基于多节间茎段一体化培育黄花倒睡莲组培苗方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物栽培领域，具体涉及一种基于多节间茎段一体化培育黄花倒睡莲组培苗方法。
【背景技术】
[0002]黄花倒睡莲iPolygala /aWax Hemsl.)又名黄花参、鸡仔树、吊吊黄、黄花吊水莲、观音串、黄花大远志，远志科(Polygalaceae)远志属、Polygala)植物。主要分布广西、福建、湖南等地，生于山坡疏林下或沟谷丛林中，属珍贵中药材。黄花倒睡莲的根或全草，是瑶、苗、壮等少数民族常用的民间药物，具有补益、强壮、祛湿、散疲之功效，治疗虚弱虚肿，急慢性肝炎，腰腿酸痛，跌打损伤。近年来，黄花倒睡莲的药用价值逐渐被重视，但关于繁殖与药用价值开发方面的研究并不多，更因早被民间所认知，市场需求量大，而野生资源有限，导致黄花倒睡莲资源严重短缺。应该在资源保护基础上，开展扩繁、引种、栽培研究，以扩大药用资源。近年来，我们开展了黄花倒睡莲生境分析、扦插、组织培养等快繁及人工栽培技术研究，为实现黄花倒睡莲的规模化种植与有效成分的提取奠定基础。
[0003]黄花倒睡莲在自然状态下通常都用种子繁殖，但繁殖系数较低，种子成熟后及时采收，清除残存花柱，晾干。沙藏处理，翌春再播，或直接秋播。但自然状态下，受生长海拔、气候等生态因素的影响，种子不宜收集，且成活率较低。因此，人们开始寻求通过组织培养、扦插等快速繁殖途径以缓解资源的压力。黄花倒睡莲其组织培养及扦插并不困难，但相关报道尤其是组培再生成苗的报道不多。
[0004]选择优良品种的健壮无病株在春季3-5月间，植株生长旺盛进入开花期进行。但扦插的繁殖系数相对较小(蔡仕珍，2005)。笔者对黄花倒睡莲扦插繁殖的研究表明，采用全沙基质1000 ppm吲哚丁酸处理的扦插效果最好，其生根率可达85%以上。此结果比蔡仕珍报道的同属植物黄花远志的扦插生根效果更好。
[0005]但以上两种方法的缺点均为繁殖时间太长，繁殖系数太小，不能达到大量引种繁殖的需要。
[0006]以当年生黄花倒睡莲幼嫩带腋芽茎段作为外植体，开展组织培养试验研究。结果表明:最佳外植体诱导培养基为1/2 MS + BA 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L，诱导率可达95.1%;最佳增殖培养基为WPM + BA 1.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L，增殖系数为6.12，周期为25 d，不定芽生长状况好；最佳生根培养基为1/2 WPM + IBA 0.1 mg/L + ABT 0.4 mg/L，生根率为95.67% ;以泥炭土:黄泥土:珍珠岩(2:1: I)为移栽基质，移栽成活率可达92.6%，苗木长势好，叶色绿。(刘秀芳，2012 ;林文革，2012)
现有的种子繁殖、扦插繁殖等繁殖技术均有繁殖时间过长，繁殖倍数较低等缺点。而现有的组织培养技术用单个茎段诱导单芽，再用单芽诱导丛生芽最后再利用丛生芽诱导成苗的多过程多步骤的方法(林文革，2012)使得黄花倒睡莲组织培养苗木培育的整个过程时间过长，繁殖系数过大而导至苗木继代倍数过多以及质量大幅下降，加大了黄花倒睡莲苗木的变异性。本发明针对现有组织培养技术所存在的问题，提供了一种采用多节间茎段作为外植体，同时采用专项研究出的独立配方使其在一代的培养基中完成增殖、生根等过程，利用它们一体化的方法来培育出黄花倒睡莲组织培养苗。本方法在提高其繁殖系数的同时，保存了苗木的优质性来满足引种推广的需求；这种黄花倒睡莲组织培养技术能在较短的30-50 d内，繁殖出大量具有保持母本优良品质的黄花倒睡莲植株。与常规种子繁殖、扦插、组培繁殖等繁殖技术相比，此法有效地提高黄花倒睡莲fallax Hemsl.)的繁殖系数，保持母本的优良性状，不易产生性状变异。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供基于多节间茎段一体化培育黄花倒睡莲组培苗方法，利用该方法不仅提高了黄花倒睡莲组培苗的生长速度，缩短生长周期，提高繁殖系数，而且缩短了生根时间，增加了根系活力，提高了组培成苗的质量，为药用植物黄花倒睡莲组培快繁研究提供了一种思路、方法。
[0008]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
基于多节间茎段一体化培育黄花倒睡莲组培苗方法，取黄花倒睡莲植株为外植体，经过表面消毒、初代培养、一体化培养、炼苗、移栽，最终获得黄花倒睡莲组培苗。
[0009]所述方法具体包括以下步骤:
(1)表面消毒:取生长健壮、无病虫害的野生黄花倒睡莲植株为外植体，去除叶片后用软毛刷轻刷表皮，将其进行表面消毒处理a后，切成含有2-4个多节间的茎段备用；若选择生长健壮的黄花倒睡莲组培苗用于繁殖，则采用消毒处理b后直接切取后进行初代培养；
(2)初代培养-丛生芽诱导与增殖:将已经过消毒处理的多节间茎段接种入培养基A中，多节间茎段横放平铺于培养基中，10-15天后进行一体化培养；
(3)—体化培养:将经初代诱导的多节间丛生芽切取成1.5-2.0 cm长的单芽横放入培养基B中，每瓶接种30棵，光照强度为1500-3000 lx, 10天后开始生根，20天长至6_8 cm高度后，准备移栽；
