新会大红柑脱毒试管苗微嫁接方法
【专利摘要】本发明涉及新会大红柑育苗繁殖技术领域，具体涉及一种新会大红柑脱毒试管苗微嫁接方法。所述微嫁接方法主要包括如下步骤：取目标植株的1?2mm茎尖，采用改良MT培养基预培养，投入液氮脱毒，恢复接种到继代培养基中培养；砧木种子消毒，灭菌，萌发；将新会大红柑腋芽发育好的丛生芽嫁接到砧木上，再进行试管内液体培育苗。本培养法采用改良MT培养基预培养，改良之后继代增值系数大于4，基本没有出现玻璃化现象，变异也大大减少；本培养法使得植物根系更加发达，抗恶劣环境性强，更容易适应南方潮湿多雨的气候环境，成活率也大大提高。
【专利说明】
新会大红柑脱毒试管苗微嫁接方法
技术领域
[0001]本发明涉及柑橘育苗繁殖技术领域，具体涉及一种新会大红柑脱毒试管苗微嫁接方法。【背景技术】
[0002]新会陈皮是新会大红柑的干果皮，因其品质独特，早在明清以前就已蛮声遐迩，并被列为“贡品”，行销国内外。
[0003]柑皮以贮藏的时间越久越好，故称“陈皮”。陈皮以广东所产为佳。历史贸易中特称 “广陈皮”，以别于其他省所产。
[0004]新会大红柑的果皮就是新会的著名特产一陈皮。由于它具有很高的药用价值，又是传统的香料和调味佳品，所以向来享有盛誉。早在宋代就已成为南北贸易的“广货”之一， 行销全国和南洋、美洲等地区。而“广陈皮”又以新会陈皮为上品，故清代大医师叶天士所开的中药“二陈汤”，特别写明“新会皮”。因不是新会所产的其药效远逊，且乏香味而痹口(即苦辣味)，所以新会陈皮价格较高，皮比肉贵。
[0005]柑橘遗传转化是建立在受体系统发展的基础上，具有良好的组织培养再生系统往往是获得成功的关键，受体系统的品种特异性及再生效率低使新会大红柑遗传转化受到极大的限制。传统的柑橘嫁接多是用热处理脱毒，然后在田间茎尖嫁接，切开暴露在空气中， 细菌或者病毒容易通过切开感染或者潜伏，成活率较低，在南方潮湿多雨的气候环境中更容易出现上述问题。新会大红柑的根系不发达，怕干旱，又怕洪溃，如何使得新会大红柑的果皮发育更好，且提高其色泽和品质，具有重要的研究意义。
【发明内容】
[0006]为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种抗恶劣环境性强、成活率高、 利于提高果皮发育和品质的新会大红柑脱毒试管苗微嫁接方法。
[0007]为实现上述技术目的，本发明采用以下的技术方案:
[0008]新会大红柑脱毒试管苗微嫁接方法，主要包括如下步骤:
[0009]步骤一、脱毒新会大红柑丛生芽的获得:
[0010]将消毒、灭菌处理的新会大红柑母枝在超净工作台上切取茎尖l-2mm，转移到改良 MT培养基中预培养，在4°C黑暗条件下进行预培养3-5天后，将茎尖组织转移到保护培养基中冰冻适应lh，后将其转移到冷冻管并迅速投入液氮中，使茎尖组织快速降温到_196°C并持续lh，然后再快速转移到45 °C水中解冻恢复，然后接种到继代培养基中，25 °C暗培养一周后进行常规光照培养，获得脱毒新会大红柑丛生芽；
[0011]步骤二、砧木选择:
[0012]将柠檬或香橙种子在超净工作台经酒精、升汞消毒后接种到1/2MS培养基，待种子萌发后挑选出粗壮、生长状态好的幼苗，待幼苗生长到第二片真叶形成后，作为接种砧木待微嫁接；[〇〇13]步骤三、微嫁接:
[0014]在超净工作台上放置接种槽，然后在接种槽内放置灭菌的糯米纸并将糯米纸固定在接种槽内，将步骤二的接种砧木在距离根部4-5cm处截断，放置在糯米纸上;再将步骤一继代增殖得到的脱毒新会大红柑丛生芽的形成层对齐砧木并插入砧木切口内，压实砧木和脱毒新会大红柑丛生芽后，将糯米纸对折固定，获得微嫁接苗；
[0015]步骤四、培养移栽:[〇〇16]向试管内注入1/4体积的液体培养液，并环形放入2cm滤纸作为固定，经灭菌后，将步骤三获得的微嫁接苗，转移到液体培养液中，置于温度25°C、光照强度为2500-30001UX的恒温环境下培养30天，待砧木根部开始生长，丛生芽叶片正常舒展生长后，置于自然光中炼苗30天后，即可洗苗移栽，移栽成活率接近100 %。
