一种利用浅层培养生产藏红花微球茎方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物种苗生产方法，具体涉及一种利用浅层培养生产藏红花微球茎方 法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 藏红花（Crocus sativus L.)别名番红花、西红花，是一种鸾尾科番红花属的多年 生花丼，也是一种常见的香料。是西南亚原生种，最早由希腊人人工栽培。主要分布在欧 洲、地中海及中亚等地，明朝时传入中国，《本草纲目》将它列入药物之类，中国浙江等地有 种植。是一种名贵的中药材，具有强大的生理活性，其柱头在亚洲和欧洲作为药用，有镇静、 祛痰、解痉作用，用于胃病、调经、麻瘆、发热、黄胆、肝脾肿大等的治疗。
[0003] 由于藏红花不能进行有性生殖，只能通过球茎进行无性繁殖，且栽培条件下其球 茎退化现象严重，导致种质资源严重缺乏。我国自引种以来，栽培藏红花产量一直较低，远 远不能满足人们的需要。近年来组织培养技术应用在藏红花种苗的生产上，为藏红花种球 短缺与退化提供了一种解决方法，但是植株组织培养是一个劳动密集型产业，生产成本居 高不下，种苗的生产也只停留在实验阶段。
[0004] 本发明利用浅层培养技术生产藏红花微球茎，由于采用液体培养模式，更易实现 产业化和自动化，将是解决藏红花种球短缺的一个有效方法。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种生长周期短、移栽存活率高、成本低、操作简 单且适宜大规模生产的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：该利用浅层培养生产藏红花微 球茎方法，包括以下步骤：
[0007] (1)培养容器灭菌：将培养基放入培养容器中，并在高温高压湿热消毒灭菌后待 用；
[0008] (2)外植体的获得及灭菌处理：将藏红花球茎放入含有消毒液的水中培养待其长 出叶片，取下叶片，清水冲洗20~40分钟；在超净台中将上述藏红花叶片进行表面消毒灭 菌处理；
[0009] (3)浅层培养的外植体的制备：将步骤（2)中已消毒灭菌的叶片在无菌环境下切 成0. 5~1.0 cm的小段，并接种到已灭菌的诱导藏红花愈伤组织的固体培养基中，获得藏红 花愈伤组织；所述藏红花愈伤组织即为浅层培养的外植体；
[0010] (4)浅层培养：
[0011] ㈧丛生芽诱导：将步骤⑶中获得的愈伤组织切成〇. 1~〇. 3cm3小块接种到液 体浅层丛生芽诱导培养基中培养，培养时间为15~25d ;
[0012] (B)微球茎形成：丛生芽诱导结束后，不移动组培苗及培养基，直接向组培瓶中添 加诱导微球茎形成的培养基，培养时间为30~45d ;即获得藏红花丛生微球茎。
[0013] 采用上述技术方案，首先将灭菌后的藏红花叶片进行愈伤组织培养，在植物组织 培养过程中，愈伤组织的培养是至关重要的步骤；愈伤组织的培养是无性繁殖且可以在短 时间内大量扩繁，从而为后续浅层培养提供材料；将浅层培养过程分为丛生芽诱导步骤和 微球茎形成步骤两个过程，且两个步骤之间不移动组培苗及培养基，直接在丛生芽诱导步 骤的组培瓶中添加促进微球茎形成的培养基，由于所采用的液体培养基均为浅层培养，营 养物质更易被吸收、利用充分，培养体生长速度快，从而快速获得大量用于生产的藏红花丛 生微球茎；该方法解决了更换组培瓶及培养基时对丛生芽造成的伤害，提高了丛生芽接种 至微球茎形成培养基时的存活率，提高了微球茎的增殖率。
[0014] 通过大量的实验证实，将浅层培养过程分为丛生芽诱导步骤和微球茎形成步骤 两个过程，且两个步骤之间不移动组培苗及培养基，直接在丛生芽诱导步骤的组培瓶中添 加促进微球茎形成的培养基的操作过程更为简单方便，且极大的降低了操作过程中的污染 率；从而提高了丛生芽的存活率；同时由于所采用的液体培养基均为浅层培养，营养物质 更易被吸收、利用充分，培养体生长速度快。
