程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物种质低溫保存技术领域，更具体地，设及一种程序降溫法和玻璃 化法相结合超低溫保存批把属植物种质的方法。
【背景技术】
[0002] 植物种质资源是人类所拥有的最宝贵的自然资源。
[0003] 上个世纪60年代W来，许多国家对植物种质资源的收集和保存工作都加大了投 入和研究力度，特别是经济体发达的国家已建立了比较完善的田间基因库。不足的是，田间 种质保存占地广，会耗费大量的人力、物力和财力，也容易受各种自然灾害的影响，从而迫 使人们探索更实用、安全、经济的保存方法。直到上世纪中叶，植物离体培养技术开始出现 并不断完善和发展之后。有学者首次提出离体保存植物种质资源的策略(Henshaw，1975)。 离体保存从而开始频繁的出现在各种植物种质资保存的报道中，它W无菌培养条下，占用 空间、劳动力和维持开大大减小，同时方便于世界之间交流等特点优点，从而得到了各国的 重视(钟兰，2009)。
[0004] 批把属(Eriobotiya Lindl.)植物属于菩薇科(Rosaceae)苹果亚科(Maloideae)。 我国是批把种质资源最丰富的国家，原产我国的批把属植物约有16个种(21个种类），主要 分布于长江流域及长江W南各省(林顺权等，2004);此外，东南亚原产的批把属植物约有6 个种(11个种类），主要分布在老拋、越南、细甸、菲律宾、柬捕寨等地(杨向辟等，2005)。
[0005] 批把属植物的种质资源保存方面，栽培批把的品种资源已在国家种质资源圃（福 少H)进行了很好的种植保存（郑少泉，2006)，栽培批把的离体保存方面也进行了一些研究 (刘月学等，2004;王家福等，2004,2006;Wang et al. 2007)，只是尚未能广泛应用。批把属 只有一个栽培种，即普通批把(Eriobotira japonica Lindl .)，其余的约30个种的种质资 源保存很少研究，种植保存方面仅胡又厘等(化et al. 2007)报道保存了 10多个种;鉴于 野生批把的材料的取得比栽培批把更为困难，而且远离人们的关注视线，其种质资源保存 的迫切性更甚，更有必要进行离体保存的研究，相关报道很少。
[0006] 批把属植物离体保存种质资源目前有研究主要是缓慢生长法。缓慢生长法是通过 调节培养条件，抑制保存材料的生长和减少营养消耗来延长继代时间、减少操作和劳力的 保存方法巧Ij月学等，2004;王家福等，2004，2006)。减缓保存材料生长的具体方法如下： 主要方法是通过调整培养基配方，如降低培养基内营养水平;在培养基中添加化学物 质如多效挫等抑制生长的方式(王家福，2002);其次，还有脱水处理和复合限制生长措施减 缓保存材料的生长(刘月学，2004)。虽然运用组织培养技术保存种质已取得了很好的效果， 但是保存即使为1~3年后仍然要再继代，致体细胞无性系变异的老问题还是可能会发生， 从而使保存的原始种质丢失。
[0007] 果树超低溫保存自2 0 0 0年W来，已进行了若干研究，例如：己旦杏 (化annun1:apipat et al. 2000)，相橘（王子成等，2001)，圆金相（化O et al. 2002)，柿 子（艾鹏飞等，2003)，芒果(Wu et al. 2003)，欧洲板栗(Corredoira et al. 2004)，中华 雜猴桃(Xu et al. 2006)，番木瓜（曾继吾等，2005;Ashmore et al. 2007)，欧李(张成婉 等，2007);还有赵艳华等先后也进行了多种果树种质的超低溫保存研究，包括樓桃（1999)、 葡萄(2001)、梨(2004)、桃(2006)和李(2008)。但大部分果树的超低保存技术并不成熟，经 超低溫保存后，恢复生长获得再生植只有少数，如柿子，其余的研究属于阶段性研究或生理 性的研究。在批把超低溫保存方面只有一项利用程序降溫仪进行花粉处理的试验(刘月学， 2004) O
