1.本发明涉及育苗技术领域，具体涉及一种枳椇的育苗方法。
背景技术：
2.枳椇，鼠李科枳椇属高大乔木，高10-25米，小枝褐色或黑紫色，叶互生，厚纸质至纸质，宽卵形、椭圆状卵形或心形。枳椇用途广泛，枳椇木材细致坚硬，为建筑和制细木工用具的良好用材；果序轴肥厚、含丰富的糖，可生食、酿酒、熬糖，民间常用以浸制“拐枣酒”，能治风湿；种子为清凉利尿药，能解酒毒，适用于热病消渴、酒醉、烦渴、呕吐、发热等症。
3.由于枳椇种子发芽率较低，在日常生产中常使用无性繁殖技术(组织培养)来培育枳椇幼苗。普通的组织培养包括扦插技术和叶插技术，在叶插培育幼苗的过程中受损的枳椇叶片容易受到细菌的感染，从而影响枳椇幼苗的存活率。为了防止在枳椇叶片在育苗的过程中受到感染，通常使用抗菌剂。然而单一的抗菌剂浓度过大会使得枳椇幼苗的存活率较低，抗菌剂浓度较小，则抗菌效果不佳。
4.因此，亟需提供一种枳椇叶片水培法叶插的育苗方法，该方法能够防止枳椇叶片在育苗过程中受到感染，并且使得枳椇幼苗的存活率得到保证。
技术实现要素：
5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种枳椇的育苗方法，该方法能够防止枳椇叶片在育苗过程中受到感染，并且使得枳椇幼苗的存活率得到保证，培育出的枳椇幼苗存活率能够达到95％以上。
6.本发明的发明构思为：通过选择甲基异噻唑啉酮、氟咯菌腈、甲基嘧啶胺、苯氧乙醇、乙基己基甘油和亚磷酸钾作为育苗方法的水培过程中的复配抗菌剂，能够防止枳椇叶片在育苗过程中受到感染、提高枳椇幼苗的存活率，并且发现甲基异噻唑啉酮与氟咯菌腈具有良好的增效作用。
7.本发明的第一方面提供一种枳椇的育苗方法，其特征在于，所述育苗方法包括脱分化处理和再分化处理，所述脱分化处理和所述再分化处理的过程中使用到抗菌剂，所述抗菌剂的组分包括甲基异噻唑啉酮、氟咯菌腈、甲基嘧啶胺、苯氧乙醇、乙基己基甘油、松香酸钾、亚磷酸钾。
8.相对于现有技术，本发明第一方面提供的一种枳椇的育苗方法的有益效果如下：通过选择甲基异噻唑啉酮、氟咯菌腈、甲基嘧啶胺、苯氧乙醇、乙基己基甘油和亚磷酸钾作为育苗方法的水培过程中的复配抗菌剂，能够防止枳椇叶片在育苗过程中受到感染、提高枳椇幼苗的存活率，培育出的枳椇幼苗存活率能够达到95％以上。
9.优选的，所述育苗方法包括以下步骤：
10.(1)将叶片a的断口涂抹6-苄氨基嘌呤溶液，静置，制得叶片b；
11.(2)将步骤(1)制得的所述叶片b进行第一水培、脱分化处理，制得具有愈伤组织的叶片c；所述第一水培的过程中使用第一培养液，所述第一培养液包括营养剂、抗菌剂、戊二
醇；
12.(3)将步骤(2)制得的所述叶片c进行第二水培、再分化处理，制得具有根系的幼苗；所述第二水培的过程中使用第二培养液，所述第二培养液包括营养剂、抗菌剂、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤；
13.所述抗菌剂的组分包括甲基异噻唑啉酮、氟咯菌腈、甲基嘧啶胺、苯氧乙醇、乙基己基甘油、松香酸钾、亚磷酸钾。
14.优选的，步骤(1)中，所述静置的时间为0.5-1.5小时。
15.优选的，步骤(1)中，还包括以下步骤：外植体选择，所述外植体的预处理。
16.优选的，所述外植体选择为：选取无病虫害、无变色的叶片，连叶柄采下备用。
17.优选的，所述外植体的预处理为：对采下后的所述叶片使用水进行冲洗，将所述叶片带入无菌环境，使用70-80％酒精溶液对所述叶片外表面进行消毒，静置风干，制得叶片a。
