具有定制特征的转基因动物的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请是2013年3月15日提交的美国专利申请号为13/837, 405的部分继续申请 案，其中美国专利申请号为13/837, 405的申请是2013年2月15日提交的美国专利申请号 为13/768, 760的申请的部分继续申请案，美国专利申请号为13/768, 760的申请要求2012 年2月15日提交的美国专利申请号为61/598, 987的申请的优先权，其全部内容通过引用 的方式并入本文。
[0003] 本申请的序列表被标记为SeqList-14Marl3_ST25.txt，其创建于2013年3月14 日且大小为85邸。序列表的全部内容通过引用的引证方式并入本文。
技术领域
[0004] 本发明设及动物的基因修饰W产生特定特征的可控变化，例如，皮肤和/或皮毛 着色中的变化。
【背景技术】
[0005] 大多数动物物种中合成的唯一色素及所有哺乳动物物种中合成的唯一色素是黑 色素。黑色素分为两类：褐黑素，其产生金色或红色，及真黑素，其产生深栋色或黑色。两种 黑色素都由酪氨酸合成，但其合成途径在多己酿产生后不同。
[0006] 控制特定的黑素细胞产生褐黑素或真黑素的主要开关是黑素皮质激素受体 (MClR)。MCIR多态性还可能是红色或金色褐黑素的主要决定因素。
[0007] 黑素皮质激素受体可W通过任何的黑素细胞刺激激素（MSH)激活，最通常的是 曰-M甜，还可W是0-防御素103。相反地，MClR的激活可能通过刺鼠信号蛋白（agouti signalingprotein,AS巧的表达被抑制。0-防御素103信号优于ASP信号且ASP信号优 于MSH信号。此外，所有运些加强或降低其活性的基因中存在突变和多态性。毛色进一步 地由黑色素产生及转运的多个调节剂调节，其包括酪氨酸酶（TYR)、酪氨酸酶转运体0CA2 及泛素基因肥RC2等。
[0008] 植物产生多种其他色素，包括叶绿素、类胡萝h素、花青素和甜菜红。在运些色素 中，类胡萝h素最容易转移到动物体内，因为植物中类胡萝h素色素的产生依赖于动物中 也能发现的前体。香叶基香叶基焦憐酸是HMG-CoA还原酶途径中的中间体，并用作合成类 固醇和固醇的前体。随着4-5个植物蛋白的添加，香叶基香叶基焦憐酸可替换用作合成胡 萝h素的黄色和澄色或类胡萝h素红色的前体。植物色素转移至动物已发生于自然界：魏 豆晒虫A具有几个从真菌转移的基因。类胡萝h素已在转基因酵母中产生，所述酵母属于 动物界。
[0009] 在多细胞动物中通过基因干预曾尝试的表面色素的唯一修饰是动物由浅色到深 色或由深色到浅色的不加选择的变化。还未创建更详细的模式。在动物中天然发现的胡萝 h素色素不比晒虫更复杂，且未被设计进入任何多细胞动物中。在本发明之前，还未产生动 物物种的皮肤或皮毛的定制颜色或图案。
[0010] 发明简述
[0011] 本发明提供了创建动物中定制特征的材料和方法。例如，本发明提供了创建动物 的皮肤和/或皮毛中定制图案的材料和方法。在其他实施方案中，所述定制特征可W包括 动物皮肤或皮毛的长度和/或纹理。可选地，本发明还可用于产生动物指甲、爪和/或角的 纹理、结构强度和/或长度的可控变化。
[0012] 在一个具体的实施方案中，本发明的方法包括将基因构建体导入动物的细胞中， 所述基因构建体包括角蛋白-14特异性启动子、Ioxp盒中的红色巧光蛋白、色素盒中的显 性黑（AG23) 0防御素103,及SV40(带有内含子）多聚腺巧酸化序列。当将包括化e重 组酶（或HTNCre)的组合物施用于具有基因构建体的动物皮肤时，施用所述组合物的动物 的皮毛将变黑。W运种方式，所述皮毛被永久地基因修饰而W所需形状转变颜色。
[0013] 因此，在一个实施方案中，本发明提供了在动物的皮肤和/或皮毛中创建定制的 永久图案的方法。
[0014] 在另一实施方案中，本发明提供了在动物物种的皮肤和/或皮毛中产生多颜色图 案的方法。
[0015] 在进一步的实施方案中，本发明提供了在动物物种的皮肤和/或皮毛中创建定制 图案的方法，W使所述动物能继续生长皮毛W在其整个生命期保持运些颜色。
[0016] 本发明还提供了创建定制的预定义的条纹图案的方法，所述图案在该动物中是可 遗传的。
