复苏促进因子蛋白在防治农作物重茬病害和促进农作物生长中的应用及应用方法与流程

1.本发明涉及复苏促进因子蛋白在防治农作物重茬病害和促进农作物生长中的应用及应用方法，属于农业应用技术领域。


背景技术：

2.1998年mukamolova等在m.luteus中发现了一种能促进处于休眠、不繁殖状态的细菌复苏生长的因子，被命名为复苏促进因子(rpf)。由于它的功能类似于真核生物的生长因子，因而也被称为细菌的细胞因子。rpf是迄今发现的第一个能使休眠状态的细菌复苏并促进其生长的因子。rpf的分子量约16～17kd，在皮克(10-12
g)水平以自分泌和旁分泌形式促进休眠菌的复活和生长。
3.rpf蛋白是指含有rpf样保守结构域的rpf蛋白家族的统称。rpf广泛存在于革兰氏阳性菌中，不同类型菌分泌的rpf蛋白存在一定的差异，但具有rpf保守结构域(ncbi：cdd:284212)，统称为rpf蛋白。实验证明，该保守区域是rpf促复苏的重要结构，单独的rpf结构域即具有与rpf蛋白一致的生物学功能。
4.土壤微生物和酶是土壤生物化学特性的重要组成部分，在土壤养分转化循环、有机质分解等方面起着重要作用，是土壤肥力的一个重要指标，常被用于评价土壤质量的生物学特性，现已成为土壤学界的研究热点之一。目前主要是通过直接向土壤中添加生物菌剂来补充或者丰富土壤中的微生物，但是效果一般。而利用rpf蛋白复苏培养vbnc状态菌的研究主要集中于医学和流行病学领域中的潜在病原菌的发现、疫苗研制，以及食源性病原菌的检测等方面，在农业生产领域的应用未见报道。
5.由于我国农作物复种指数相对较高，土壤重茬问题比较突出，土壤微生态失衡，土壤中有害菌数量增多，有益菌数量减少，从而导致的土传病害发生严重，目前主要是使用一些化学农药杀灭有害菌或者使用生物菌剂补充有益菌来改善土壤重茬问题减轻作物病害，但过多的农药使用容易造成土壤污染，作物农残超标等问题；通过使用纯生物rpf蛋白改善土壤重茬问题、减轻作物病害等目前未见到相关报道。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供复苏促进因子蛋白在防治农作物重茬病害和促进农作物生长中的应用及应用方法。
7.本发明的技术方案如下：
8.复苏促进因子蛋白在防治农作物重茬病害和促进农作物生长中的应用。
9.根据本发明优选的，所述复苏促进因子蛋白ncbi的id为cab09664.2。
10.根据本发明优选的，所述复苏促进因子蛋白的制备方法如下：
11.(1)将菌种保藏编号为cgmcc no.11963的弗氏链霉菌孢子接种至斜面培养基，在28℃条件下培养7天，加入无菌水，孢子在无菌水内均匀分散，制成浓度为108～109个/ml的
孢子悬液；
12.(2)将步骤(1)中的孢子悬液接种到液体发酵培养基中，接种量为液体发酵培养基体积的2％，在30℃，转速180r/分钟的条件下培养24小时，得到液体发酵种子液；
13.(3)将步骤(2)中的液体发酵种子液接种到液体培养基中，接种量为发酵培养基质量的10％，在30℃下培养4天，得到含rpf蛋白的发酵母液；
14.(4)将步骤(3)中的rpf蛋白发酵母液加热至80℃，保温20分钟，然后加入0.1％助滤剂后进行板框过滤，弃去沉淀，所得上清液为含rpf蛋白的原液；
15.(5)向步骤(4)中含rpf蛋白的原液中加入硫酸铵，在0℃条件下沉淀4小时，板框压滤后取沉淀，用含8mol/l尿素的溶液溶解后经梯度透析，采取逐步降低尿素浓度的方法除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此过程中自然复性，先用含6mol/l尿素的缓冲液4℃透析过夜，然后分别用含4mol/l、3mol/l、2mol/l、1mol/l、0mol/l尿素的缓冲液4℃下各透析4h，透析结束后将蛋白溶液选用弱阴离子交换柱deae进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行sds-page分析，最后用pbs缓冲液4℃下再透析4h，得到复苏促进因子蛋白。