18.优选的，步骤(1)中，所述6-苄氨基嘌呤溶液的浓度为100-800mg/l；进一步优选的，所述6-苄氨基嘌呤溶液的浓度为300-600mg/l；更进一步优选的，所述6-苄氨基嘌呤溶液的浓度为450-550mg/l。
19.优选的，步骤(2)中，所述第一水培的步骤具体为：第一培养液浸没所述叶片b的断口，浸没区域小于整体叶片面积的1/2。
20.优选的，步骤(2)中，所述第一水培的培育时间为10-30天；进一步优选的，所述第一水培的培育时间为15-20天。
21.优选的，步骤(2)中，所述第一水培的容器为透明密封容器。
22.优选的，所述营养剂的组分包括蔗糖、丙酮酸钠、尿素、醋酸钾、亚磷酸钾、无水氯化铁、氯化钙、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、钼酸钠、硫酸铜和氯化钴；进一步优选的，硝酸铵能够替换所述尿素。
23.优选的，步骤(2)的所述第一培养液中，所述营养剂的组分的浓度包括：蔗糖20-30g/l、丙酮酸钠5-10g/l、尿素3-5g/l、醋酸钾1-2g/l、亚磷酸钾0.5-1g/l、无水氯化铁0.025-0.05g/l、氯化钙0.3-0.4g/l、硫酸镁0.3-0.4g/l、硫酸锰0.01-0.02g/l、硫酸锌0.005-0.01g/l、硼酸0.005-0.01g/l、碘化钾0.0005-0.001g/l、钼酸钠0.0001-0.0005g/l、硫酸铜0.000002-0.0002g/l、氯化钴0.000002-0.00002g/l；进一步优选的，步骤(2)的所述第一培养液中，所述营养剂的组分的浓度包括：20-30g/l蔗糖、5-10g/l丙酮酸钠、尿素3-5g/l、醋酸钾1.06-2g/l、亚磷酸钾0.8-1g/l、无水氯化铁0.025-0.03g/l、氯化钙0.37-0.4g/l、硫酸镁0.3-0.35g/l、硫酸锰0.019-0.02g/l、硫酸锌0.007-0.01g/l、硼酸0.005-0.009g/l、碘化钾0.0007-0.001g/l、钼酸钠0.0002-0.0003g/l、硫酸铜0.000002-0.0002g/l、氯化钴0.000002-0.00002g/l。
24.优选的，所述抗菌剂的组分还包括松香酸钾、维生素c。
25.优选的，步骤(2)的所述第一培养液中，所述抗菌剂的组分的浓度包括：甲基异噻唑啉酮50-100mg/l、氟咯菌腈50-100mg/l、甲基嘧啶胺0.1-1.5mg/l、苯氧乙醇1-5g/l、乙基己基甘油50-100mg/l、亚磷酸钾1-5g/l、松香酸钾30-60mg/l、维生素c 0.1-1.0g/l；进一步优选的，步骤(2)的所述第一培养液中，所述抗菌剂的组分的浓度包括：甲基异噻唑啉酮50-100mg/l、氟咯菌腈50-100mg/l、甲基嘧啶胺0.3-0.5mg/l、苯氧乙醇1.5-2g/l、乙基己基甘
油50-100mg/l、亚磷酸钾2-3g/l、松香酸钾40-50mg/l、维生素c 0.25-0.5g/l；更进一步优选的，所述甲基异噻唑啉酮的浓度为50-60mg/l、所述氟咯菌腈的浓度为50-60mg/l。
26.优选的，步骤(2)的所述第一培养液中，所述戊二醇的浓度为0.15-0.2g/l。
