专利名称：新的真菌菌株及其在抗生素生产中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的，基因工程化的真菌菌株，及其在制备抗生素中的应用。具体地说，本发明涉及新的，基因工程化的曲霉菌株及其在制备洛伐他汀(lovastatin)药物及其类似物中的应用。
洛伐他汀化学上是[1S-[1α(R＊)，3α，7β，8β(2S＊，4S＊)，8αβ]]-2-甲基丁酸 1，2，3，7，8，8α-六氢-3，7-二甲基-8-[2-(四氢-4-羟基-6-氧-2H-吡喃-2-基)-乙基-1-萘基酯，并具有下列化学结构式
它可用作抗高胆固醇血症剂，并且是胆固醇生物合成的限速酶-HMG-CoA还原酶的有效抑制剂。它是使用选择的真菌菌株经发酵过程而产生的真菌代谢产物。
抗生素如洛伐他汀是需要几组酶参予其合成的代谢产物。为了通过分子克隆能产生抗生素的微生物的方法生产这些抗生素，需要分离、分析，并且或许还要修饰这些酶的相应基因。基于从真菌中分离这些基因的尝试，迄今已得到了携带其中个别基因或只携带不完整基因的克隆(参见MalpartidaandHopwood，"MolecularCloningoftheWholeBiosyntheticPathwayofaStreptomycesAntibioticanditsExpressioninaHeterologousHost"，Nature(1984)，309，PP.462～464)。
加拿大专利1，129，794(Endo)描述了使用真菌菌种Monacusruber的菌株发酵制备洛伐他汀的方法。
加拿大专利1，161，380(Monaghanetal.)描述了使用土曲霉(Aspergillusterreus)的菌株发酵制备洛伐他汀的方法。
在这些现有方法中，洛伐他汀是与其它以大量存在的相似化合物一起产生的，为此必须从中分离之。在使Monacusruber生产洛伐他汀时，可同时产生有红曲霉素J。在用土曲霉生产洛伐他汀时，可同时产生有二氢洛伐他汀和羟酸。虽然羟酸可以很容易地内酯化为洛伐他汀，但必须从中分离出二氢洛伐他汀。
本发明的目的是提供新的、基因工程化的，能用于发酵生产洛伐汀的突变真菌菌株。
本发明的再一个目的是提供使用这些菌株发酵生产洛伐他汀的新方法。
根据本发明的一个方面，提供了适当曲霉属之菌种的一个新的突变真菌菌株，该菌株能够表达并分泌洛伐他汀。这些菌株含有来源于能产生洛伐他汀的土曲霉菌株DNA的一组功能相关之洛伐他汀生产酶的基因。这些突变菌株的产生方法是，用另一选自米曲霉(A.oryzae)、烟曲霉(A.fumigatus)、黑曲霉(A.niger)、构巢曲霉(A.nidulans)和黄曲霉(A.flavus)的非洛伐他汀生产曲霉菌种对得自产生洛伐他汀的土曲霉菌株的，并含有适当可选择标志的DNA，进行原生质转化，基于可选择标志选择如此形成的转化体，鉴定和分离洛伐他汀生产转化体并再克隆之。
根据本发明的另一方面，提供了制备洛伐他汀的方法，该方法包括将含有来源于土曲霉菌株的，编码一组洛伐他汀生产酶的基团的曲霉属微生物转化体在营养培养基中发酵。并回收如此生成的洛伐他汀。
与使用土曲霉株的方法相比，本发明的方法可产生只含明显较小量二氢洛伐他汀和羟酸衍生物的洛伐他汀。
在制备本发明转化体的过程中，可使用选择的、非洛伐他汀生产曲霉菌株制备原生质体的标准技术，以及从洛伐他汀生产土曲霉菌株中提取DNA的标准技术。这些技术是本领域技术人员熟知的，这里无需详细讨论。同样，本文所用的原生质体转化的技术和方法也是已知的和常规使用的。
优选的非洛伐他汀生产曲霉属菌株是米曲霉的菌株，但这对于成功地实现本发明并不是很严格的。也可使用其他曲霉菌种，如黑曲霉、构巢曲霉、烟曲霉及黄曲霉。以米曲霉作为优选菌种是考虑到该霉菌菌种在实验室和工业规模发酵条件下易于操作并且安全。
为了在进行原生质体转化后，从非转化体中选择出转化的微生物、土曲霉的DNA应含有可选择的标志。有多种不同的市场上可购得的可选择标志供熟练技术人员选择，而选用何种标志对于成功地完成本发明并不是关键的。可使用氨苄青霉素抗性、利福平抗性、链霉素抗性等抗生素抗性标志，并可在含有适当抗生素的培养基中培养转化体和非转化体的混合物，从而只使含有可选择标志的转化体在该培养基中存活并得以分离之。