16.根据本发明优选的，步骤(1)中，所述斜面培养基组成(m/v)豆粕粉2％，酵母粉0.5％，玉米粉1％，琼脂粉1.5％；步骤(2)和步骤(3)中，所述液体发酵培养基(m/v)组成包括玉米粉3％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾0.03％、蛋白胨0.5％、黄豆饼粉1.5％、硝酸钾0.5％、豆油1％、氯化钙0.05％。
17.根据本发明优选的，步骤(4)中，所述助滤剂为硅藻土、膨润土、高岭土中的一种或多种混合物
18.根据本发明优选的，步骤(5)中，所述硫酸铵的质量与含rpf蛋白的原液的体积之比为1：2，单位：g/ml。
19.根据本发明优选的，所述农作物重茬病害包括根结线虫病、根腐病、青枯病、枯萎病和立枯病、疫病等。
20.根据本发明优选的，所述农作物为萝卜、草莓、甜瓜、茄子、黄瓜、西红柿、芹菜或生姜。
21.一种防治农作物重茬病害和促进农作物生长的方法，可以单独使用复苏促进因子rpf或者将复苏促进因子rpf蛋白与氨基酸和微量元素混合后冲施或者喷施使用。
22.根据本发明优选的，所述复苏促进因子蛋白的使用浓度为50～150mg/l。
23.进一步优选的，所述复苏促进因子蛋白的使用浓度为100mg/l。
24.根据本发明优选的，所述氨基酸为赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、脯氨酸中的一种或多种复合物，使用浓度为150～200mg/l。
25.进一步优选的，所述氨基酸为谷氨酸和天冬氨酸的组合物，使用浓度为200mg/l。
26.根据本发明优选的，所述微量元素为柠檬酸亚铁、edta锌、edta铜和硼酸的组合物，使用浓度为40mg/l。
27.根据本发明优选的，所述冲施或者喷施具体为：在农作物苗期冲施或者喷施1～3次，冲施或者喷施量为1～3升/亩。
28.本发明的技术特点：
29.土壤中90％左右的微生物处于休眠状态，而在一些不健康的重茬土壤中，处于休
眠状态的微生物达到95％以上。土壤中引起植物病变的细菌大多属于革兰氏阴性菌，而革兰氏阳性菌大多属于对作物有益的菌群。rpf蛋白配合氨基酸和微量元素可以有效激活革兰氏阳性菌，并促进其快速繁殖，可以增加土壤中有益菌数量，同时还能抑制革兰氏阴性菌繁殖，从而改良土壤微生态环境，重新构建健康土壤微生态系统，进而可以解决各种土壤重茬问题。随着土壤微生物的大量繁殖，开始逐渐建立健康的土壤微生态平衡，微生物与植物之间重新建立起互助共生的关系，达到防治农作物重茬病害和促进农作物生长。
30.本发明的有益效果在于：
31.1、本发明发现通过冲施或喷施复苏促进因子蛋白可以有效激活土壤或农作物上休眠的革兰氏阳性菌，促进革兰氏阳性菌快速繁殖，增加土壤和农作物植株上有益菌数量，防治地下或叶部病害，通过地面喷施或冲施复苏促进因子可以有效改良土壤微生态环境，具有防治农作物连作障碍、防治农作物根部土传病害的作用。
32.2、本发明发现复苏促进因子蛋白配合氨基酸和微量元素使用可以进一步促进革兰氏阳性菌的繁殖，对大多数病原菌形成生态位竞争优势，促进农作物生长，减少病害，改善和提高农产品的品质，同时还起到预防农作物早衰，老树复壮的作用。
33.3、本发明发现复苏促进因子蛋白配合氨基酸和微量元素使用相比直接单独使用，产生了协同作用，效果更加明显、持久，有效地提高了农作物产量，使得萝卜增产32.71％，草莓增产15.68％，西红柿增产14.38％，芹菜增产18.81％，可以广泛应用于农业生产中。