27.优选的，步骤(2)中，所述第一水培的白天时间的光照度为0.1-50lux(弱光环境)、温度为20-30℃(室温)；进一步优选的，所述第一水培的白天时间的光照度为1-50lux、温度为25℃。
28.优选的，步骤(2)中，所述愈伤组织的直径大于2mm；进一步优选的，所述愈伤组织的直径为2-9mm；更进一步优选的，所述愈伤组织的直径为4.5-5.5mm。
29.优选的，步骤(3)中，所述第二水培的步骤具体为：第二培养液浸没所述叶片c的愈伤组织，浸没区域小于整体叶片面积的1/2。
30.优选的，步骤(3)中，所述第二水培的培育时间为20-60天；进一步优选的，所述第一水培的培育时间为25-45天。
31.优选的，步骤(3)中，所述第二水培的容器为透明密封容器。
32.优选的，步骤(3)的所述第二培养液中，所述营养剂的组分的浓度包括：蔗糖20-30g/l、丙酮酸钠5-10g/l、尿素3-5g/l、醋酸钾1-2g/l、亚磷酸钾0.5-1g/l、无水氯化铁0.025-0.05g/l、氯化钙0.3-0.4g/l、硫酸镁0.3-0.4g/l、硫酸锰0.01-0.02g/l、硫酸锌0.005-0.01g/l、硼酸0.005-0.01g/l、碘化钾0.0005-0.001g/l、钼酸钠0.0001-0.0005g/l、硫酸铜0.000002-0.0002g/l、氯化钴0.000002-0.00002g/l；进一步优选的，步骤(3)的所述第二培养液中，所述营养剂的组分的浓度包括：20-30g/l蔗糖、5-10g/l丙酮酸钠、尿素3-5g/l、醋酸钾1.06-2g/l、亚磷酸钾0.8-1g/l、无水氯化铁0.025-0.03g/l、氯化钙0.37-0.4g/l、硫酸镁0.3-0.35g/l、硫酸锰0.019-0.02g/l、硫酸锌0.007-0.01g/l、硼酸0.005-0.009g/l、碘化钾0.0007-0.001g/l、钼酸钠0.0002-0.0003g/l、硫酸铜0.000002-0.0002g/l、氯化钴0.000002-0.00002g/l。
33.优选的，步骤(3)的所述第二培养液中，所述抗菌剂的组分的浓度包括：甲基异噻唑啉酮50-100mg/l、氟咯菌腈50-100mg/l、甲基嘧啶胺0.1-1.5mg/l、苯氧乙醇1-5g/l、乙基己基甘油50-100mg/l、亚磷酸钾1-5g/l、松香酸钾30-60mg/l、维生素c 0.1-1.0g/l；进一步优选的，步骤(3)的所述第二培养液中，所述抗菌剂的组分的浓度包括：甲基异噻唑啉酮50-100mg/l、氟咯菌腈50-100mg/l、甲基嘧啶胺0.3-0.5mg/l、苯氧乙醇1.5-2g/l、乙基己基甘油50-100mg/l、亚磷酸钾2-3g/l、松香酸钾40-50mg/l、维生素c 0.25-0.5g/l；进一步优选的，所述甲基异噻唑啉酮的浓度为50-60mg/l、所述氟咯菌腈的浓度为50-60mg/l。
34.优选的，步骤(3)的所述第二培养液中，所述萘乙酸的浓度为50-200mg/l；进一步优选的，所述萘乙酸的浓度为90-110mg/l。
35.优选的，步骤(3)的所述第二培养液中，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为25-75mg/l；进一步优选的，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为45-55mg/l。
