专利名称:超雄鱼与生理雌鱼交配建立超雄黄颡鱼繁育种群的方法
技术领域：
超雄鱼与生理雌鱼交配建立雄黄颡鱼繁育种群的方法属于一种鱼类生理遗传繁殖的方法，是以人工性逆转、筛选、测交与扩群等技术控制鱼类性别技术领域：
。
背景技术：
生产单性雄有几种方法可供选择(Aquaculture2001，197 =283-301)如人工挑选、 雄性激素直接诱导性逆转、雄核发育、种间杂交、人工诱导三倍体以及遗传学方法等。但因人工挑选的劳动强度大，而且不能准确区分雌雄鱼。用性激素直接诱导性逆转，有性激素残留的危险，许多国家早已禁用。雄核发育则存在诱导率、成活率低以及YY早生理雌鱼生育力极低等严重的技术障碍，只停留在实验阶段，尚无成功例子。而人工诱导三倍休不能做到100%的单性，只有罗非鱼种间杂交与遗传学方法取得成功，在生产上推广应用。但种间杂交只限于罗非鱼属的几个杂交组合，产卵率较低。只有称为GMT的遗传学技术，适用于雄性配子异型的鱼类，方法可靠、稳定，而且对环境友好，无任何不良的影响，可以大量生产全雄鱼。早在上世纪五、六十年代，日本Yamamoto (Genetics40 :406-419, Exp. Zool. 137 227-262, Genetics55 :329-336)在研究青鏘性别决定与伴性遗传时，利用雌性激素将XY古雄鱼逆转成XY ^生理雌鱼，并与XY $雄鱼交配，首次获得YY $超雄鱼，证明YY $超雄鱼是可以存活的，而且可以雌性化，成为YY $生理超雌鱼，YY早生理超雌鱼与YY $超雄鱼交配便可大量产生YY $超雄雌鱼。1980年，我国杨永铨(遗传学报，1980，7 C3) =241-246)等应用三系配套途径生产遗传上全雄莫桑比克罗非鱼获得成功，基本上就是利用性激素性逆转与后代测交的方法，获得YY $超雄鱼；1989年，Varadaraj等也提出类似的方法获得YY古超雄莫桑比克罗非鱼。此后，Mair 等 1988、Baroillerant Jalabit 1989、Scoff 等 1989 年也相继发表有关研究论文提出相同的方法，获得YY $超雄尼罗罗非鱼(Wi.D. thesis. University of maies. Swansea、Aquat. Living Resour. 2 :105_116、Aquaculture, 78 : 235-257)在这些工作的基础上，Mair (Aquat. Sci. 54 :396-404)等1997年报道了规模生产全雄尼罗罗非鱼的育种计划，他们的研究结果，也就是所谓的全雄鱼遗传操作技术(_)。 该技术是通过五代半激素性逆转和后代测交最后获得YY $超雄鱼和YY早生理超雌鱼，并由YY $超雄鱼和XX早普通雌鱼生产XY $全雄鱼。采用这种技术的育种周期较长，而且逐代测交的试验鱼必须严格管理，防止混杂，才能最后取得成功。可见，对于世代周期较长的鱼类而言，就未必是首选的方法，必须采用其他较为有效的技术手段。1989年，Varadaraj. K. (Current ScienceVol. 58, NO,8 =434-441)等报道了激素性逆转结合雌核发育技术产生超雄莫桑比克罗非鱼，这种技术据称可将YY $超雄鱼的产出从25%提高到50%，并可缩短 22 8个月的育种时间，并提出商业上大规模生产全雄鱼的方案。