[0008] 将程序降溫应用于菩薇科果树乃至植物的超低溫保存，成功的例子较少，仅有少 数几个报道。例如马锋旺等在《杏愈伤组织的超低溫保存》（[J].西北植物学报，1999，19 (1): 67-70)中研究了菩薇科果树的杏子种质资源的超低溫保存，将杏愈伤组织加入预冷 的冰冻保护剂，平衡后用化ris750008型程序冷冻机冷却至-40°C，停留化后投入液氮罐保 存4她，化冻后用TTC法检测相对存活率，接于继代培养基上培养，恢复生长。但技术方案愈 伤组织存活率不高，最高相对成活率为57.9%，总的生长量比对照小，多次转移培养，均未分 化出不定芽。
[0009] 并指出不同品种基因型间超低溫保存的效果不同。
[0010] 玻璃化法超低溫保存植物种质资源是目前的主流方法，有数W千计的论文发表， 果树方面的也有几十篇。但正如木本果树的离体再生一样，并没有一个方法或程序可W应 用到每一种果树上都可W获得成功。类汉平等在《树替试管苗茎尖包埋玻璃化法超低溫保 存》（[J].中国农学通报，2010,26(18) :59-62)提供了菩薇科的树替的种质资源超低溫保 存研究，其玻璃化处理及超低溫保存玻璃化液采用成分组成为:30%甘油+15%乙二醇+ 5%二 甲基亚抓+0.4 mol/L薦糖，pH 5.8，分别在0°〇和24°〇下处理不同的时间，将玻璃化液处理 过的茎尖包埋丸经液氮冷冻保护，化冻后的包埋丸经洗涂、暗培养、光培养，6周后统计成 活率。该技术方案的最高成活率为87%。与现有的果树上超低溫保存大多数采用玻璃化法保 存报道一样，技术不成熟，只停留在证实某个植物种的超低溫保存可行性和保存技术的试 验当中，成活率低且不稳定，重复性差。本申请人将该技术方案应用到批把属植物上不能成 功，进一步采用其他的菩薇科植物所用的玻璃化法超低溫保存程序及其相应的冷冻保护剂 配方，在批把属植物上也不能成功。
[0011] 将玻璃化法用于批把的超低溫保存，成功的例子也极少，迄今只有一个批把茎尖 保存成活的报道。王家福等W二步玻璃化法超低溫保存批把茎尖（[J].植物资源与环境学 报，2006, 15(2):75 -76)，取健康成年批把树品种"解放钟"的嫩梢，处理后接种至诱导培 养基上，待茎尖抽芽至一定高度后，转移到增殖培养基上，4周后，切取长约10 mm的幼芽，接 种于含5%DMS0(二甲基亚讽）、2 mg- [1 6 -BA和5 %薦糖的MS培养基上预培养;切取长约2 ~4 mm的茎尖，室溫条件下加入60%的玻璃化保护剂PVS2(0.15 mol ? 1/1薦糖液体培养基 与PVS2溶液的体积比为40:60)处理不同时间，吸去保护剂后再加入PVS2(含30%甘油、15%乙 二醇、15%二甲基亚讽和0.4 mol . [1薦糖），于(TC下处理不同时间后，吸去保护剂，再重新 加入PVS2保护剂，立即置于-17°C处理若干小时至过夜，然后用纱布包裹后投入液氮保存 24 h后取出，化冻洗涂后转入含2. Omg- 1/16-BA和0.5 mg- 1/1 NAA的MS培养基中继代 培养，部分茎尖可形成小苗，再生植株。该技术方案只适用于批把属植物中的栽培批把品 种，没有报道对现有的批把属植物其他种进行试验，没有种间重复性，不可重复;该技术方 案使用的玻璃化保护剂成分比较复杂，而且要反复重新加入玻璃化保护剂，加保护剂操作 相对复杂，影响成活率，其最高成活率为52.3%。没有提供恢复植株再生培养可重复50%左右 的具体技术方案。
【发明内容】
[0012] 本发明要解决的技术问题是针对现有批把属植物超低溫保存的技术不足，提供一 种程序降溫法和玻璃化法相结合超低溫保存批把属植物种质的方法，本发明将程序降溫法 和玻璃化法有机结合，首创一套稳定、高成活率、新型的批把属植物超低溫保存的程序方 法，为程序降溫玻璃化法。
[0013] 本发明要解决的另一技术问题是提供所述方法的应用。
[0014] 本发明的目的通过W下技术方案予W实现： 提供一