[0015] 本发明的进一步改进在于，所述步骤（2)中的灭菌处理的具体步骤为：首先在 75%无水乙醇中浸泡15~30s，再用无菌水清洗2~4次，然后放入摩尔浓度为0. 1 %的升 汞中浸泡3~5min，再用无菌水清洗5~8次。灭菌的处理对后续的培养过程非常关键，直 接影响后续培养的诱导率、增殖率以及生根率，通过大量实验验证，该灭菌方法对本发明后 续的培养最好。
[0016] 本发明的进一步改进在于，所述步骤（3)中的诱导藏红花愈伤组织的固体培养基 的配方为：MS+0. 5 ~I. 5mg/L 6-BA+0. 05 ~0· 2mg/L NAA+ 藏红花汁液 0· 1 ~0· 3g/L+ 蔗 糖25g/L+琼脂5. 5g/L，pH为5. 6~6. 0,培养时间为25~30d。愈伤组织的诱导培养基的 组成直接关系到愈伤组织的诱导率以及愈伤组织的质量，为了提高藏红花外植体的愈伤组 织的诱导率，本发明对藏红花外植体愈伤组织的诱导培养基进行了优化，如pH影响愈伤组 织对NO3-和NH4+的吸收利用，pH高有利于愈伤组织对NH4+的吸收利用，pH低则可以提高其 对NCT的利用；通过大量的筛选试验最终确定，采用上述的愈伤组织诱导培养基进行藏红 花外植体的愈伤组织诱导培养，愈伤组织的诱导效果最好。
[0017] 本发明的进一步改进在于，所述步骤（4)中的（A)步骤中的液体培养基的配方为： MS+1. 5 ~2. 5mg/L 6-BA+0. 05 ~0· 15mg/L NAA+藏红花汁液 0· 1 ~0· 3g/L+蔗糖 20g/L+AC 0. 1~0. 3g/L，pH为5. 6~6. 0,将配制好的液体培养基倒入组培瓶中，液面高度为0. 2~ 0. 5cm，灭菌后使用。在该液面高度下进行浅层培养时营养物质更易被吸收、利用充分，培养 体生长速度快，更有利于丛生芽的生长；此外如果液面高度过高，培养体完全浸泡在液体中 易产生玻璃化；如果液面高度过低，营养不足影响培养体生长。
[0018] 本发明的进一步改进在于，所述步骤（4)中的（B)步骤中的液体培养基的配方为： 1/2MS+0. 1 ~0· 5mg/L ΙΒΑ+0. 05 ~0· 2mg/L NAA+ 藏红花汁液 0· 1 ~0· 3g/L+ 蔗糖 30g/L， pH为5. 6~6. 0,将配制好的液体培养基灭菌后倒入组培瓶中，液面高度为0. 5~I. 0cm。 此处，如果液面高度过高，培养体完全浸泡在液体中易产生玻璃化；如果液面高度过低，营 养不足影响培养体生长。
[0019] 通过大量的实验证实，在步骤（3)和步骤（4)的培养基中，藏红花汁液适宜添加 量为0. 1~0. 3g/L，当培养基中藏红花汁液添加量低于0. lg/L时，获得的藏红花微球茎和 普通培养获得的微球茎长势并没有显著差异，微球茎的直径、株高等小于添加量在0. 1~ 0. 3g/L时获得的微球茎，且差异显著；当藏红花汁液添加量高于0. 3g/L时，随着添加量的 增加微球茎并没有显著地变化。藏红花汁液中含有藏红花生长过程中所不可缺少而又无法 人工合成的微量元素，经过大量的实验证明，添加藏红花汁液的培养液比普通培养液培养 获得的藏红花组培苗更健壮。以普通培养液为对照，培养80天后比较藏红花组培苗长势情 况如下表：
[0020]
【主权项】
1. 一种利用浅层培养生产藏红花微球茎的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 培养容器灭菌：将培养基放入培养容器中，并在高温高压湿热消毒灭菌后待用； (2) 外植体的获得及灭菌处理：将藏红花球茎放入含有消毒液的水中培养待其长出叶 片，取下叶片，清水冲洗20~40分钟；在超净台中将上述藏红花叶片进行表面消毒灭菌处 理； (3) 浅层培养的外植体的制备：将步骤（2)中已消毒灭菌的叶片在无菌环境下切成 0. 5~1.0 cm的小段，并接种到已灭菌的诱导藏红花愈伤组织的固体培养基中，获得藏红花 愈伤组织；所述藏红花愈伤组织即为浅层培养的外植体； (4) 浅层培养： (A) 丛生芽诱导：将步骤（3)中获得的愈伤组织切成0. 1~0. 3cm3小块接种到液体浅 层丛生芽诱导培养基中培养，培养时间为15~25d ; (B) 微球茎形成：丛生芽诱导结束后，不移动组培苗及培养基，直接向组培瓶中添加诱 导微球茎形成的培养基，培养时间为30~45d ;即获得藏红花丛生微球茎。