为方便起见，特别优选的可选择标志是放线菌酮抗性标志。放线菌酮是一种蛋白质合成的抑制剂，从而可很容易地检测培养物中放线菌酮放线菌株或转化体的存在。
在基于可选择标志选择转化体之后，再根据它们表达和分泌洛伐他汀的能力筛选之。在原生质体转化过程中所产生的转化体中，只有少数具有这种能力。可在标准培养液中培养这些转化体，并用例如HPLC方法分析所得培养基中洛伐他汀的存在来识别它们。然后再次培养并增殖在上述分析中呈阳性的转化体，以产生新的、能生产洛伐他汀的曲霉属，更好是米曲霉种的转化之真菌微生物的菌落。
下列实验实施例在于进一步举例说明本发明。
在附图中
图1图解显示对按下列实施例1所述方法产生的粗制真菌提取物进行HPLC分析的结果;
图2显示从杂交菌株得到并纯化的洛伐他洛化合物的1H-NMR图谱;
图3显示同一化合物的质谱;
图4显示新的转化体AoAt/NBJ-V的形态学特征。
实施例1材料和方法真菌培养物用于本研究的土曲霉和米曲霉真菌分离物是从收集自AgricultureCanada，ResearchStation，Beaverlodge，Alberta，Canada的淡紫色土壤样品中分离的。
选择放线菌酮抗性突变体于28±2℃，使两种曲霉菌种分离物在含有放线菌酮(浓度0.1-5mM)的Czapek′s dox培养基上培养6天后，将所得土曲霉和米曲霉分离物的孢子(108)分散于含10mM放线菌酮的Czapek′s dox培养液(50ml)上并保温30分钟，于10，000g离心10分钟，然后重新悬浮于无菌蒸馏水中。经搅拌并重新离心沉淀将孢子洗3次。然后将孢子悬浮于无菌的1%(v/v)Triton X-100溶液中，并以一等份加于血细胞计数器上检测其数目。将适当的稀释液分散于含10mM放线菌酮选择培养基上，并于28±2℃下保温，10天后分离抗性突变体。检测分离物的洛伐他汀产生能力。分离能产生洛伐他汀的放线菌酮抗性土曲霉分离物，用以作进一步的转化研究。
原生质体和DNA制备在50mlCzapek′sdox培养液中分别培养米曲霉和产生洛伐他汀的放线菌酮抗性土曲霉(本文中称为JAG-4703)分离物。于28±2℃，在旋转振荡器(NewBrunswickScientificInc.)上，以200rpm将培养物保温58小时，然后收获并借助反复离心用无菌蒸馏水洗这些培养物。
基本上按Dickinson和Isenberg[J.GenMicrobiol，128，pp.651-654(1982)]所述的方法。在10-12小时消化期间使用Novozym234(NovoNordisk，NOVOAlle，DK2880，BagsvaerdDenmark)除去细胞壁，以制得两种曲霉培养物的原生质体。各曲霉菌种的原生质体等分样品在含有0.1g琼脂(Difco)、5g山梨糖和0.35gEDTA(在50ml蒸馏水中)的再生培养基(R)中于28℃保温24小时后，再生出活的、单细胞带壁的孢子。萌发后，这些孢子均出现其亲代的所有培养特征。
按照Schlief和Wensink[“PracticalMethodsinMolecularBiology”，33，21-29(1981)]所述的方法从土曲霉原生质体中分离总DNA。将原生质体悬浮在由10mg/mlSDS、0.1MNaCl和0.1MTris-HCl(PH9.0)组成的溶液中。加入等体积用Tris-HCl缓冲液饱和的苯酚。在Eppendorf离心管(BrinkmannInstruments，CanadaLtd.，Rexdale，Ontario)中将混合物以12，000g离心10分钟。除去含DNA的上面水相，与95%乙醇混合，于-20℃下放置60分钟，然后按前述条件离心10分钟。将沉淀物重新悬浮在缓冲液(PH7.0)中，与核糖核酸酶(SigmaSt.Louis，MO，USA)一起保温，用苯酚处理并从水相中沉淀出DNA。将所得DNA吸附于在10mMTris-HCl缓冲液(PH7.5)和0.3MNaCl中预浸渍并含在吸管内的DEAE-纤维素(DE-52，Whatman)上，然后洗出以纯化分离的DNA。其中用含有1.5MNaCl的10mMTris-HCl缓冲液(PH7.5)洗脱DNA。将该溶液稀释到0.2MNaCl并用2倍体积的乙醇沉淀DNA。经测定A260/A280吸光率比值，从200-320nm谱段估测DNA的纯度。只将这一比值在1.50至2.00之间的DNA用于转化。在再生培养基中保温各0.1mg分离之DNA的6份样品，以确保没有活的原生质体，且均没有发育成集落。