但未见在生产上推广应用的报道。至于黄颡鱼的性逆转与雌核发育以及YY $超雄鱼、全雄鱼均未见报道。中科院水生所曾于2006. 12. 28就《性逆转与雌核发育持续生产全雄黄颡鱼方法》申请了专利(申请号200610166518. 8，公开号CN1994027A)。刘汉勤等首次提到采用性逆转与雌核发育相结合的集成技术，建立持续生产超雄黄颡鱼YY 与全雄黄颡鱼XY 的繁育体系(水生生物学报，2007，31 (5) :98-101)。它与国外GMT遗传学技术相比，可缩短育种周期两代，提高超雄鱼产出率1倍左右。
从以上所引用的文件可知报道了生产单性雄鱼的若干种方法；利用雌性激素将雄鱼逆转成生理雌鱼，经交配、测交可获得超雄鱼；利用全雄鱼遗传操作技术(GMT)、经过若干代的激素性逆转和后代测交最后获得YY $超雄鱼和YY早生理超雌鱼，并可生产XY古全雄鱼；公开了运用性逆转与雌核发育持续生产全雄黄颡鱼的方法。这些发明创造促进了鱼类细胞工程育种和人工性别控制技术的发展。但同时还存在以下问题雌核发育冷休克处理对遗传物质有损伤；二信体雌核发育鱼的存活率不理想；规模生产尚待改进；育种周期有待缩短。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是1.采用YY $超雄黄颡鱼与性逆转的XY早生理雌鱼交配，提高YY纟超雄鱼的产量。2.节省雌核发育工序，降低人工诱导雌核发育对受精卵遗传物质的损害，提高YY 超雄鱼的获得率。3.利用性逆转XY早生理雌鱼与YY $超雄鱼或XY $雄鱼交配结合后代测交、性比分析等技术手段的组合缩短育种时间。
为此，本发明采用的技术方案是一种方法，它按以下工序进行
1.人工催产与人工授精取体表无伤、腹部膨大、柔软的普通雌黄颡鱼，使用催产剂HCG和LRH-A2对每条鱼胸鳍基部进行一次注射，剂量为HCG800 1000IU+LRH_A25 8 μ g/尾，将其置于^TC的水中，经M 28小时后可挤出成熟的卵子，将之置于冰浴上低温保存备用；选取生殖突微红的雄鱼注射HCG和LRH-A2减半的催产剂，对其进行解剖取出精巢，用剪刀将它剪碎，再用精子保存液洗滤出精子，将之置于冰浴上低温保存备用；取卵子与精子混合进行干法人工受精；把受精卵子置于27°C生化培养箱中恒温孵育成雄鱼和雌鱼鱼苗并全部出膜；待卵黄吸收后，鱼苗用卤虫幼体作为开口铒料。
2.性逆转将普通雄性黄颡鱼性逆转成生理雌鱼，以卤虫幼体作为雌激素载体， 将其在100 200μ g/L的17-α乙炔基雌二醇溶液中浸泡1小时，再抽滤取出富集雌激素的卤虫投喂已开口摄食的人工繁殖黄颡鱼苗，每天上午、下午和晚上各投喂一次，投喂量以 30分钟内吃完为准，连续投喂40天，经雌性激素处理后成活的鱼苗中约50%的XY $雄鱼性逆转成为XY早生理雌鱼，XX早雌鱼不变，将性逆转的幼鱼转移至水泥池用中甲鱼饲料养至性成熟。
3.测交与性逆转将XY早生理雌鱼与YY $超雄鱼或XY $普通雄鱼测交，筛选 XY早生理雌鱼
3. 1人工催产取性成熟的侯选XY早生理雌鱼和普通雌鱼进行常规的人工催产。
3. 2人工授精将每尾雌鱼卵子分成两份，一份与XY $雄鱼精子授精，另一份与 YY $超雄鱼精子授精。