[0017] 在一个实施方案中，本发明提供了一个或多个活化因子的经皮施用W引起本发明 的转基因动物中的重组和永久的转基因表达。在某些具体的实施方案中，根据本发明使 用的活化因子包括，但不限于，重组酶蛋白质、能够诱导重组酶表达的小分子（如，强力霉 素，cumate、蚁皮激素等），能够诱导重组酶表达的病毒，及驱使重组酶表达的核酸（如DNA) 构建体。
[0018] 在某些实施方案中，所述活化因子可单独地或在载体溶液中（例如，脂质体、溶 剂、含有DMSO的混合物等）施用于动物皮肤的表面。在一个实施方案中，所述活化因子皮 内（如使用纹身针）或皮下施用。
[0019] 在一个实施方案中，所述转基因动物包含一个或多个外源核酸分子，其包括但不 限于，着色-相关的基因，表皮/毛发特性基因（如控制动物毛发的长度和/或卷曲度的基 因），与指甲/爪或角特性相关的基因（如编码交联角蛋白的核酸分子），及动物细胞中用 于合成和/或表达植物色素的基因。
[0020] 在某些实施方案中，根据本发明使用的启动子包括但不限于，皮肤-特异性启动 子（例如，角蛋白特异性启动子），黑素细胞特异性启动子（例如，MCR启动子），组成型启 动子（例如，P-球蛋白启动子、CMV启动子），及响应循环因子（如NF-kB、干扰素丫、雌激 素和糖皮质激素类）的启动子。
[0021] 在某些实施方案中，本发明提供了多种类型重组酶祀标的用途W允许通过施用不 同重组酶选择性地特异性激活不同基因。在一个实施方案中，多元重组酶祀标用于允许动 物出生后产生多种颜色。
[0022] 在一个实施方案中，在具有天然金色皮毛的转基因狗中，化e重组酶激活黑色狗皮 毛的产生，且Flp重组酶激活红色狗皮毛的产生。
[0023] 在一个实施方案中，本发明提供了自身启动子的用途W在不需要外源活化因子时 引起表皮着色。在一个具体实施方案中，自身启动子设及动物发育中限定体节边界。
[0024] 在一个实施方案中，自身异源启动子用于创建不同物种的表皮图案，如，例如，使 用猫中发现的T油by或Ticked启动子W引起狗的表皮着色。
[0025]在某些实施方案中，本发明提供了具有在出生后永久可定制的表皮图案的转基因 修饰的动物。
[0026] 在某些实施方案中，本发明提供了具有不常发现于哺乳动物中的毛色的转基因修 饰的动物。
[0027]在某些实施方案中，本发明提供了转基因修饰的牛、羊或其他动物，其表皮中长有 永久的识别标志（如编号或条形码）。
[0028]在某些实施方案中，本发明提供了转基因修饰的牛、羊或其他动物，其表皮中具有 "看不见"的标志，其响应健康或生理状况的变化可改变颜色。
[0029] 在一个实施方案中，所述转基因牛或羊或其他动物可表达表皮或毛皮上的一个 符号，其中如果动物具有NF-kB的慢性激活，所述符号可改变颜色，且如果动物具有干扰 素-T的慢性激活，另一符号可改变颜色。.
[0030] 在某些实施方案中，本发明提供了转基因修饰的动物，其具有出生时本身物种中 不常见的的毛色和图案。
[0031] 在一个实施方案中，本发明提供了黑安格斯品种的转基因牛类动物，其具有白色 或近白色的表皮或毛皮。
【附图说明】
[0032] 图1是用于引起动物中颜色变化的基因构建体的实施方案示意图。
[0033] 图2是用于创建动物皮肤或毛皮中定制的图案和颜色的基因构建体的实施方案 示意图。
[0034] 图3是用于创建动物皮肤或毛皮中定制的图案和颜色的基因构建体的实施方案 示意图。
[0035] 图4是用于创建小鼠皮肤或毛皮中定制的图案和颜色的基因构建体的实施方案 示意图。所述构建体包含角蛋白14启动子，其在所有皮肤成纤维细胞中都表达，W驱动显 性黑色形式的信号分子0-防御素103。0-防御素103的表达被编码环指蛋白（RFP)的 LoxP位点切割核酸阻断，环指蛋白用作标记物。编码RFP的核酸分子对于所述构建体是不 需要的且可由STOP取代。
[0036] 图5 (A)示出了通过经皮施用重组酶激活的0-防御素103表达，其创建了成年小 鼠的表皮或毛皮中的可遗传永久改变。度）可W实现标记改变的精准控制：通过注射重组 酶产生具有单独狭窄黑线的小鼠。皮肤/毛皮的变化通过表皮再生长的多次循环维持，表 示固有干细胞的成功改变。
[0037] 图6示出了转基因小鼠的毛色可W通过施用于小鼠皮肤的重组酶数量滴定。增加 施用于小鼠的重组酶数量增加转基因表达的水平和真黑素激活。
