粗提物对小白菜种子第5天的萌发和生长状况；
24.图4为本发明粗提物对小白菜种子第5天的根系生长状况；
25.图5为本发明不同的粗提物分别对小白菜种子第5天的萌发和生长状况；
26.图6为本发明提取物对小白菜种子第5天的萌发和生长状况。
具体实施方式
27.为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。本发明以小白菜试验代表除草剂筛选试验，小白菜十字花科植物，籽易获得，发芽率稳定，生长快，因此，以小白菜为材料，研究金针菇菌渣提取物作为除草活性物质对十字花科植物的生长抑制作用。
28.实施例1
29.金针菇菌渣提取物在制备除草剂中的应用，提取物是在金针菇菌渣分离纯化出来，分离纯化包括以下步骤：
30.s1、称取1.5kg的干菌渣(鲜菌渣含水量为55％)，用15l乙酸乙酯提取获得114.13g膏体；取42.21g膏体，用碳酸钠去除乙酸，得到32g膏体；将32g膏体与32g(80～100目)硅胶
混合；
31.s2、将s1得到的混合物通过以石油醚：乙酸乙酯的体积比5:1的混合溶液进行冲洗后获得混合液体，称取600g(200目)硅胶装入直径8cm的过滤分离柱内，将混合液体通过过滤分离柱进行层析分离得到一次分离的粗提取物。
32.经薄层层析硅胶板上样检测后，根据所含物质的不同极性，将各管进行合并，减压浓缩后得到4部分分离物样品，具体如下表1所示：
33.表1减压浓缩后分离物样品
[0034][0035][0036]
在表1中所示出的四个分离物样品中，将分离物w2、w3和w4用乙酸乙酯溶解后，经薄层层析硅胶板上样检测；其结果分别如图1、2所示。
[0037]
图1为金针菇菌渣分离物w2、w3和w4在流动相石油醚：乙酸乙酯比为2:1时的薄层层析硅胶板结果如图1a，其中还示出了金针菇菌渣分离物w4在流动相石油醚：乙酸乙酯比为2:1时的相对高浓度(上样量)如图1b左带和相对低浓度(上样量)如图1b右带的薄层层析硅胶板结果。图2为金针菇菌渣分离物在流动相石油醚：乙酸乙酯比为5:1时的薄层层析硅胶板结果；其中，图2a为金针菇菌渣分离物w2、w3和w4的低浓度的薄层层析硅胶板结果，图2b为金针菇菌渣分离物w2、w3和w4的高浓度的薄层层析硅胶板结果。
[0038]
从图1、图2示出的薄层层析硅胶板结果可以看出，从金针菇菌渣中提取的混合物，按照其极性差异，得到了较好的分离；
[0039]
s3、将s2得到的2.22gw4样品用25ml的乙酸乙酯溶液进行溶解后，在30～40℃，压强小于0.09mpa下进行减压浓缩获得1.4g样品；然后将1.4g样品与1.4g硅胶(200目)混合；
[0040]
s4、将s3得到的混合物通过以石油醚和乙酸乙酯按2:1、1:1、1:2进行梯度冲洗，最后用乙酸乙酯冲洗剩余部分，称取30g(200目)硅胶装入直径3cm的过滤分离柱，将混合液体通过过滤分离柱进行层析分离得到二次分离的提取物w4-1，进行层析分离；20ml一管收集，具体如下表2所示；
[0041]
表2二次分离的活性样品
[0042]
相应的分离管洗脱液1～26管石油醚：乙酸乙酯(2:1)27～45管石油醚：乙酸乙酯(1:1)46～56管石油醚：乙酸乙酯(1:2)57管乙酸乙酯冲洗58管甲醇冲洗
[0043]
根据硅胶板上样结果，将21～36管合并，以获得中间较纯的部分w4-1，得到0.55克物质。作为样品进行结构鉴定。其薄层层析硅胶板结果如图2c所示。图2c中，流动相为石油醚：乙酸乙酯比为2:1(加少许乙酸)，左带为w4，右带为21～36管合并后浓缩物质w4-1，从上样结果看，分离物较单一，无拖尾情况。
[0044]
实施例2
[0045]