34.4、本发明发现无论单独使用复苏促进因子或者配合氨基酸微量元素使用，均能有效的减少作物重茬病害问题，大姜青枯病分别减少了75.2％和85.2％，茎基腐病降低了83.2％和87.8％，根结线虫病降低了79.3％和85.3％；甜瓜根腐病分别减少了82.3％和85.7％，线虫病减少了76.5％和84.3％；草莓红中柱根腐病分别减少了82.1％和87.5％，炭疽病分别减少了80.3％和85.2％；西红柿青枯病分别减少了82.2％和88.5％，灰霉病分别减少了75.6％和88.2％，疫病分别减少了77.1％和82.5％；芹菜立枯病减少了75.2％和80.6％，菌核病分别减少了76.7％和89.2％。
附图说明
35.图1为实施例4中冲施复苏促进因子后土壤中芽孢杆菌数量的对比照片。
36.图2为实施例4中冲施复苏促进因子后的萝卜对比照片。
37.图3为实施例5中冲施复苏促进因子后土壤中芽孢杆菌数量的对比照片。
38.图4为实施例5中冲施复苏促进因子后的草莓对比照片。
具体实施方式
39.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
40.实施例1
41.一种rpf蛋白的制备方法，具体步骤如下：
42.(1)将菌种保藏编号为cgmcc no.11963的弗氏链霉菌孢子接种至斜面培养基，在28℃条件下培养7天，加入无菌水，孢子在无菌水内均匀分散，没有团聚，制成浓度为108个/
ml的孢子悬液；
43.其中，所述斜面培养基组成(m/v)豆粕粉2％，酵母粉0.5％，玉米粉1％，琼脂粉1.5％；
44.(2)将步骤(1)中的孢子悬液接种到液体发酵培养基中，接种量为液体发酵培养基体积的2％，在30℃，转速180r/分钟的条件下培养24小时，得到液体发酵种子液；
45.其中，所述液体发酵培养基(m/v)组成包括玉米粉3％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾0.03％、蛋白胨0.5％、黄豆饼粉1.5％、硝酸钾0.5％、豆油1％、氯化钙0.05％；
46.(3)将步骤(2)中的液体发酵种子液接种到液体培养基中，接种量为发酵培养基质量的10％，在30℃下培养4天，得到含rpf蛋白的发酵母液；
47.(4)将步骤(3)中的rpf蛋白发酵母液加热至80℃，保温20分钟，然后加入0.1％硅藻土后进行板框过滤，弃去沉淀，所得上清液为含rpf蛋白的原液；
48.(5)向步骤(4)中含rpf蛋白的原液中按照1：2的质量体积比(g/ml)加入硫酸铵，在0℃条件下沉淀4小时，板框压滤后取沉淀，用含8mol/l尿素的溶液溶解后经梯度透析，采取逐步降低尿素浓度的方法除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此过程中自然复性，先用含6mol/l尿素的缓冲液4℃透析过夜，然后分别用含4mol/l、3mol/l、2mol/l、1mol/l、0mol/l尿素的缓冲液4℃下各透析4h，透析结束后将蛋白溶液选用弱阴离子交换柱deae进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行sds-page分析，最后用pbs缓冲液4℃下再透析4h，得到复苏促进因子蛋白。
49.本实施例中菌种保藏编号为cgmcc no.11963已经在中国专利文献cn109749961a中公开和保藏。
50.实施例2
51.rpf蛋白、氨基酸和微量元素复合物的配制：
52.将实施例1的rpf蛋白配制成浓度为100mg/l的rpf蛋白原液，然后将复合氨基酸原粉按照(m/v)10％的比例加入到rpf蛋白原液中，所述复合氨基酸原粉由赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、脯氨酸复合组成，继续按照下述比例(m/v)加入微量元素柠檬酸亚铁10g/l，edta锌5g/l，edta铜5g/l，硼酸8g/l，获得rpf蛋白、氨基酸与微量元素的复合物溶液。
53.同时按照相同的质量体积比例将复合氨基酸原粉、微量元素柠檬酸亚铁、edta锌、edta铜和硼酸添加至水中配置成不含rpf蛋白的氨基酸与微量元素复合溶液，用于后续实施例。