3. 3性比分析侯选超雄鱼和生理超雌鱼备用与性逆转受精卵子孵化出鱼苗后， 将每个交配组合的鱼苗又分成两份，分别暂养于网箱中，取其中三分之一鱼苗用卤虫幼体和甲鱼饲料喂养至三个月后，取出30 50尾幼鱼逐尾腹腔注射冰醋酸固定液，解剖后便可从性腺形态上鉴别精巢或卵巢，分析性别比例；其余的幼鱼移入水泥池中养到性成熟作为侯选的YY 超雄鱼备用。另外的三分之二的鱼苗，使用雌激素诱导性逆转的方法，经激素处理40天后再移入水泥池中养到性成熟，作为侯选的YY早生理超雌鱼备用。
3. 4侯选鱼性别的确认
3. 4. IXY早生理雌鱼的测交与性比分析及XY早生理雌鱼的确认，将XY早生理雌鱼与XY $普通雄鱼交配，产生25% XX早普通雌鱼，50% XY $雄鱼和25% YY $超雄鱼，性比分析结果，确认XY早生理雌鱼，即XY早XXY $ 3. 4. 2XX早普通雌鱼的后代测交、性比分析及XX早普通雌鱼的确认将XX早普通雌鱼与XY $普通雄鱼交配，其后代雌雄鱼各为50%，根据性比分析可以确认受试鱼是否为 XX早普通雌鱼，即XX早XXY $ — 50% XX早+50% XY $，比较两个交配组合的性别比例， 便可确定侯选鱼的遗传性别，筛选出XY早生理雌鱼备用，被确认为XX早普通雌鱼的弃之。
4.测交、筛选、鉴定YY $超雄鱼与YY早生理超雌鱼
4. IYY $超雄鱼的测定取工序3. 3性成熟的YY $超雄鱼与XX早普通雌鱼交配， 如XX早XYY古一100% XY古，则可确认受试鱼为YY古超雄鱼；如XX早XXY $ 4. 2YY早生理超雌鱼的测交取工序3. 3性成熟的侯选YY早生理超雌鱼与XY古普通雄鱼交配，则YY早XXY $ 4. 3筛选、鉴定按照两个交配组合后代测交性比分析，可鉴定出侯选受试鱼的遗传性别，筛选出YY $超雄鱼和YY早生理超雌鱼备用。
5.扩群YY $超雄鱼与YY早生理超雌鱼繁育种群的快速扩群，取工序4已被确认的YY 超雄鱼与YY早生理超雌鱼交配，产生100% YY $超雄鱼，在鱼苗开口时，取一部分YY t超雄鱼苗按工序2，用雌激素诱导性逆转成为YY早生理超雌鱼，即 YY 早 XYY 6 — 100%YY早生理超雌鱼。
6.全雄鱼制种以XX早普通雌鱼与YY超雄鱼交配，则可规模化生产XY $全雄黄颡鱼，即XX早XYY $ — 100% XY $全雄黄颡鱼。
该发明与现有技术相比较，具有以下的有益效果
第一，采用YY $超雄黄颡鱼与性逆转的XY早生理雌鱼交配，产生50%的YY $超雄鱼，和用XY早生理雌鱼与XY 雄鱼交配所产生的25% YY $超雄鱼的产量相比较提高了一倍。
第二，因节省了雌核发育工序，可以降低人工诱导雌核发育对受精卵遗传物质的损伤，提高了 YY $超雄鱼的获得率。
第三，由于采用了 XY $生理雌鱼与YY $超雄鱼或XY $普通雄鱼交配法，可以迅速获得大量的YY 超雄鱼，产品可批量进行。并提高超雄鱼的遗传多样性，是超雄鱼的长期多代持续利用的技术手段之一。
第四，也正是利用了性逆转XY早生理雌鱼与YY $超雄鱼或XY $普通雄鱼交配和结合后代测交性比分析，使筛选XY早生理雌鱼、YY $超雄鱼、YY早生理超雌鱼过程，只需 3代就可以建立超雄黄颡鱼的繁育种群，它适用于雄性配子异型鱼类超雄鱼、全雄鱼的繁育体系的建立。该技术比国外的GMT技术缩短了二代半育种时间；与性逆转结合雌核发育技术相比较，则节省了半代时间，可见，这种繁育种群的方法是快速的、有效的。
