专利名称：分子标记技术在快速鉴定杂交稻种真伪和纯度方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术在产业方面的应用，确切地说是分子标记(SCAR-Sequence Characterized Amplified Region标记)技术在快速准确鉴定水稻杂交组合/品种真实性和纯度方面的应用。
水稻是我国的主要粮食作物之一。我国自1976年率先推广杂交水稻以来，种植面积不断扩大，目前已占全国水稻种植面积的50％，其产量却占水稻总产量的60％以上。随着杂交水稻种植面积的不断扩大和杂交组合的日益增多，假种坑农事件亦不断出现。假种一方面是制种过程中生物学混杂(如串粉等)以及收获、脱粒、加工、贮运过程中的机械性混杂引起的，另一方面是不法商人为牟取暴利人为造假引起的。这就迫切需要寻找一种快速有效地鉴定杂交水稻组合真实性和纯度的方法。否则不仅会扰乱种子市场给农民和国家造成重大的经济损失，同时也将制约杂交水稻的推广应用。
过去传统的鉴定方法是依据植株的形态特征和田间表现，需要在适宜播种季节前借助温室或异地温暖地区(如海南)进行种植后方能判断。虽然该方法的结论较为可靠，但却耗时费力，不能有效地起到“打假”的作用。
八十年代，我国学者曾利同功酶作标记进行杂交种子的快速鉴定。由于同功酶检测的多态性较少，且易受环境条件的影响，加之杂交稻组合种类增多，该方法已无能为力。
进入九十年代，在分子生物学领域内各种各样的分子标记技术相继问世，尤其是威廉姆斯(Williams)等建立的RAPD(Random amplified poly-morphic DNA)分子标记技术，为实验室快速鉴定杂交稻种子的真实性和纯度提供了一条新的途径。我国学者陈洪等曾利用RAPD技术在300个随机引物中筛选出引物P18能将汕优63及其不育系珍汕97A加以区别。由于汕优63与其不育系珍汕97A在种子外形上完全一致，容易混淆，虽然汕优63与其恢复系明恢63带型一致，但两者在种子外形上差异十分明显，能够肉眼分辨，故该引物在一定范围内可以用来鉴别汕优63(《科学通报》,1996,41(9),833～836)。本院亦曾利用RAPD技术对汕优63及其三系(《安徽农业科学》,1996,24(3),193～195)，协优63及其三系(《安徽农业科学》,1996,24(4),297～298)，汕优63、汕优64、汕优皖3及其相应的三系(《作物学报》，待发表)，以及协优系列杂交水稻组合及其亲本(《安徽农业科学》1999,27(2)，待印刷)的鉴别工作作了大量的研究，也找到了若干个引物可以用来鉴别上述杂交水稻不同组合及其亲本。但由于RAPD技术稳定性和重复性较差，再者，目前我国推广种植的杂交水稻组合很多，不同的组合其适应种植的季节和区域又各有不同，一旦鉴定有误，将直接危害水稻生产。
本发明综合而又有序地使用了分子生物学的相关技术，其目的在于为杂交水稻种子的鉴定提供一种快速、准确且可实际应用的方法。
本发明是这样实现的，对选定的水稻杂交组合及其亲本利用10个碱基的寡核苷酸随机引物进行一系列分子生物学技术处理和实验，依次筛选到RAPD标记，对RAPD标记进行克隆和测序，依此设计并合成特异性PCR(Polymerase Chain Reaction)引物，进而利用SCAR标记对杂交水稻不同组合及其亲本进行快速准确的鉴定。
本方法的具体过程如下首先用DNA提取液自杂交水稻各种组合及其亲本的种粒或新鲜叶片中提取基因组DNA。
提取的基因组DNA同10个碱基寡核苷酸随机引物进行RAPD多态性分析，从中筛选出扩增条带差异明显、直观感强的RAPD标记。将此标记自琼脂糖凝胶中分离、提取后在相同的反应条件下进行RAPD重扩增，从而得到增强的RAPD标记。
