含板栗提取物的抑菌剂及其制备方法和植物病害治理方法

1.本发明涉及植物保护技术领域，具体而言，涉及含板栗提取物的抑菌剂及其制备方法和植物病害治理方法。


背景技术：

2.病虫害直接危害农业生产效益和健康发展，造成严重的经济损失和粮食安全问题。据统计，全世界农业因有害生物每年造成的经济损失高达 1200亿美元，带来严重社会问题。
3.目前，化学药物仍是解决农业病害所致损失的重要方案。但化学药物的长期大量使用导致临床防治疗效愈来愈差，带来的“3r”(残留耐药性和再猖獗)等问题给生态环境保护、公共卫生和食品安全造成潜在危害，受到人们普遍质疑。药物抗性更是成为当前农药使用面临的突出问题，自1970年荷兰报道了甲菌定防治温室黄瓜白粉病因抗性失败的案例，迄今为止已报道有数百种真菌产生抗药性。2014年全国农业技术推广服务中心在对20 个省中防治12种重大病虫害的32个农药品种抗药性检测时发现，大多检测点的农作物病原对药物产生抗性，药物防效下降40％～70％，且某些菌种对药物的耐药性可以稳定遗传。
4.随着人们对食品安全的重视和有机绿色食品的青睐，高附加值的蔬菜、水果及肉食品等消耗量不断增加，环境友好的高效、低毒绿色农用药物的研发成为新趋势。天然产物具有良好的生物活性，加之低毒、低残或无残、对环境友好、结构变化多样等特点，已成为新农药分子的主要来源和研究热点。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供含板栗提取物的抑菌剂及其制备方法和植物病害治理方法。
7.本发明是这样实现的：
8.第一方面，本发明提供一种含板栗提取物的抑菌剂，其组分包括板栗废弃物的提取物，板栗废弃物的提取物为以板栗花和板栗苞中至少一种为原料由体积浓度为40-70％的乙醇溶液提取得到。
9.在可选的实施方式中，抑菌剂为悬浮剂，其组分按质量百分数计包括：
10.17～23％的板栗废弃物的提取物、0.5～4％的石墨烯、10～18％的助剂以及余量的水。
11.在可选的实施方式中，10～18％的助剂包括0.5～3％的润湿分散剂、8～13％的乙二醇、0.5～1.5％的硅酸镁铝以及0.2～0.5％的消泡剂；
12.优选地，润湿分散剂为吐温80；
13.优选地，消泡剂为消泡剂1501。
14.在可选的实施方式中，板栗废弃物的提取物的制备方法包括：
15.醇提：将板栗苞和板栗花中至少一种与质量浓度为40～70％的乙醇溶液混合进行浸提，浸提后固液分离得到初级提取液；
16.纯化：将初级提取液用石油醚进行萃取，萃取后取水层与乙酸乙酯进行混合萃取，收集乙酸乙酯层萃取液；或者，将初级提取液浓缩、干燥得到浸膏后，将浸膏与其体积2～3倍的水混合得到待萃液，将待萃液用石油醚进行萃取，萃取后取水层与乙酸乙酯进行混合萃取，收集乙酸乙酯层萃取液；
17.优选地，在醇提过程中，料液比为1:10～50；提取时间为90～210min，提取温度为30℃～60℃；
18.优选地，得到乙酸乙酯层萃取液后将其减压浓缩，然后冷冻干燥。
19.在可选的实施方式中，固液分离的方式为：浸提后将得到的混合物于转速为7000～8000r/min下离心8～12min，取上清液得到初级提取液。
20.第二方面，本发明提供一种如前述实施方式的含板栗提取物的抑菌剂的制备方法，包括将含板栗提取物的抑菌剂所含的各组分混合均匀。
21.第三方面，本发明提供一种如前述实施方式任一项的含板栗提取物的抑菌剂的制备方法，包括：