[0038] 图7是用于基因敲入牛的基因构建体的实施方案示意图，所述牛具有增强型绿色 巧光蛋白巧GF巧的精子-特异性表达，及重组酶-介导的显性阴性R油7的黑素细胞-特 异性表达。编码新霉素耐药性生物标记物蛋白的核酸序列位于构建体的中屯、且所述构建体 两侧为短的同源臂，其中所述标记物蛋白可通过PIGGYBAC?转座子被切除。
[0039] 图8示出了转基因的黑安格斯牛在皮肤中表达可定制的识别图案的描述。
[0040] 序列简述
[0041]SEQIDNO:1是双功能酶CarRP-类同种型1的氨基酸序列[魏豆晒](GenBank登 录号XP_001943170)。
[0042] 沈QIDNO:2是双功能酶CarRP-类的氨基酸序列[魏豆晒（A^dhosi地on pisum) ](GenBank登录号XP_001950787)。
[0043]SEQIDNO: 3是番茄红素环化酶/八氨番茄红素合成酶-类的氨基酸序列[魏豆 晒](GenBank登录号XP_001950868)。
[0044]SEQIDNO:4是八氨番茄红素脱氨酶-类的氨基酸序列[魏豆晒](GenBank登录 号XP_001943225)。
[0045]SEQIDNO: 5是八氨番茄红素脱氨酶-类的氨基酸序列[魏豆晒](GenBank登录 号XP_001950764)。
[0046]SEQIDNO:6是八氨番茄红素脱氨酶-类的氨基酸序列[魏豆晒](GenBank登录 号XP_001946689)。
[0047]SEQIDNO:7是八氨番茄红素脱氨酶-类的氨基酸序列[魏豆晒](GenBank登录 号XP_001943938)。
[0048]SEQIDNO:8是黑素皮质激素1受体的氨基酸序列（GenBank登录号邸L11741)。
[0049]SEQIDNO:9是a-黑素细胞刺激素（MSH)的氨基酸序列。
[0050]SEQIDNO:10是0 -黑素细胞刺激素（MSH)的氨基酸序列。
[005。SEQIDNO:11是0 -黑素细胞刺激素（MSH)的氨基酸序列。
[005引SEQIDNO: 12是丫-黑素细胞刺激素（MSH)的氨基酸序列。
[0053] 沈QIDNO:13是0 -防御素蛋白的氨基酸序列（GenBank登录号AAT67592)。
[0054]SEQIDNO:14是刺鼠信号蛋白前体的氨基酸序列（GenBank登录号NP_056585)。 [00巧]SEQIDNO:15是酪氨酸酶灯YR)的氨基酸序列（GenBank登录号BAA00341)。
[0056] 沈QIDNO:16是黑素细胞特异性转运蛋白的氨基酸序列（GenBank登录号 Q62052)O
[0057]SEQIDNO:17是r油蛋白香叶基香叶基转移酶组分A2的氨基酸序列（GenBank登 录号NP_067325)。
[005引SEQIDNO:18是ras-相关蛋白R油-7a的氨基酸序列（GenBank登录号 NP-033031)。
[005引SEQIDNO: 19是可能的E3泛素蛋白连接酶她R蝴的氨基酸序列（GenBank登 录号NP084390)。
[0060]沈QIDNO:20 是Riiell7 蛋白的氨基酸序列[原鸡（Gallusgallus)](GenBank登 录号AAl'SSSSO)。
[006U SEQIDNO:21是Rnel17蛋白的氨基酸序列[原鸡](GenBank登录号44巧8246)。
[0062] 沈QIDNO 是Rnel17蛋白的氨基酸序列[原鸡](GenBank登录号44巧8249)。
[006引发明详述
[0064] 本发明提供了创建动物中定制特征的材料和方法。例如，本发明提供了创建动物 的皮肤和/或毛皮中定制图案的材料和方法。在其他实施方案中，所述定制特征可W包括 动物皮肤或毛皮的长度和/或纹理。可选地，本发明还可用于产生动物毛发、指甲、爪和/ 或角的纹理、结构强度和/或长度的可控变化。
[0065] 在一个具体的实施方案中，本发明的方法包括将基因构建体导入动物的细胞中， 所述基因构建体包括角蛋白-14特异性启动子、Ioxp盒中的红色巧光蛋白、色素盒中的显 性黑（AG23)e防御素103,及SV40(带有内含子）多聚腺巧酸化序列。当将包括化e重 组酶（或HTNCre)的组合物施用于具有基因构建体的动物皮肤时，施用所述组合物的动物 的毛皮将变黑。W运种方式，所述毛皮永久地基因修饰而W所需形状转变颜色。
[0066] 因此，在一个实施方案中，本发明提供了在动物的皮肤和/或毛皮中创建定制永 久图案的方法。
[0067] 在另一实施方案中，本发明提供了在动物物种的皮