54.实施例3
55.生姜防病抗重茬试验。试验地点位于潍坊市安丘凌河镇，生姜品种为大姜，该地为重茬地块，上茬种植作物为生姜，姜青枯病、线虫病、茎基腐病等重茬病害发生严重，死棵较多。
56.试验设置：本实验设置如下三个处理：空白对照、实施例2中rpf蛋白原液(处理1)和实施例2中rpf蛋白、氨基酸与微量元素的复合物溶液(处理2)，冲施大姜共使用2次，分别在出苗期和培土前各冲施一次，用量为2升/亩/次，rpf蛋白使用浓度为100mg/l，生姜产量及病害发生情况详见下表1。
57.表1
[0058][0059][0060]
收获期分别统计产量和生姜重茬病害的发生情况，并检测土壤中芽孢杆菌的含量。由表1可知，使用复苏促进因子后，生姜产量增加了28.32％，土壤中有益芽孢杆菌的数量增加了685％，姜青枯病减少了75.2％，茎基腐病降低了83.2％，根结线虫病降低了79.3％，明显的提高了生姜的产量，减轻了重茬病害。使用含氨基酸和微量元素的rpf蛋白溶液，生姜产量增加了35.28％，土壤中有益芽孢杆菌的数量增加了820％，姜青枯病减少了85.2％；茎基腐病降低了87.8％，根结线虫病降低了85.3％，与单用rpf蛋白相比，进一步提高了生姜的产量，减轻了重茬病害。
[0061]
所述土壤中芽孢杆菌检测方法参照如下方法进行：分别取对照田和试验田土壤，各称取10g土样，加入100ml灭菌水中，在摇床上200r/min震荡30min，制成土壤悬液，然后用无菌移液管分别吸取1ml土壤母液，加入到9ml灭菌水中，按照1～10梯度稀释，分别制成10、102、103、104梯度稀释倍数的土壤菌悬液，然后每个浓度取0.1ml，加到制备好的细菌培养基平板上，用无菌涂布棒将平板涂布均匀，放置37℃培养箱内培养过夜，统计芽孢杆菌菌落数量。
[0062]
实施例4
[0063]
萝卜促生试验。试验地点：临沂市河东区，试验处理：使用浓度为100mg/l的实施例2中rpf蛋白原液冲施大田萝卜，对照为清水处理，用量为2升/亩，在萝卜苗期冲施一次。
[0064]
收获时，分别统计产量并检测土壤中芽孢杆菌的含量，结果如图1～2和表2所示。
[0065]
表2
[0066][0067]
由图1～2和表2可知，与对照相比，使用rpf蛋白后的土壤中芽孢杆菌数增加了865％，萝卜增产32.71％，且萝卜形状规整，产品质量提高。
[0068]
实施例5
[0069]
草莓促生防病提品质试验。试验地点：临沂市临沭县，试验处理：使用浓度为100mg/l的实施例2中rpf蛋白原液冲施大田草莓，对照为清水处理，2升/亩，在苗期冲施两次。
[0070]
收获时，分别统计产量并检测土壤中芽孢杆菌的含量，结果如图3～4和表3所示。
[0071]
表3
[0072][0073]
由图3～4和表3可知可知，与对照相比，使用rpf蛋白后的土壤中芽孢杆菌数增加了1140％，草莓增产15.68％，糖度增加11％，vc含量提高了6％，草莓红中柱根腐病减少了81.7％，炭疽病减少了77.5％，说明rpf蛋白具有明显增产提质防病的效果。
[0074]
实施例6
[0075]
甜瓜防病试验。试验地点：河北石家庄市。试验处理：分别使用浓度为100mg/l的实施例2中rpf蛋白原液(处理1)、实施例2中rpf蛋白、氨基酸与微量元素的复合物溶液(处理2)以及不含rpf蛋白的氨基酸与微量元素复合溶液(处理3)冲施大田甜瓜，同时设置空白对照，用量均为2升/亩，在苗期冲施两次，结果如表4所示。
[0076]
表4
[0077][0078]
由表4可知，收获时，处理1和处理2与空白对照相比，土壤中放线菌数量分别增加了50％和58％，甜瓜增产分别为18.52％和25.18％，甜瓜根腐病分别减少了82.3％和85.7％，线虫病减少了76.5％和84.3％，可明显提高甜瓜产量，降低根腐病和线虫病害，单独使用处理3对于土壤微生物群落的影响以及根腐病和线虫病害的防治效果均不明显，rpf蛋白结合可以明显提高产量以及对根腐病和线虫病的防治效果。