22.在配料釜内先加入占用水总质量85～95％的水和石墨烯，使两者混合均匀；然后加入占消泡剂总质量65～75％的消泡剂搅拌混匀；之后加入润湿分散剂搅拌混合均匀；然后向配料釜中加入板栗废弃物提取物、硅酸镁铝以及乙二醇，加入完成后进行搅拌剪切，搅拌剪切20～30min，剪切速率为45～55 s-1
剪切结束后得到一级浆料；
23.将一级浆料进行砂磨，得到粒径为3μm≤d90≤5μm的二级浆料；
24.在调配釜中向二级浆料中加入剩余的水和剩余的消泡剂混合均匀。
25.在可选的实施方式中，砂磨的方式具体为：使一级浆料依次进行三级砂磨，每一级砂磨的方式为：
26.启动砂磨机的进料泵使浆料在进料泵的作用下进入砂磨机进行砂磨，进料泵的泵料频次为14～16次/min，物料进料压力为≤0.5mpa，砂磨机转速为800～900r/min。
27.在可选的实施方式中，砂磨机的出口温度为≤30℃，出口压力≤0.1mpa。
28.第四方面，本发明提供植物病原菌引起的植物病害的治理方法，包括：采用如前述实施方式任一项的含板栗提取物的抑菌剂或如前述实施方式任一项的制备方法制得的含板栗提取物的抑菌剂喷洒病害植物。
29.本发明具有以下有益效果：
30.本技术提供的含板栗提取物的抑菌剂，由于其活性成分为板栗苞或板栗花的提取物，因此其具有抑制植物病原菌的作用，可以作为农药的功效组分防治植物病原菌引起的植物病害，其属于植物源农药，该含板栗提取物的抑菌剂相较于目前较多的化学农药，其不易使病菌产生耐药性，不会对生态环境、食品卫生以及公共安全造成损害。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这
些附图获得其他相关的附图。
32.图1为实验例3以实施例1制得的悬浮剂进行实验后实验结果实物照片；
33.图2为实验例3以实施例2制得的悬浮剂进行实验后实验结果实物照片。
具体实施方式
34.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
35.下面对本发明实施例提供的含板栗提取物的抑菌剂及其制备方法以及植物病害治理方法极性具体说明。
36.本发明实施例提供的含板栗提取物的抑菌剂，其组分包括板栗废弃物的提取物，板栗废弃物的提取物为以板栗花和板栗苞中至少一种为原料由体积浓度为40-70％的乙醇溶液提取得到。
37.发明人研究发现板栗花和板栗苞由体积浓度为40-70％的乙醇提取得到的提取物对于植物病原菌有很好的抑制作用，这些植物病原菌例如立枯丝核菌、稻瘟菌、禾谷镰刀菌以及油菜菌核菌等。因此，含有板栗花或板栗苞的提取物的药剂对于植物病原菌具有抑制作用。
38.进一步地，板栗废弃物的提取物的制备方法具体为：
39.s1、醇提
40.将板栗苞和板栗花中至少一种与质量浓度为40～70％(例如40％、60％弧70％)的乙醇溶液混合进行浸提，浸提后固液分离得到初级提取液。
41.优选地，为保证提取充分，在醇提过程中，料液比为1:10～50(例如1:10、 1:20或1:50)；提取时间为90～210min(例如90min、120min或210min)，提取温度为30℃～60℃(30℃、50℃或60℃)。
42.优选地，固液分离的方式为：浸提后将得到的混合物于转速为 7000～8000r/min(例如7000r/min、7500r/min或8000r/min)下离心8～12 min(例如8min、10min或12min)，取上清液得到初级提取液。
43.s2、纯化
44.将初级提取液用石油醚进行萃取，萃取后取水层与乙酸乙酯进行混合萃取，收集乙酸乙酯层萃取液；
45.或者，将初级提取液浓缩、干燥得到浸膏后，将浸膏与其体积2～3倍的水混合得到待萃液，将待萃液用石油醚进行萃取，萃取后取水层与乙酸乙酯进行混合萃取，收集乙酸乙酯层萃取液。