原生质体-DNA保温在5ml再生培养基(其组成如上所述)中将大约5.2×104个米曲霉原生质体(根据血细胞计数器的计数结果估测之)，与10-100ng土曲霉DNA一起保温，并按上述方法使之再生。为了研究DNA对洛伐他汀表达的可能的化学影响，将10-100μg小牛胸腺DNA(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)、DNA(Bethesda Research Laboratories，Gaitherberg，MD，USA)和同源米曲霉DNA与相似量的米曲霉原生质体一起保温。当在保温混合物中包括DNA时，原生质体再生降低到10%以下，并有差不多数目如此处理的原生质体(105)没有产生任何放线菌酮抗性。
洛伐他汀产生及检测在含有10mM放线菌酮的Czapek′sdox琼脂培养基上保温从已与土曲霉DNA保温的米曲霉原生质体发育而成之孢子的悬浮液。于28±2℃保温48小时后，培养物达到直径6-8mm。在这些条件下，它们各自都是从单一孢子发育而成的。有Czapek′s培养基(在500mlErlenmeyer培养瓶中含50ml)上分别保温这些在放线菌酮培养基上生长过的孢子，并于28±2℃在旋转振荡器(200rpm)上保温12天。按下述程序和HPLC分析法检测各生长培养基内洛伐他汀的产生情况。
提取用17NHCl将发酵的培养液(50ml)酸化到PH4.0，然后对乙酸乙酯(100ml，3×)分级分离。于30℃下真空干燥合并的乙酸乙酯部分，将残留物收集到乙腈(5ml)中，然后进行HPLC分析。
HPLC分析HPLC装置(BeckmanModel420)由BeckmanInstruments，Toronto，Canada提供，并由一个Altex泵(110A型)和注射阀组成。LC-UV检测仪定在237nm。使用hypersilC-180DS硅胶柱(25×0.46cm，i.d.)和流速为1.0ml/分钟的乙腈和水(55∶45，v/v)溶剂系统。根据所作的标准洛伐他汀曲线比较所产生的洛伐他汀并定量分析之。
实施例1-结果5.2×105个米曲霉原生质体与得自放线菌酮抗性土曲霉的洛伐他汀生产突变体的DNA共保温后，得到79个放线菌酮抗性分离物，且其中包括4个洛伐他汀生产分离物。转化实验进行了六次。
结果在下列表1中给出。
表1与得自放线菌酮抗性并产生洛伐他汀的土曲霉突变体的DNA一起保温过的放线菌酮抗性并表达洛伐他汀的米曲霉原生质体实验#原生质体(ml)原生质体融合后再生DNA洛伐他汀再生的原生质体率(ng)生产分离数(#/ml)(%)物的数目i) 7.4×1054.1×10556 100 0ii) 5.2×1053.1×10560 75 2iii) 5.2×1053.7×10572 50 2iv) 4.0×1052.7×10570 25 0v) 2.6×1051.5×10565 10 0vi) 1.6×1051.1×10570 0 0一个转化的培养物AO-Ⅱ，其原始转化的特性保持了6个月。
图1显示对得自米曲霉受体和供体的培养物，以及用土曲霉DNA处理之米曲霉培养物的提取物进行HPLC分析的结果。下列表2中显示被转化的分离体产生洛伐他汀的量。
表2在Czapek′sdox培养液(PH6.8)中被转化的米曲霉分离物的洛伐他汀产生量分离物洛伐他汀产率(mg/l)AO-I15.36±1.78AO-II26.89±3.76AO-III13.46±4.56AO-IV9.67±0.75分离物No.AO-Ⅰ再培养5次，以产生转化体AoAt-NBJ/5，该转化体已于1992年2月25日作为活的、永久培养物保藏在AmericanTypeCultureCollection，保藏登记号为ATCC74135。
洛伐他汀是以与其羟酸类似物结合的形式产生的，后者可借助例如在甲苯中回流，以完成内酯化等方法很容易地转化成洛伐他汀，从而提高洛伐他汀的产率。这些实验中没有进行内酯化转化。
土曲霉亲代培养物在Czapek′sdox培养液中产生的洛伐他汀为166.72±5.92mg/L，而亲代米曲霉没产生任何洛伐他汀。