鉴此，本发明具有广泛的应用前景。
附图为《超雄鱼与生理雌鱼交配建立超黄颡鱼繁育种群的方法》的工序流程方框图。它由以下各部分方框图组成
1.人工催产与人工授精
2.性逆转
3.测交与性逆转
4.测交、筛选、鉴定
5.扩群
6.全雄鱼制种
框图之间的实线和虚线具有同等的功能，但它们之间互不连通。
具体实施方式
申请人:认为参照附图所示的工序是实现本发明的优选方式。这些工序的具体内容如下
1.人工催产与人工授精根据实验或工业化生产的需要，取若干数量的体表无伤、腹部膨大、柔软的普通雌黄颡鱼，给每条鱼胸鳍基部进行一次注射，使用的催产剂及剂量如下HCG900IU+LRH-A26 μ g/尾，催产剂HCG和LRH-A2均为杭州动物药品厂和萧山第一兽药制造有限公司的产品。将鱼置于^rc的水中，经约沈小时后可挤出成熟的卵子，将之置于冰浴上低温保存备用。同时选取生殖突微红的雄鱼注射减半的同样催产剂，因其精巢结构呈树枝状，催产后挤不出精液，需要解剖取出精巢，用剪刀剪碎后用精子保存液洗滤出精子，仍置于冰溶上低温保存备用。根据需要取数百至千粒卵子与精子混合进行干法人工受精，受精卵在27°c生化培养箱中恒温孵育至鱼苗全部出膜。待卵黄吸收后，鱼苗用卤虫幼体作为开口铒料。
2.性逆转将普通雄性黄颡鱼性逆转成生理雌鱼，以卤虫幼体作为雌激素载体， 将其先在150μ g/L的17-α乙炔基雌二醇(Ε& ；Sigma)溶液中浸泡1小时，再抽滤取出富集雌激素的卤虫投喂已开口摄食的人工繁殖黄颡鱼苗，每天上午、下午和晚上各投喂一次， 投喂量以30分钟内吃完为准。连续所投喂40天，实验证明成活率为60%以上，性逆转率达 95%以上，由于黄颡鱼是雄性配子异型的鱼类，其性别体制是XX早/XY $，雌雄鱼的比例近似为1 1。所以，经性激素处理后成活的鱼苗中，约有50%是XY $雄鱼性逆转成XY早生理雌鱼，将其与经激素性逆转后的幼鱼一并转移至水泥池中，用蛋白质含量为43%的甲鱼饲料养至性成熟。
3.测交与性逆转将XY早生理雌鱼与YY $超雄鱼或XY $普通雄鱼测交，筛选 XY早生理雌鱼。可分为以下步骤进行
3. 1人工催产取性成熟的侯选XY早生理雌鱼(包括XX早雌鱼)，按工序1中所述常规方法进行人工催产。
3. 2人工受精把每尾雌鱼卵分成两份，一份卵子与XY $雄鱼精子授精；另一份卵子与YY $超雄鱼精子授精。
3. 3性比分析、侯选超雄(雌)鱼留用与性逆转受精卵孵出鱼苗后，将每个交配组合的鱼苗又分成两份，分别暂养于1平方米的网箱中，取其中的三分之一鱼苗用卤虫幼体用甲鱼饲料喂养至三个月后，取出30 50尾幼鱼逐尾腹腔注射冰醋酸固定液，解剖后即可准确从性腺形态上鉴别精巢或卵巢，分析性别比例。其余的幼鱼移到水泥池中养到性成熟作为侯选的YY 超雄鱼备用；另外三分之二的鱼苗使用雌激素诱导性逆转的方法，经雌激素处理40天后，再移入水泥池中养到性成熟，作为侯选的YY早生理超雌鱼备用。
3. 4侯选鱼性别的确认
3. 4. IXY早生理雌鱼的测交与性比分析，XY早生理雌鱼的确认ΧΥ早生理雌鱼与XY $普通雄鱼交配，由于染色体(基因)重组，产生25% XX早普通雌鱼，50% XY $雄鱼和25% YY $超雄鱼。根据性比分析结果，确认XY早生理雌鱼，即XY早XXY $ — 25% XX 早 +50% XY 古 +25% YY 古。