46.s3、浓缩、干燥
47.得到乙酸乙酯层萃取液后将其减压浓缩，然后冷冻干燥得到固体提取物。
48.经过上述一系列步骤能够得到纯度较高的固体提取物，需要说明的是，即使不进行纯化、浓缩、干燥，仅采用乙醇溶液浸提得到的提取液也是具有抑制植物病原菌的作用的，只不过纯化、浓缩、干燥后得到的提取物纯度更高，使用销售更方便。
49.优选地，抑菌剂为悬浮剂，其组分按质量百分数计包括：
50.17～23％的板栗废弃物的提取物、0.5～4％的石墨烯、10～18％的助剂以及余量的水。
51.石墨烯本身具有抑菌作用，将其与板栗废弃物的提取物配伍制得的悬浮剂对于植物病原菌的抑制作用更显著。
52.进一步地，为保证制得的悬浮剂的稳定性以及施用到植物上对植株叶片或茎秆有好的附着性，10～18％的助剂包括0.5～3％的润湿分散剂、8～13％的乙二醇、0.5～1.5％的硅酸镁铝以及0.2～0.5％的消泡剂。
53.优选地，润湿分散剂为吐温80。
54.优选地，消泡剂为消泡剂1501。
55.该悬浮剂的组分例如可以为：
56.17％的板栗废弃物的提取物、0.5％的石墨烯、3％的润湿分散剂、13％的乙二醇、硅酸镁铝1.5％以及0.5％消泡剂以及余量的水。
57.或者，23％的板栗废弃物的提取物、4％的石墨烯、0.5％的润湿分散剂、8％的乙二醇、1.5％硅酸镁铝以及消泡剂0.5％以及余量的水。
58.或者，20％的板栗废弃物的提取物、2％的石墨烯、2％的润湿分散剂、 10％的乙二醇、1％硅酸镁铝以及0.3％消泡剂以及余量的水。
59.本技术实施例还提供上述含板栗提取物的抑菌剂的制备方法，包括将含板栗提取物的抑菌剂所含的各组分混合均匀。
60.进一步地，含板栗提取物的抑菌剂的制备方法具体包括：
61.s1、混料
62.配料罐为不锈钢釜，釜中配有锚式搅拌器和剪切机。开启循环水，包括搅拌釜剪切机和管线剪切机的循环水。
63.在配料釜内先加入占用水总质量85～95％(例如85％、90％或95％)的水(剩余水在混料结束后用于冲洗管线和设备)，开启混合搅拌器，调整好搅拌转速，避免物料搅拌出配料釜中，向配料釜中加入石墨烯，充分混合均匀后加入占消泡剂总质量65～75％(例如65％、70％或75％)的消泡剂搅拌混匀；之后加入润湿分散剂约10min搅拌混合均匀；开启单机除尘设备，然后向配料釜中加入板栗废弃物提取物、硅酸镁铝以及乙二醇，加入完成后开启管线剪切打循环(防止堵塞底阀)，然后进行搅拌剪切，搅拌剪切 20～30min(例如20min、25min或30min)，剪切速率为45～55s-1
(例如45 s-1
、50s-1
或55s-1
)剪切结束后得到一级浆料。
64.s2、砂磨
65.将一级浆料进行砂磨，得到粒径为3μm≤d90≤5μm的二级浆料。
66.进一步地，为保证得到粒径小且分散均匀的悬浮液，使一级浆料依次进行三级砂磨，每一级砂磨的方式为：
67.启动砂磨机的进料泵使浆料在进料泵的作用下进入砂磨机进行砂磨，进料泵的泵料频次为14～16次/min(一般设置为15次/min)，物料进料压力为≤0.5mpa，砂磨机转速为800～900r/min(例如800r/min、850r/min或900 r/min)。
68.优选地，为保证制得的悬浮液的稳定性，砂磨机的出口温度为≤30℃，出口压力≤
0.1mpa。
69.更进一步地，砂磨过程具体为：
70.关闭管线剪切机、釜上剪切机，打开配料釜底阀，物料经篮式过滤器进入砂磨机。开启循环水泵，水泵的频率为：32hz(单独使用一条线时，两条或者两条以上频率为50hz)；开启空压机，控制阀门开度，确保压力在 0.4mpa。