(4)炼苗:20天后，将瓶苗从培养室取出放置常规室内3-5天，第6天将瓶盖打开继续放置2天，期间每天要补充10-15 ml无菌水至瓶内，第8天后将组培苗轻轻夹出，洗净根部培养基，以备移栽；
(5)移栽:将洗净的黄花倒睡莲组培苗用500ppm多菌灵溶液浸泡30 min后，取出，用稀黄土将其根部包裹成鸡蛋大小后，移栽入一定配比组合的泥炭土、黄泥土、珍珠岩等栽培基质中种植；
(6)田间栽培管理:将幼苗移栽田间，环境温度24-26°C，喷雾保湿，保持空气湿度85%-95%，覆盖遮阴率70%遮阳网，每周喷洒I次广谱杀菌剂，每月浇I次两倍MS大量溶液(成分配比见附件I )，一年后植株的平均根粗可达0.5-0.8 cm。
[0010]步骤(I)中表面消毒处理a为在含有体积浓度为0.1-0.2%洗洁精的水中浸泡30min,流动的水冲洗1-2 h，置于超净工作台上用70 wt.%酒精消毒20-30 S，无菌水冲洗3_5次，再用0.1 wt.%升萊消毒10-20 min，无菌水冲洗3_5次后，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分。
[0011]步骤(I)中消毒处理b为70 wt.%酒精消毒5 s，无菌水冲洗3-5次，0.1 wt.%升汞消毒3 min，无菌水冲洗3-5次后，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分。
[0012]培养基A 配方为:MS+ 6BA 1.5 mg/L + NAA 0.05 mg/L + KT 0.5 mg/L + Sue30 g/L + 琼脂粉 8 g/L, PH 值为 5.8。
[0013]培养基B 配方为:1/4 MS+ IBA 0.2 mg/L + NAA 0.5 mg/L + AC I g/L + Sue 20g/L +琼脂粉9 g/L, PH值为5.9。
[0014]所述的移栽基质配比是:泥炭土:黄泥土:珍珠岩的重量比为3:2:1。
[0015]所述广谱杀菌剂为50%多菌灵与70%甲基托布津交替使用。
[0016]附件I
MS培养基中的成份为(单位mg/L):
(一)、大量元素:
1、硝酸钾 KNO31900 ；2、硝酸铵 NH4NO31650 ；
3、磷酸二氢钾 KH2PO4 170 ；4、硫酸镁 MgSO4.7H20 370 ；
5、氯化钙CaCl2.2H20 440 ；
(二)、微量元素:
6、碘化钾KI0.83 ； 7、硼酸 H3BO36.2 ；
8、硫酸锰 MnSO4.4H20 22.3 ； 9、硫酸锌 ZnSO4.7H20 8.6 ；
10、钼酸钠 Na2MoO4.2H20 0.25 ； 11、硫酸铜(:11504.5!120 0.025;
12、氯化钻CoCl2.6H20 0.025;
(三)、铁盐:
13、乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA 37.3 ； 14、硫酸亚铁 FeSO4.7H20 27.8 ；
(四)、有机成分:
15、肌醇100;16、甘氨酸2.0;
17、盐酸硫胺素(VB1) 0.1;18、盐酸吡哆醇(VB6) 0.5;
19、烟酸(VB3)0.5 ；
1/4MS的成分为:大量兀素是MS培养基大量兀素的四分之一，其余成分与MS培养基相同。
[0017]6BA:6-苄基腺嘌呤；NAA:萘乙酸；KT:激动素；
2，4-D:2, 4- 二氯苯氧乙酸；AC:活性炭。
[0018]本发明的优点在于:
本方法在传统的组织培养的方法的基础上，利用所研究的专项培养基配方来一体化培育黄花倒睡莲组培苗，解决了原本传统的分步骤诱导的组织培养方法存在的培育周期过长，阶段过多，转接次数过多以及实验材料易被污染等问题。
[0019]本发明所用的外植体为黄花倒睡莲多节间茎段，并通过专项实验研究设计的繁芽、增殖、生根一体化的一次性组织培养诱导方法来获得黄花倒睡莲再生植株，按本发明所培育的黄花倒睡莲植株生根成苗率为100%，移栽成活率为95%以上。本方法中黄花倒睡莲的组培成苗时间仅为30-50 d，提高黄花倒睡莲的繁殖倍数的同时提高了黄花倒睡莲的组培苗成活率更高，降低了黄花倒睡莲组织培养技术的生产成本，为黄花倒睡莲的开发利用及产业化推广提供了新的技术。
【具体实施方式】
[0020]实施例1
(1)表面消毒:取生长健壮、无病虫害的野生黄花倒睡莲植株为外植体，去除叶片后用软毛刷轻刷表皮，将其进行表面消毒处理a后，切成含有3个多节间的茎段备用；
(2)初代培养-丛生芽诱导与增殖:将已经过消毒处理的多节间茎段接种入培养基A中，多节间茎段横放平铺于培养基中，15天后进行一体化培养；
(3)—体化培养:将经初代诱导的多节间丛生芽切取成2.0 cm长的单芽横放入培养基B中，每瓶接种30棵，光照强度为3000 lx, 10天后开始生根，20天后长至8 cm高度后，准备移栽;
(4)炼苗:20天后，将瓶苗从培养室取出放置常规室内5天，第6天将瓶盖打开继续放置2天，期间每天要补充15 ml无菌水至瓶内，第8天后将组培苗轻轻夹出，洗净根部培养基，以备移栽；
(5)移栽:将洗净的黄花倒睡莲组培苗用500ppm多菌灵溶液浸泡30 min后，取出，将其用沾水的黄土裹根，