3. 4. 2ΧΧ早普通雌鱼的测交与性比分析，XX早普通雌鱼的确认将XX早普通雌鱼与XY $普通雄鱼交配，由于黄颡鱼是雄性配子异型的鱼类，其后代雌雄鱼各为50%。 根据后代性比分析结果可以确认受试鱼是否为XX早普通雌鱼，即XX早XXY $-50% XX 早 +50% XY 古。
比较3. 4. 1与3. 4. 2两种交配组合的性别比例，即可确定侯选鱼的遗传性别，筛选出XY早生理雌鱼备用，被确认为XX早普通雌鱼的弃之。
4.测定、筛选、鉴定YY $超雄鱼与YY早生理超雌鱼
4. IYY $超雄鱼的测定取工序3. 3中性成熟的侯选YY $超雄鱼与XX早普通雌鱼交配，应产生100% XY $普通雄鱼，当XX早XYY $ 4. 2YY早生理超雌鱼的测交取工序3. 3中性成熟的侯选YY早生理超雌鱼与XY古普通雄鱼交配，因染色体(基因)重组，应产生100%的雄鱼，其中50% XY $普通雄鱼，50% YY $超雄鱼。而XY早生理雌鱼与XY $普通雄鱼交配，则出现25% XX早雌鱼，75%雄鱼(其中 50% XY 古,25% YY 古)。艮口 =YY 早 XXY 古一50% XY 古 +50% YY 古，XY 早 XXY 古一25% XX 早 +50% XY 古 +25% YY 古。
4. 3筛选、鉴定按照两个交配组合后代测交性分析，可鉴定出侯选受试鱼的遗传性别，筛选出YY t超雄鱼和YY早生理超雌鱼备用。
5.扩群是利用YY $超雄鱼与YY早生理超雌鱼繁育种群的快速扩群，取工序4 中已被确认的YY $超雄鱼与YY早生理超雌鱼交配，产生100% YY $超雄鱼，当鱼苗开口时，取一部分YY早超雄鱼苗按工序2，用雌激素诱导性逆转成为YY早生理超雌鱼，即 YY早X YY $ -100%ΥΥ早生理超雌鱼。
6.全雄鱼制种用XX早普通雌鱼与YY $超雄鱼交配，则可规模化生产XY $全雄黄颡鱼，即XX早XYY $ — 100% XY $全雄鱼。
权利要求
1. 一种超雄鱼与生理雌鱼交配建立超雄黄颡鱼繁育种群的方法，包括黄颡鱼人工催产、人工授精、将雄性黄颡鱼性逆转成生理雌鱼、测交，该繁育种群的方法的特征是按以下工序进行(1)人工催产与人工授精取体表无伤、腹部膨大、柔软的普通雌黄颡鱼，使用催产剂 HCG和LRH-A2对每条鱼胸鳍基部进行一次注射，剂量为HCG800 1000IU+LRH_A25 8 μ g/ 尾，将其置于^TC的水中，经M 28小时后可挤出成熟的卵子，将之置于冰浴上低温保存备用；选取生殖突微红的雄鱼注射HCG和LRH-A2减半的催产剂，对其进行解剖取出精巢，用剪刀将它剪碎，再用精子保存液洗滤出精子，将之置于冰浴上低温保存备用；取卵子与精子混合进行干法人工受精；把受精卵子置于27°C生化培养箱中恒温孵育成雄鱼和雌鱼苗并全部出膜；待卵黄吸收后，鱼苗用卤虫幼体作为开口铒料；(2)性逆转将普通雄性黄颡鱼性逆转成生理雌鱼，以卤虫幼体作为雌激素载体，将其在100 200μ g/L的17-α乙炔基雌二醇溶液中浸泡1小时，再抽滤取出富集雌激素的卤虫投喂已开口摄食的人工繁殖黄颡鱼苗，每天上午、下午和晚上各投喂一次，投喂量以30 分钟内吃完为准，连续投喂40天，经雌性激素处理后成活的鱼苗中约50 %的XY $雄鱼性逆转成为XY早生理雌鱼，而XX早雌鱼不变，将性逆转的幼鱼转移至水泥池中用甲鱼饲料养至性成熟；(3)测交与性逆转将XY早生理雌鱼与YY$超雄鱼或XY $普通雄鱼测交，筛选XY早生理雌鱼(3. 