对金针菇菌渣直接提取得到金针菇菌渣粗提物样品进行活性实验测试，观察抑制种子萌发和生长的状况。
[0046]
精确称取0.5g粗提样品溶于15ml乙酸乙酯，分别吸取1.0、0.5、0.25ml乙酸乙酯溶液置于滤纸上，待乙酸乙酯完全挥发后，将滤纸放入标号的玻璃培养皿，然后将每个培养皿内注入20ml水，30粒左右小白菜籽，以清水做对照，每处理重复3次，置于25℃恒温培养箱培养，观察种子萌发情况。
[0047]
表4活性样品对小白菜种子第5天的萌发和生长状况
[0048][0049][0050]
如表4结果表明，活性样品对小白菜籽萌发抑制显著如图3所示，在600倍浓度条件下，白菜籽萌发出芽后，根系生长明显受抑制如图4所示，萌发率为85％；在1200倍浓度条件下，根系长度明显短于对照组；与对照相比，活性物质在2400倍浓度下，对根系生长影响明显。本次试验结果表明，活性样品中含有抑制种子萌发的活性物质存在，抑制效果明显。
[0051]
实施例3
[0052]
将实施例1中一次分离时获得的金针菇菌渣分离物w2、w3和w4分别进行活性试验；其具体方法如下：将0.1g左右金针菇菌渣分离物分别用10ml乙酸乙酯溶解后，取该乙酸乙酯溶液1ml滴入干燥的滤纸(事先称重)上，待乙酸乙酯挥发后，再次称重确定滤纸上物质的质量，将滤纸放入培养皿内，加入20ml纯净水，然后在培养皿中放入30粒白菜籽后，置于27℃恒温培养箱内培养，5日后观察记录发芽情况。试验设置滤纸加纯净水为空白对照组(ck)，每处理重复3次。
[0053]
活性试验的结果如图5所示，可以清楚地看出，使用空白参照物ck、以及金针菇菌渣分离物w2和w3在1000倍浓度处理下，培养皿中均可观察到发芽现象；与之相比，使用金针菇菌渣分离物w4处理的种子如空白参照物ck没有发芽；该结果表明，金针菇菌渣分离物w4具有抑制种子发芽的活性。
[0054]
实施例4
[0055]
对本发明实施例1分离得到的w4-1(金针菇菌渣提取物)进行浓度梯度活性实验测试，观察抑制种子萌发和生长的状况。
[0056]
称取0.2g w4-1物质溶于10ml乙酸乙酯，分别吸取1.0、0.5、0.25ml乙酸乙酯溶液置于滤纸上，待乙酸乙酯完全挥发后，将滤纸放入标号的玻璃培养皿，然后将每个培养皿内注入20ml水，30粒左右小白菜籽，以清水做对照，每处理重复3次，置于25℃恒温培养箱培
养，观察种子萌发情况。
[0057]
表5金针菇菌渣提取物w4-1对小白菜种子第5天的萌发和生长状况
[0058] 1000倍2000倍4000倍ck抑制情况抑制生长抑制生长无无萌发率26.7％67.78％100％100％
[0059]
如表5和图6结果表明，金针菇菌渣提取物w4-1对小白菜籽萌发抑制显著，在1000倍浓度条件下，白菜籽萌发出芽后，生长缓慢，萌发率为26.7％；在2000倍浓度条件下，白菜籽萌发率为67.78％，根系长度明显短于对照组；与对照相比，在4000倍浓度条件下，活性物质对小白菜萌发基本无影响。
[0060]
因此，本技术首次发现金针菇菌渣及金针菇菌渣提取物对植物生长抑制作用明显，其金针菇菌渣提取物的除草活性作用，将其用于除草剂农药产品开发，不仅为国产新农药产品开发提供一个新的选择，也为国内自主知识产权新品种农药开发奠定坚实基础。此外，金针菇菌渣提取物为天然产物，与人工纯合成新化合物相比，其对生物的致畸致癌致突变的可能性大大降低，是理想的生物农药产品。
[0061]
本发明描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0062]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。