36.优选的，步骤(3)中，所述第二水培的白天时间的光照度为80-1000lux(明亮环境)、温度为20-30℃(室温)；进一步优选的，所述第二水培的白天时间的光照度为80-500lux、温度为25℃。
37.优选的，步骤(3)中，所述根系的长度大于2cm；进一步优选的，所述根系的长度为2-9cm；更进一步优选的，所述根系的长度为4.5-5.5cm。
38.相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
39.(1)通过选择甲基异噻唑啉酮、氟咯菌腈、甲基嘧啶胺、苯氧乙醇、乙基己基甘油和亚磷酸钾作为育苗方法的水培过程中的复配抗菌剂，能够防止枳椇叶片在育苗过程中受到感染、提高枳椇幼苗的存活率，培育出的枳椇幼苗存活率能够达到95％以上。
40.(2)为使叶片断口快速形成愈伤组织，使用蔗糖、丙酮酸钠混合溶液作为碳源，使用尿素或硝酸铵作为氮源、使用亚磷酸钾作为磷源，并配置矿物质全元素肥。幼苗通过有机碳源环境培养，并且激素使用萘乙酸为主、无吲哚乙酸促进须根生长，对比其他方案所得幼苗主根粗壮，能够极大提高幼苗炼苗期间的生长存活率。
具体实施方式
41.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
42.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
43.实施例1
44.枳椇的水培法水插育苗方法，包括以下步骤：
45.(1)第一培养液的配制：往1l无菌水中依次加入营养剂、抗菌剂、戊二醇，搅拌，使得各组分的浓度如下：
46.营养剂：蔗糖25g/l、丙酮酸钠5g/l、尿素5g/l、醋酸钾1.5g/l、亚磷酸钾1g/l、无水氯化铁0.05g/l、氯化钙0.35g/l、硫酸镁0.35g/l、硫酸锰0.015g/l、硫酸锌0.01g/l、硼酸0.01g/l、碘化钾0.001g/l、钼酸钠0.0003g/l、硫酸铜0.0001g/l、氯化钴0.0000g/l；
47.抗菌剂：甲基异噻唑啉酮55mg/l、氟咯菌腈55mg/l、甲基嘧啶胺0.4mg/l、苯氧乙醇2g/l、乙基己基甘油75mg/l、亚磷酸钾2.5g/l、松香酸钾45mg/l、维生素c0.5g/l；
48.戊二醇的浓度为0.2g/l。
49.(2)第二培养液的配制：往1l无菌水中依次加入营养剂、抗菌剂、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤(6-ba原粉兑成百倍质量酒精溶液后按比例加入)，搅拌，使得各组分的浓度如下：
50.营养剂：蔗糖25g/l、丙酮酸钠5g/l、尿素5g/l、醋酸钾1.5g/l、亚磷酸钾1g/l、无水氯化铁0.05g/l、氯化钙0.35g/l、硫酸镁0.35g/l、硫酸锰0.015g/l、硫酸锌0.01g/l、硼酸0.01g/l、碘化钾0.001g/l、钼酸钠0.0003g/l、硫酸铜0.0001g/l、氯化钴0.0000g/l；
51.抗菌剂：甲基异噻唑啉酮55mg/l、氟咯菌腈55mg/l、甲基嘧啶胺0.4mg/l、苯氧乙醇2g/l、乙基己基甘油75mg/l、亚磷酸钾2.5g/l、松香酸钾45mg/l、维生素c0.5g/l；
52.萘乙酸：100mg/l；6-苄氨基嘌呤：50mg/l。第一培养液、第二培养液可根据需要重复配制。