1)人工催产取性成熟的侯选XY早生理雌鱼和普通雌鱼进行常规的人工催产；(3.2)人工授精将每尾雌鱼卵子分成两份，一份与XY 雄鱼精子授精，另一份与 YY $超雄鱼精子授精；(3. 3)性比分析侯选超雄鱼和生理超雌鱼备用与性逆转——受精卵子孵化出鱼苗后， 将每个交配组合的鱼苗又分成两份，分别暂养于网箱中，取其中三分之一鱼苗用卤虫幼体和甲鱼饲料喂养至三个月后，取出30 50尾幼鱼逐尾腹腔注射冰醋酸固定液，解剖后便可从性腺形态上鉴别精巢或卵巢，分析性别比例；其余的幼鱼移入水泥池中养到性成熟作为侯选的YY 超雄鱼备用；另外的三分之二的鱼苗，使用雌激素诱导性逆转的方法，经雌激素处理40天后再移入水泥池中养到性成熟，作为侯选的YY早生理超雌鱼备用；(3. 4)侯选鱼性别的确认(3. 4. 1) XY早生理雌鱼的测交与性比分析及XY早生理雌鱼的确认，将XY早生理雌鱼与 XY $普通雄鱼交配，产生25% XX早普通雌鱼，50% XY $雄鱼和25% YY $超雄鱼，性比分析结果，确认XY早生理雌鱼，即XY早XXY $ — 25% XX早+50% XY $ +25% YY $ ；(3. 4. 2)XX早普通雌鱼的后代测交、性比分析及XX早普通雌鱼的确认将XX早普通雌鱼与XY $普通雄鱼交配，其后代雌雄鱼各为50%，根据性比分析可以确认受试鱼是否为 XX早普通雌鱼，即XX早XXY $ — 50% XX早+50% XY $，比较两个交配组合的性别比例， 便可确定侯选鱼的遗传性别，筛选出XY早生理雌鱼备用，被确认为XX早普通雌鱼的弃之；(4)测交、筛选、鉴定YY$超雄鱼与YY早生理超雌鱼(4. 1)ΥΥ t超雄鱼的测定取工序(3. 3)性成熟的YY t超雄鱼与XX早普通雌鱼交配， 如XX早XYY $专利摘要
超雄鱼与生理雌鱼交配建立超雄黄颡鱼繁育种群的方法属鱼类生理遗传学，它以人工性逆转、筛选、测交和扩群等手段，控制鱼类性别的技术领域：
。要解决的技术问题是用超雄鱼与性逆转的生理雌鱼交配；节省雌核发育工序；利用性逆转生理雌鱼与超雄鱼或雄鱼交配、性比分析、测交等技术组合缩短育种时间。采用技术方案人工催产、授精；性逆转，将雄鱼性逆转成生理雌鱼；测交性逆转，将生理雌鱼与超雄或普通雄鱼测交，筛选生理雌鱼与超雌鱼，它含人工催产与授精，性比分析，侯选鱼性别的确认；后代的测定、筛选、鉴定；扩群，即超雄鱼与生理超雌鱼繁育种群的扩群；全雄鱼制种，以普通雌鱼与超雄鱼交配，生产全雄鱼。该法用于超雄黄颡鱼种群的繁育和批量生产。
文档编号A01K61/00GKCN101390503 B发布类型授权 专利申请号CN 200810197519
公开日2011年9月14日 申请日期2008年11月3日
发明者刘汉勤, 陈宏溪, 徐江, 侯昌春 申请人:水利部中国科学院水工程生态研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (5),