71.开启一级砂磨机循环水，启动一级砂磨机进料泵，泵的泵料频率为 14～16次/min(一般设置为15次/min)，启动一级砂磨机主机，物料进料压力≤0.5mpa，物料开始一次砂磨，砂磨后的物料进入一级中转罐。
72.当一级中转罐物料达到100kg左右，开启二级砂磨机循环水，启动二级砂磨机进料泵，泵的泵料频率为14～16次/min(一般设置为15次/min，砂磨速度约为300kg/h)，启动二级砂磨机主机，物料进料压力≤0.5mpa，物料开始二次砂磨，砂磨后的物料进入二级中转罐。
73.当二级中转罐物料达到100kg左右，启动三级砂磨机进料泵，泵的泵料频率为14～16次/min(一般设置为15次/min)，启动三级砂磨机主机，物料进料压力≤0.5mpa，物料开始三次砂磨，砂磨后的物料进入成品罐。
74.此步骤中注意事项为：
75.(1)砂磨机出料速度约为200kg/h，根据质控结果反馈调节。
76.(2)严格控制砂磨机的出口温度≤30℃，出口压力≤0.1mpa。
77.(3)经过三级砂磨后，物料的粒径3μm≤d90≤5μm
78.s3、产品调配
79.在调配釜中向二级浆料中加入剩余的水和剩余的消泡剂混合均匀。
80.具体为：
81.物料砂磨完成后，将剩余的水(水量根据中控结果调节)经过调配釜、管线剪切机、管路和砂磨机、中转罐，收集至成品釜。开启搅拌，将剩余的消泡剂，直接加入调配釜中，搅拌20min，然后进入下一道工序，分装，或者放置吨桶。
82.经上述步骤制得的含板栗提取物的抑菌剂为悬浮剂剂型，其具有好的储存稳定性、冻熔稳定性以及持久起泡性。
83.本技术实施例还提供植物病原菌引起的植物病害的治理方法包括：采用本技术实施例提供的含板栗提取物的抑菌剂或本技术实施例提供的制备方法制得的含板栗提取物的抑菌剂喷洒病害植物。
84.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
85.实施例1
86.本技术提供的悬浮剂型的含板栗提取物的抑菌剂的组分为：
87.20％的板栗废弃物的提取物、2％的石墨烯、2％的吐温80、10％的乙二醇、1％硅酸镁铝以及0.3％消泡剂1501以及余量的水。
88.制备方法为：
89.板栗废弃物的提取：将板栗苞与质量浓度为40％的乙醇溶液混合进行浸提，浸提后离心得到初级提取液。料液比为1:20；提取时间为120min，提取温度为30℃。离心转速7500r/min，时间为10min，取上清液得到初级提取液。
90.将初级提取液浓缩干燥后得到浸膏。
91.将浸膏与其体积2倍的水混合得到待萃液，将待萃液用石油醚进行萃取，萃取后取水层与乙酸乙酯进行混合萃取，收集乙酸乙酯层萃取液，将该萃取液减压浓缩、冷冻干燥得到固体提取物。
92.按照上述内容提到的悬浮剂的制备方法制备悬浮剂。
93.混料过程中向配料釜中加90％的水，加70％的消泡剂；以剪切速率为 50s-1
剪切搅拌剪切25min。
94.砂磨过程中设置进料泵的泵料频次为15次/min，物料进料压力为≤ 0.5mpa，砂磨机转速为850r/min，砂磨机的出口温度为≤30℃，出口压力≤ 0.1mpa。
95.实施例2
96.本实施例与实施例1基本相同，不同之处仅在于：
97.板栗废弃物的提取物的制备方法中醇提过程为：将板栗花与质量浓度为70％的乙醇溶液混合进行浸提，浸提后离心得到初级提取液。料液比为 1:20；提取时间为120min，提取温度为60℃。离心转速7500r/min，时间为 10min，取上清液得到初级提取液。