2. 根据权利要求1所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步 骤（2)中的灭菌处理的具体步骤为：首先在75%无水乙醇中浸泡15~30s，再用无菌水清 洗2~4次，然后放入摩尔浓度为0. 1 %的升采中浸泡3~5min，再用无菌水清洗5~8次。
3. 根据权利要求2所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步 骤⑶中的诱导藏红花愈伤组织的固体培养基的配方为：MS+0. 5~I. 5mg/L 6-BA+0. 05~ 0? 2mg/L NAA+ 藏红花汁液 0? 1 ~0? 3g/L+ 蔗糖 25g/L+ 琼脂 5. 5g/L，pH 为 5. 6 ~6. 0,培养 时间为25~30d。
4. 根据权利要求2所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步 骤（4)中的（A)步骤中的液体培养基的配方为：MS+1. 5~2. 5mg/L 6-BA+0. 05~0? 15mg/ L NAA+藏红花汁液0? 1~0? 3g/L+蔗糖20g/L+AC 0? 1~0? 3g/L，pH为5. 6~6. 0,将配制 好的液体培养基倒入组培瓶中，液面高度为〇. 2~0. 5cm，灭菌后使用。
5. 根据权利要求2所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步 骤（4)中的（B)步骤中的液体培养基的配方为：l/2MS+0. 1~0. 5mg/L IBA+0. 05~0. 2mg/ L NAA+藏红花汁液0. 1~0. 3g/L+蔗糖30g/L，pH为5. 6~6. 0,将配制好的液体培养基灭 菌后倒入组培瓶中，液面高度为0. 5~I. 0cm。
6. 根据权利要求5所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步 骤（3)中的诱导藏红花愈伤组织培养的环境为：暗培养30~40d，温度为19~22°C。
7. 根据权利要求6所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步 骤（4)中的（A)步骤中丛生芽生长的培养环境为：首先进行暗培养，暗培养时间为10~ 15d ;然后进行光照培养，光照周期14h/d，光照强度1800~2000LX，培养时间为5~IOd ; 所述培养环境温度为19~22°C。
8. 根据权利要求7所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述 步骤（4)中的（B)步骤中微球茎产生的培养环境为：光照周期14h/d，光照强度2000~ 2500LX，温度 18 ~2(TC。
9. 根据权利要求1-8任一项所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在 于，所述藏红花汁液的制备方法是鲜物研磨或榨汁。
【专利摘要】本发明公开了一种利用浅层培养生产藏红花微球茎的方法，该方法包括(1)培养容器灭菌；(2)外植体的获得及灭菌处理；(3)浅层培养的外植体的制备；(4)浅层培养；(A)丛生芽诱导；(B)微球茎形成；浅层培养阶段又分丛生芽诱导和微球茎形成两个过程。由于浅层培养采用的液体培养模式，培养体更易吸收培养基中的营养成分，所以种苗生长快，缩短了微球茎生产时间；同时浅层培养操作简单，成本低，更容易实现规模化和工业化生产。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104855289
【申请号】CN201510263701
【发明人】周志疆, 陈明亮, 张丽丽, 韩婷
【申请人】江苏丰收大地种业发展有限公司
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年5月21日