附图2显示用HPLC方法纯化的杂交菌株产生之洛伐他汀化合物的1H-NMR谱。经与已知的洛伐他汀的标准谱线比较，证明所得产物与标准产品完全相同。
附图3是同一产物的质谱，并表明所得洛伐他汀的纯度为99%。
培养基中DNA的浓度范围为每毫升5-20ng时，即不影响米曲霉原生质的再生能力，也不影响与土曲霉DNA保温后放射菌酮抗性和产生洛伐他汀之分离物的回收率。数据表明，这些浓度并不是洛伐他汀生产中的限制因素。与未处理的对照组比较培养基中浓度在每毫升5ng至5μg的小牛胸腺DNA，DNA和同源米曲霉DNA同样不影响米曲霉原生质体的再生。然而，培养基中DNA浓度为10-100μg/ml时，可分别使再生能力降低至最大26%和1%。这些DNA处理没有引发洛伐他汀表达。
使用更复杂的无机盐培养基，该再生培养基产生了大量与Acha等人(J.Gen.Microbiol.，45，515-523(1966))得到者差不多的原生质体。分生孢子和新鲜发芽的分生孢子可比菌丝体产生更高得率的存活原生质体及DNA。在本系统中没有观察到Acha等人(1966)所描述的原生质体再生期间出现的细胞集聚。负责放线菌酮抗性表达和洛伐他汀表达的因子从土曲霉向米曲霉的表观转移，表明发生了种间DNA的转化。放线菌酮抗性和洛伐他汀生产能力的共转化作用是出人预料的，并提示参预这些特征之表达的基因在物理上很接近并可能是丛聚在一起的。
新的转化体AoAt-NBJ/5的形态学如图4所示，并可鉴定出如下特征AoAt-NBJ/5的形态学分生孢子头呈柱状，淡褐色。分生孢子梗平滑，无色。囊泡半园形，被呈双层排布的瓶梗包至1/2或2/3。分生孢子在Czapek琼脂上迅速长成球园或髓园体的平滑集落，由于分生孢子的生长而呈现被丛卷毛或被茸毛的桂皮褐色。桔黄色渗出物使之由黄色变为褐色。
这些实验证明，原则上一种真菌的遗传确定的抗生素生产特性可在另一种真菌中得以表达。
实施例2-生产方法真菌培养物使用转化的米曲霉(ATCC＃74135)AoAt/NBJ-V培养物生产洛伐他汀。
发酵种子制备将真菌培养物(冻干的瓶装样品)无菌转移到马铃薯-右旋糖琼脂斜面上，并于25℃下培养4-5天。保温结束时，加入10mlTritonX-100(0.01%)溶液，用力搅拌以制备分生孢子悬液，然后将此分生孢子悬液转移到装在培养瓶(容积250ml)内的无菌稻米(50g)上。向培养瓶内另外添加10ml无菌水，强烈搅拌并于28℃下保温5-7天。保温结束时，加入无菌水(50ml)。
使分生孢子悬液通过无菌纱布并将含分生孢子的滤液(1×106个分生孢子/ml)转移到含30L种子培养基的种子发酵器(容积50L)内。种子培养基的组成如下D-葡萄糖20g/L麦芽提取物20g/L新胨(neo-peptone)3g/L自来水1L用10%NaOH调至PH6.8。培养基于121℃下高压灭菌(15psi)15分钟。于28℃，在含80-100%溶解氧的条件下(通气速度0.3-0.5vvm)将种子培养(200rpm)17-20小时。
洛伐他汀的生产将种子(30L)转移到含生产培养基的生产发酵器(工作体积1，000L)内。生产培养基组成如下乳糖60g/LArdaminePH10g/L大豆蛋白2g/LKCL2g/LKH2PO40.8g/LMnSO4·4H2O 0.03g/L甜菜碱0.6g/LP20002ml自来水1L在灭菌之前用105 NaCl/H2SO4调到PH6.8，然后于121℃(15-20psi)高压灭菌1小时。
接种后，在控制PH6.0-6.2(用10%H2SO4)的条件下，使培养于28℃生长7-8天。通气速度保持在0.7-1.0vvm(溶解氧为80-100%)。
第2生产阶段将7天的发酵液(50L)无菌转移到含有1，500L种子培养基(成分如上所示)的种子发酵器(工作体积2，000L)内。使种子于28℃(200rpm;D.0.80-100%)生长24小时。将发酵液(200L)无菌转移到含有18，000L生产培养基的生产发酵器(容积30，000L，工作体积20，000L)内。在控制PH6.0-6.2的条件下使培养物于28℃继续生长7-9天，发酵60小时后，不再控制PH。在发酵5天期间内用种子培养基补充发酵液(速率10L/小时)。种子培养基的组成如下D-葡萄糖285.7g/LArdaminePH71.4g/L大豆蛋白14.3g/L自来水1L灭菌前调PH至6.8，然后于121℃高压灭菌30-45分钟。发酵结束时，用10NHCl将发酵液酸化至PH4.0并离心之。于55℃下干燥真菌沉淀饼并提取之。