98.实施例3
99.本实施例与实施例1基本相同，不同之处仅在于，将石墨烯提取物替换为等量去离子水。
100.对比例
101.本对比例与实施例1基本相同，不同之处仅在于，将板栗废弃物提取物替换为等量去离子水。
102.实验例1
103.测试实施例1-3制得的悬浮剂的性能
104.①
热贮稳定性
105.用注射器将约10m l试样注入洁净的安瓿瓶中(试样应避免接触瓶颈)，并将此安瓿瓶置于冰盐浴中制冷，使用酒精喷灯迅速封口，避免试样挥发，冷却至室温称重；将封好的安瓿瓶放入金属容器内，再将金属容器放在54
±
2℃的烘箱中，静置热贮14d后取出，将安瓿瓶外面拭净后称重，于 24h内对质量未发生变化的试样检测记录其外观、流动性、分散性、有效成分含量等指标，变化在允许范围内则为热贮合格。
106.②
冷贮稳定性
107.将100m l制剂置于离心管中，在制冷器中冷却至(0
±
2)℃保持1h，每间隔15min搅拌一次，每次15s，检查并记录有无油或固体析出；之后将离心管放回制冷器中，在0
±
2℃下继续静置7d，取出在室温下(不超过 20℃)静置3h，检测记录其外观、流动性、分散性、有效成分含量等指标，变化在允许范围内则为冷贮合格。
108.③
冻熔稳定性
109.用注射器将约10m l试样注入洁净的安瓿瓶中(试样避免接触瓶颈)，使用酒精喷灯迅速封口，将封口的安瓿瓶在-18℃环境下静置16h，之后将安瓿瓶放置于20℃环境下静置8h，此过程为一次循环，重复三次后检查记录试样外观，观察是否析油或有固体析出。3.2.6.4稀释稳定性将100m l30
ꢀ±
2℃的标准硬水置于250m l烧杯中，用移液管吸取水乳剂试样0.5m l，搅拌下缓慢滴入硬水中，配制成100m l乳状液；加完试样后以2-3r/s的速度
继续搅拌30s，然后立即将乳状液转移至干净的100m l量筒内，并将量筒在30
±
2℃的恒温水浴锅中静置1h，取出观察乳液的分离情况，若量筒中上无浮油下无沉淀，则稀释稳定性合格。
110.④
持久起泡性
111.将180m l标准硬水(15℃～25℃)加入量筒中，并将量筒置于天平上，称入1.0g样品，将硬水加至距量筒塞底部9cm
±
0.1cm的刻度线处，盖上塞子，以量筒中部为中心，上下180
°
颠倒30次(每次2s)。垂直放在试验台上，静置；记录在1min
±
10s时的泡沫体积(精确至2m l)。重复测定3 次，取算术平均值，作为该样品的持久起泡性测定结果。
112.表1含有板栗废弃物提取物的悬浮剂性能指标
[0113][0114]
从上表可看出，本技术实施例提供的制备方法制得的悬浮剂型的含板栗提取物的抑菌剂具有好的稳定性和起泡性。
[0115]
实验例2
[0116]
生长速率法测定实施例1-3和对比例制得的悬浮剂对供试病菌的抑制毒力。
[0117]
用灭菌水将药剂配成所需浓度：125μg/ml、250μg/ml以及500μg/ml；用移液枪吸取1ml药液于10ml刻度试管中，然后趁热倒入培养基至10ml 刻度，迅速用力摇匀，立即倒入直径9cm的培养皿中，制成薄厚均匀的平板，然后加盖并标记。将培养好的供试菌种用4mm的打孔器自菌落边缘打制一定数量的菌饼备用。待培养基冷却凝固后，用接种针小心的将菌饼放在含药培养皿中央，每皿1块，重复3次；待对照菌落直径生长至皿直径的2/3-3/4时，用卡尺测量各组菌落直径，每个菌落用十字交叉法垂直测量直径两次，取其平均值。求出供试药剂的回归方程和有效中浓度(ec50)。
[0118]
菌落直径＝菌落测量直径-菌饼直径；
[0119]