将重扩增后的RAPD标记分离、纯化后克隆到载体上，测定其多态性标记的DNA碱基序列，确定其两端的碱基组成。
根据克隆片段两端的碱基序列设计出稳定性较强的特异性双引物(PCR引物)。双引物的碱基序列同RAPD标记两端的碱基互补，其通常是20-30个碱基的寡核苷酸。
利用特异性双引物同欲被鉴定的对象基因组DNA进行PCR反应得到SCAR标记，分析SCAR标记就可鉴定其真实性和纯度。
非限定实施例叙述如下一、特异性双引物设计1．选择我国主栽的杂交水稻组合及其亲本，其组合品种的亲缘关系如表一。
表一实验的品种、组合及亲缘关系
2．基因组DNA的提取取单粒种子研磨至粉末状，加600ul DNA抽提液，50℃条件下水浴一小时，在此期间不断搅拌，4℃静置12小时，10000rpm离心分离10min，将上清液转移至1.5ml eppendorf离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置片刻，10000rpm离心分离10min，弃去上清液，沉淀用200ul的70％乙醇洗涤，10000rpm离心10min，重复洗涤两次，沉淀室温干燥后溶于20ul重蒸馏水中。
抽提液的组成为100mmol.L-1Tris-HCl,20mmol.L-1EDTA,500mmol.L-1NaCl,1.5％SDS。
3．RAPD多态性分析选取600个由10碱基组成的寡核苷酸随机引物(美国Operon公司出品)，利用RAPD技术对表一所示的杂交组合和亲本进行多态性分析。
提取的基因组DNA进行RAPD扩增反应，RAPD扩增反应条件是每35ul反应体积中包括50ng左右的基因组DNA、0.2umol.L-1的引物、2UTag DNA聚合酶和0.1mmol.L-1dNTP，用9600型DNA扩增仪(美国Perkin-Elmer公司出品)进行扩增，扩增反应的程序为94℃ 5min变性后，按94℃ 1min、36℃ 1min，72℃ 2min的顺序进行30个循环，循环结束后72℃条件下延伸5min。扩增产物在1.4％琼脂糖凝胶上进行电泳，5v/cm 1.5h，以HaeⅢ酶切的φ×174DNA作为标准分子量标记，溴乙锭染色，紫外灯下观察并拍照。
在600个引物中有28个引物能够在不同的杂交组合及其亲本之间扩增出有明显多态性的条带，其中8个引物扩增出的12条多态性条带表现为较强的特异性差异，这种差异表现为条带的有或没有，能清晰又易于分辨，具有较好的直观感。具体结果见表二。
表二RAPD多态性标记及应用<
<p>将上述8个RAPD标记(OPK17/1400,OPP07/700(L),OPP07/700(H),OPC09/1200,OPW19/900,OPR15/1400,OPH03/1700,OPT04/700,OPG13/700)自琼脂糖胶中分离提取后，以此为模板在相同的RAPD反应条件下再扩增一次，提取纯化后得到增强的RAPD标记。
4．克隆、测序将增强的RAPD标记克隆到载体pCRTM2.1(美国Invitrogen公司出品)上，用ABI310型DNA自动测序仪(美国Perkin-Elmer公司出品)测定其呈多态性标记的DNA碱基序列，确定其两端的碱基组成。