[0079]
实施例7
[0080]
茄子促生试验。试验地点：安徽省宿州市。试验处理：分别使用浓度为100mg/l的实施例2中rpf蛋白原液(处理1)和实施例2中rpf蛋白与氨基酸与微量元素的复合物溶液(处理2)冲施大田茄子，同时设置空白对照处理，用量均为2升/亩，在苗期冲施两次，结果如表5所示。
[0081]
表5
[0082][0083]
由表5可知，收获时，与空白对照相比，土壤中放线菌数量分别增加了184.6％和215.8％，茄子分别增产21.5％和25.6％。
[0084]
实施例8
[0085]
黄瓜防病试验。试验地点：河北遵化市，试验处理：分别使用浓度为100mg/l的实施例2中rpf蛋白原液(处理1)和实施例2中rpf蛋白、氨基酸与微量元素的复合物溶液(处理2)冲施大田黄瓜，同时设置空白对照处理，用量均为2升/亩，在苗期冲施两次，结果如表6所示。
[0086]
表6
[0087][0088]
由表6可知，收获时，与空白对照组相比，土壤中放线菌数量分别增加了500％和650％，黄瓜蔓枯病分别减少了81.5％和88.6％，线虫病减少了86.5％和90.2％，黄瓜枯萎病减少了78.2％和86.5％。
[0089]
实施例9
[0090]
草莓防病试验。试验地点：临沂市莒县，试验处理：分别使用浓度为100mg/l的实施例2中rpf蛋白原液(处理1)和实施例2中rpf蛋白、氨基酸与微量元素的复合物溶液(处理2)冲施大田草莓，同时设置空白对照处理，用量均为2升/亩，在苗期冲施两次，结果如表7所示。
[0091]
表7
[0092][0093]
由表7可知，收获时，与空白对照组相比，土壤中有益芽孢杆菌数量分别增加了
48.4％和180.6％，草莓增产25.2％和36.5％，糖度分别增加10％和12％，vc含量分别提高了8％和9％，草莓红中柱根腐病分别减少了82.1％和87.5％，炭疽病分别减少了80.3％和85.2％，具有明显的改善重茬预防病害的作用。
[0094]
实施例10
[0095]
西红柿防病试验。试验地点：山东临沂市沂南县，试验处理：分别使用浓度为100mg/l的实施例2中rpf蛋白原液(处理1)、实施例2中rpf蛋白、氨基酸与微量元素的复合物溶液(处理2)以及不含rpf蛋白的氨基酸与微量元素复合溶液(处理3)冲施大田西红柿，同时设置空白对照处理，用量均为2升/亩，在苗期冲施两次，结果如表8所示。
[0096]
表8
[0097][0098]
由表8可知，收获时，与空白对照组相比，处理1和处理2芽孢杆菌数量分别增加了708.3％和825.5％，西红柿增产幅度分别为14.38％和21.65％。西红柿青枯病分别减少了82.2％和88.5％，灰霉病分别减少了75.6％和88.2％，疫病分别将少了77.1％和82.5％，处理3仅对产量表现出一定的促生效果，对于土壤有益菌及重茬病害没有明显作用，青枯病和疫病的防治效果为0，并且处理1和处理3增产的效果之和和土壤芽孢菌数量之和均小于处理2，说明在实际使用过程中rpf蛋白与氨基酸+微量元素不是简单的叠加，而是产生了协同作用，相较于rpf蛋白、氨基酸与微量元素各自使用进一步增加了西红柿产量和土壤芽孢菌数量。
[0099]
实施例11
[0100]
芹菜防病试验。试验地点：临沂市河东区，试验方法：分别使用浓度为100mg/l的实施例2中rpf蛋白原液(处理1)和实施例2中rpf蛋白、氨基酸与微量元素的复合物溶液(处理2)冲施大田芹菜，同时设置空白对照处理，用量均为2升/亩，在苗期冲施两次，结果如表9所示。
[0101]
表9
[0102][0103]
由表9可知，收获时，与空白对照相比，芹菜分别增产18.81％和22.5％，芹菜立枯
病减少了75.2％和80.6％，菌核病分别减少了76.7％和89.2％。