菌丝生长绝对抑菌率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]
ꢀ×
100％；
[0120]
采用spss(19.0)软件中邓肯氏新复极差法(dmrt)对试验数据进行统计分析。
[0121]
采用菌丝生长速率法对以上制剂进行了抑菌活性测定，结果见表1。结果表明制剂对5种病原菌均具有较好的菌丝生长抑制活性。
[0122]
表2供试药剂对供试病原菌抑制毒力测定结果
[0123][0124]
通过上表可看出，本技术各实施例提供的含板栗提取物的抑菌剂对于表格中的这几种植物病原菌具有显著的抑制效果，将实施例1与实施例3 对比，可看出实施例1的效果更好，说明悬浮液中添加适量的石墨烯对于病菌的抑制具有积极效果，将实施例1与对比例对比，可看出实施例1对病菌的抑制效果明显好于对比例，说明板栗废弃物提取物对于植物病原菌具有明显的抑制作用。
[0125]
实验例3
[0126]
田间药效试验
[0127]
将实施例1和实施例2所得制剂配成系列浓度。小麦赤霉病抑制试验设4个处理，包括空白组(只接种孢子)和三个处理组(孢子+不同浓度的制剂悬液125,250,500μg/ml)。采用单花注射法测定制剂对小麦赤霉的抗真菌活性。在开花期，在选定穗的中心小穗上点接种。接种后用密封袋覆盖 3天，保持湿度，促进病害发展。共测定了90株(每组30个，3个重复)。接种后7d进行病害评分。
[0128]
油菜菌核菌抑制试验进行盆栽育苗，待培养钵中的油菜长至3叶期，进行供试样品对油菜菌核病盆栽药效试验。以喷雾法进行施药，每个处理不少于3盆，每盆20株左右，设3次重复；设空白及药剂对照。喷药后第二天，以直径4mm的打孔器打制菌饼，将菌饼倒扣在油菜叶表面。7d后检查结果。
[0129]
根据空白对照发病情况进行分级调查，采用如下分级方法：
[0130]
0级：无病；
[0131]
1级：病斑面积占整片叶面积的5％以下；
[0132]
3级：病斑面积占整片叶面积的6％～15％；
[0133]
5级：病斑面积占整片叶面积的16％～25％；
[0134]
7级：病斑面积占整片叶面积的26％～50％；
[0135]
9级：病斑面积占整片叶面积的50％以上。
[0136]
病情指数按照以下公式进行计算。
[0137][0138]
药效按照以下公式进行计算。
[0139][0140]
将结果记录至表3中，并拍摄照片如图1和图2所示。
[0141]
表3供试药剂对小麦赤霉和油菜菌核控制结果
[0142][0143]
通过表3、图1和图2可看出，本技术实施例制得的含板栗提取物的抑菌剂对于小麦赤霉病以及油菜菌核病有明显的防治效果。
[0144]
综上，本技术提供的含板栗提取物的抑菌剂，由于其活性成分为板栗苞或板栗花的提取物，因此其具有抑制植物病原菌的作用，可以作为农药的功效组分防治植物病原菌引起的植物病害，其属于植物源农药，该含板栗提取物的抑菌剂相较于目前较多的化学农药，其不易使病菌产生耐药性，不会对生态环境、食品卫生以及公共安全造成损害。
[0145]
本技术提供的制备方法，能够制得悬浮剂型的含板栗提取物的抑菌剂，制得的含板栗提取物的抑菌剂稳定性好，对于植物病原菌的抑制效果好。
[0146]
本技术提供的植物病原菌引起的植物病害的治理方法，由于是采用本技术提供的含板栗提取物的抑菌剂作为农药来治疗植物病害，因此该治理方法防治效果好，不会对生态环境、食品卫生以及公共安全造成损害。
[0147]
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。