5．设计PCR引物与SCAR标记根据RAPD标记中两端的碱基序列和PCR引物特殊要求设计出稳定性较强的特异性双引物(PCR引物)，用PCR引物同水稻杂交组合及其亲本进行PCR扩增，PCR扩增条件为每35ul反应体积中包括0.1mmol.L-1的dNTP混合物，正向和反向引物各0.2umol.L-1(根据鉴别水稻杂交组合/品种的不同而选择适宜的引物，具体情况见表三)，2U Tag DNA聚合酶和50ng左右的水稻基因组DNA，用美国Perkin-Elmer公司的9600型DNA扩增仪进行PCR扩增。反应程序为94℃ 5min℃变性后，按94℃1min、55℃ 1min、72℃ 2min的设置进行35个循环，循环结束后在72℃下延伸5min。扩增产物在1.4％琼脂糖凝胶上电泳1.5h(5v/cm)，紫外灯下观察电泳结果，Polaroid一次成像拍照，根据标记条带的有无即SCAR标记对杂交水稻组合和亲本进行快速准确鉴定。
表三双引物与SCAR标记
二、鉴定应用实施例例1利用分子标记(SCAR标记)对汕优63自然群体和人工群体种子进行真实性和纯度的鉴定。
自然群体指杂交种直接取自制种基地，其纯度以海南种植鉴定结果为标准。人工群体指人为设计的，选用高纯度(100％)的汕优63，人为掺入与其种子外形相同的不育系A、保持系B以及其他外形相似的种子，其纯度是事先设定的。
首先从被检种子群体中随机取300粒种子，逐个提取其基因组DNA。选用4#正、反向PCR引物(见表3)对被检测的300粒种子和标准的汕优63基因组DNA进行PCR扩增。反应产物在1.4％的琼脂糖凝胶上电泳1.5h(5v/cm)，紫外灯下和标准的汕优63电泳结果对照，观察是否有大小为800碱基的条带即SCAR标记。若有即为真的汕优63种子，若无此带即不是汕优63种子，鉴定结果见表四和图一。
表四SCAR标记鉴定和海南种植鉴定的比较
图一为用SCAR标记对汕优63种子真实性和纯度进行鉴定的电泳结果(显示部分样品电泳)。图一a为自然群体1是标准汕优63,2-49是被检测的种子，其中27无SCAR标记带即不是汕优63种子。图一b为人工群体1是标准汕优63,2-19是被检测的种子，其中4、5、8、9、12、13无SCAR标记带即不是汕优63种子。
例2安徽省巢湖农技部门在协青早不育系(协青早A)的繁殖中混杂了保持系协青早B，这将极大影响协优杂交稻的制种工作，为确定混杂程度，我们使用7#正、反向PCR引物(见表3)对其样品进行SCAR标记的鉴定，结果显示混杂率为3％，确定为不合格不育系，不能在制种中使用，后经当季田间检验，结果准确可靠，从而避免了在生产上的损失。
权利要求
1.一种分子标记技术在快速准确鉴定水稻杂交组合/品种真实性和纯度方面的应用，用随机引物对水稻杂交组合及其亲本进行一系列相关分子生物学技术处理和实验，其特征在于(1)杂交组合及其亲本基因组DNA的提取；(2)利用10个碱基的寡核苷酸随机引物同提取的基因组DNA进行RAPD多态性分析，得到RAPD标记，并对其重扩增、提取和纯化；(3)将纯化后的RAPD标记克隆到载体上，测定其DNA碱基序列；(4)根据克隆片段两端的碱基序列设计出特异的PCR引物，利用该引物进行SCAR标记。
全文摘要
一种分子标记技术在快速准确鉴定水稻杂交组合/品种真实性和纯度方面的应用，就是将PAPD标记经克隆、测序后设计出稳定的PCR引物，进而利用SCAR标记可在1～2天内对水稻杂交组合/品种的种子进行真实性和纯度鉴定，其准确度与种植鉴定的准确度一样可靠。本发明可直接应用于杂交水稻不同组合及其亲本的真实性和纯度的鉴定。
文档编号A01H1/02GK1237328SQ9910376
公开日1999年12月8日 申请日期1999年4月10日 优先权日1999年4月10日
发明者杨剑波, 汪秀峰, 李莉, 向太和, 倪大虎, 王永杰, 皮桃花, 张毅, 吴家道 申请人:安徽省农业科学院