提取和纯化加冷乙酸乙酯(10-15分钟)将干燥的真菌饼(20Kg)制成匀浆，并于80-85℃将此匀浆材料回流4-6小时，然后冷却并过滤，真空下将滤液干燥成黑色柏油状材料(2.5-3Kg)。将此黑色柏油状材料与硅胶(2.5Kg)和CH2Cl2(5升)混合。真空蒸发掉CH2Cl2，并将硅胶混合的粗柏油状材料倒在硅胶玻璃柱(长100cm×直径22.5cm)上，并用乙酸乙酯∶己烷(1∶2，v/v)展层。收集样品(2，000jl，12×)24小时后将洗脱溶剂混合物变成乙酸乙酯∶己烷(1∶1，v/v)，并继续层析24小时。收集含产物的样品，干燥(280g)并用甲醇结晶之。
结晶将干燥的黄色产物(280g)溶解在2.8L甲醇中并于60-65℃煮沸40-60分钟。过滤热甲醇混合物并于4℃下将滤液保温4-6小时从母液中分离出白色针状结晶并以冷甲醇淋洗。真空干燥结晶物，称重(190g)并保存在4℃干燥器内。
使用本发明的方法可使洛伐他汀产率高到足可破坏米曲霉转化体的细胞壁，从而以这种方法即可免去在回收洛伐他汀前溶解细胞的步骤。这样即可大大简化后续回收和纯化工艺。如上所述，可用溶剂提取方法回收按本工艺生产的洛伐他汀，而无须在回收过程中形成其酯、盐等。为进行回收和纯化，溶剂提取是比层析法更为简单、更为经济的方法。
虽然已借助特定实验更详细地描述了本发明，但应明确的是，这些实施例并不能构成对本发明的限制。本发明的范围是由待批权利要求限定的。
权利要求
1.制备洛伐他汀的方法，该方法包括发酵含有曲霉属菌株之已转化真菌微生物的营养培养基，并从此营养培养基中回收洛伐他汀，其中所说的曲霉属菌株选自米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、烟曲霉及黄曲霉，所说的菌株不能表达洛伐他汀，但已被转化而含有编码一组能够合成洛伐他汀的酶的和可选择标志的外来DNA。
2.根据权利要求1的方法，其中被转化的微生物含有衍生自洛伐他汀生产土曲霉菌种的外来DNA。
3.根据权利要求2的方法，所说的曲霉菌株是米曲霉种的菌株。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中引入转化体中的外来DNA含有作为可选择标志的放线菌酮抗性基因。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中转化体是本文中描述并限定的AoAi-NBJ/5。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，该方法包括使发酵过程中形成的羟酸类似物内酯化以形成洛伐他汀的附加步骤。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中用溶剂提取法回收洛伐他汀。
8.带有一组能合成洛伐他汀之酶的新的真菌转化体，所说的转化体是选自米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、烟曲霉和黄曲霉之曲霉种的菌株，该菌株天然不能表达洛伐他汀，但含有包括编码一组能合成洛伐他汀之酶的基因的外来DNA。
9.根据权利要求8的真菌转化体，其中曲霉菌种选自米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、和烟曲霉。
10.根据权利要求9的真菌转化体，其中曲霉菌种是米曲霉。
11.根据权利要求10的真菌转化体，其中外来DNA衍生于表达洛伐他汀的土曲霉种的菌株。
12.根据权利要求11的真菌转化体，还包括从所说土曲霉菌株转化到所说米曲霉菌株内的总DNA原生质体的转化产物。
13.如本文所描述并限定的真菌转化体AoAt-NBJ/5。
全文摘要
使用将表达洛伐他汀的土曲霉菌株的DNA引入不表达洛伐他汀的曲霉属菌株如米曲霉菌株内所产生的真菌转化体，以发酵方法生产洛伐他汀。
文档编号A01H1/00GK1076965SQ9310268
公开日1993年10月6日 申请日期1993年2月10日 优先权日1992年2月10日
发明者J·S·达希亚 申请人:诺沃制药有限公司