53.(3)外植体选择：选取生长状况良好、枝干粗壮、树冠分檗多的枳椇植株，选取无病虫害、无变色健康的枳椇叶片100片，连叶柄采下备用。
54.(4)外植体的预处理：使用自来水对100片叶片进行初步冲洗，洗去其上杂质灰尘，洗净晾至表面干燥，接种箱预先使用紫外线灯消毒20分钟，关闭紫外线灯带入所有清洗后的叶片，取75％酒精溶液，使用医用棉枝蘸取酒精溶液对各叶片外表面进行擦拭消毒，待叶片表面酒精自然风干，制得叶片a批次。
55.(5)各叶片a断口涂抹500mg/l浓度6-ba(6-苄氨基嘌呤)溶液，静置1小时，制得叶片b批次。
56.(6)将第一培养液置于接种箱中，取透明密封容器，置入各叶片b，加入第一培养液将各叶片b断口浸没；将装有营养液与叶片b的透明密封容器移至弱光环境，白天该环境光照度为1-10lux，保持温度25℃，进行第一水培、脱分化处理，20天后待叶片b断口出现直径为4.5-5.5cm的愈伤组织(各叶片有个体差异)，制得叶片c批次。
57.(7)带有愈伤组织的叶片c批次连同透明密封容器移至明亮环境，避免阳光直射，白天该环境光照度为80-500lux，立刻更换透明密封容器的培养液为第二培养液，第二培养液将各叶片b断口浸没，保持温度25℃，进行第二水培、再分化处理，20天后制得具有根系的枳椇幼苗，根系长度为4.5-5.5cm(个体差异)。
58.(8)对各枳椇幼苗进行练苗栽培(炼苗栽培)，检测该实验批次枳椇幼苗存活率。练苗栽培的步骤为：
59.取出清洗，使用河沙：椰壳2:1比例混合作为栽培土，使用遮光百分之五十遮阴网养护，每日喷水2次保持湿润，幼苗生长至15cm高后遮阴网转为百分之二十遮阴网，生长至40公分后撤除遮阴网，完成炼苗，检查幼苗存活率。
60.幼苗存活率为从步骤(3)的“外植体选择”至结束练苗栽培后枳椇幼苗的存活率。
61.练苗栽培结果为：存活率：98％。
62.实施例2
63.对比例2与实施例1不同之处在于：第一培养液与第二培养液中的抗菌剂组分有所不同，第一培养液与第二培养液中抗菌剂的组分的浓度包括：甲基异噻唑啉酮50mg/l、氟咯菌腈60mg/l、甲基嘧啶胺0.5mg/l、苯氧乙醇1.5g/l、乙基己基甘油75mg/l、亚磷酸钾2g/l、松香酸钾45mg/l、维生素c 0.3g/l；其他配方组分一样、操作步骤一样。
64.练苗栽培结果为：存活率：96％。
65.实施例3
66.对比例2与实施例1不同之处在于：第一培养液与第二培养液中的抗菌剂组分有所不同，第一培养液与第二培养液中抗菌剂的组分的浓度包括：甲基异噻唑啉酮60mg/l、氟咯菌腈50mg/l、甲基嘧啶胺0.45mg/l、苯氧乙醇2g/l、乙基己基甘油75mg/l、亚磷酸钾2.5g/l、松香酸钾40-50mg/l、维生素c 0.4g/l；其他配方组分一样、操作步骤一样。
67.练苗栽培结果为：存活率：96％。
68.需要说明的是，实施例1-3实验同时进行，所用的枳椇叶片取自相同地段的相同树龄枳椇。
69.对比例1
70.对比例1与实施例1不同之处在于：第一培养液与第二培养液中的抗菌剂组分有所不同，不添加氟咯菌腈，甲基异噻唑啉酮的浓度改为110mg/l，其他配方组分一样、操作步骤一样。
71.练苗栽培结果为：存活率：63％。
72.对比例2
73.对比例2与实施例1不同之处在于：第一培养液与第二培养液中的抗菌剂组分有所不同，不添加甲基异噻唑啉酮，氟咯菌腈的浓度改为110mg/l，其他配方组分一样、操作步骤
一样。
74.练苗栽培结果为：存活率：77％。