[0017] 其中，步骤一中，所述改良MT培养基包括如下含量的组分:NH4N〇3 1700-1800mg/L; KN〇3 1800-2000mg/L；CaCl2 ? 2H20 830〇-8500mg/L；MgS〇4? 7H20 730〇-7500mg/L；KH2P〇4 3150-3200mg/L；KI 0.8〇-〇.90mg/L；H3B〇3 6.0-6.5mg/L；MnS04 ? 4H20 22.0-23.0mg/L； Na2Mo〇4 ? 2H20 0.2-0.3mg/L；CuS〇4 ? 5H20 0.02-0.03mg/L；CoCl2 ? 6H2O 0.02-0.03mg/L； FeS〇4.7H20 27.0-28.0mg/L;Na2_EDTA 37.0-38.0mg/L;烟酸4-6mg/L;盐酸吡哆醇 19-21mg/L;盐酸硫胺素 0 ? 3-0 ? 5mg/L;甘氨酸 1 ? 5-2 ? 5mg/L。[〇〇18]作为优选，步骤一中，所述改良MT培养基包括如下含量的组分:NH4N〇3 1750mg/L;KN〇3 1900mg/L；CaCl2 ? 2H20 8400mg/L；MgS〇4 ? 7H20 7400mg/L；KH2P〇4 3180mg/L；KI 0.83mg/L；H3B〇3 6.3mg/L；MnS〇4 ? 4H20 22.6mg/L；Na2Mo〇4 ? 2H20 0.25mg/L；CuS04 ? 5H20 0.025mg/L;CoCl2*6H2〇 0.025mg/L;FeS〇4.7H2〇 27.8mg/L;Na2-EDTA 37.3mg/L;烟酸5mg/ L;盐酸卩比咳醇20mg/L;盐酸硫胺素0 ? 4mg/L;甘氨酸2mg/L。[〇〇19]作为优选，步骤一中，所述保护培养基的配方为:改良MT培养基+30(wt)%甘油+15 (wt) %乙二醇+15(wt) %二甲基亚砜+鹿糖50g/L。
[0020]作为优选，步骤一中，所述继代培养基的配方为:改良MT培养基+BA 2mg/L+NAA 0 ? 05mg/L+琼脂 6 ? 5g/L+鹿糖 50g/L。[〇〇21]作为优选，步骤四中，所述液体培养液的配方为:改良MT培养基+IBA 0.5mg/L。 [〇〇22]本发明具有至少以下有益效果:
[0023](1)本培养法将新会大红柑母枝通过改良MT培养基预培养，经过液氮脱毒、解冻恢复，利用柠檬/香橙作为砧木，大大提高了抗恶劣环境性，提高了结果时期果皮发育和品质， 避免了“传统的新会大红柑嫁接多是用热处理脱毒，然后在田间茎尖嫁接，切开暴露在空气中，细菌或者病毒容易通过切开感染或者潜伏”的问题；
[0024](2)本培养法采用改良MT培养基预培养，改良之后继代增值系数大于4，基本没有出现玻璃化现象，变异也大大减少，而且让新会大红柑的果皮发育更好，色泽和品质更优秀;解决了现有技术中“用一般的MS培养基培养，腋芽叶片容易脱落，玻璃化或者变异;用传统MT培养基培养虽然玻璃化程度都有所降低，但和生长调节剂搭配后容易出现徒长，变异概率减少不明显”的问题。
[0025](3)本操作整个过程都在无菌环境进行，保证苗木嫁接过程不受病原体的入侵，没有了潜在危险。通过水培让植物根系发达，更容易适应南方潮湿多雨的气候环境，成活率大大提尚。【具体实施方式】
[0026]在下面的详细描述中，只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例。描述在本质上是说明性的，而不是用于限制权利要求的保护范围。[〇〇27] 实施例1
[0028]新会大红柑脱毒试管苗微嫁接方法，主要包括如下步骤:
[0029]步骤一、脱毒新会大红柑丛生芽的获得:
[0030]将消毒、灭菌处理的新会大红柑母枝在超净工作台上切取茎尖2mm，转移到改良MT 培养基中预培养，在4 °C黑暗条件下进行预培养3天后，将茎尖组织转移到保护培养基中冰冻适应lh，后将其转移到冷冻管并迅速投入液氮中，使茎尖组织快速降温到-196°C并持续 lh，然后再快速转移到45°C水中解冻恢复，然后接种到继代培养基中，25°C暗培养一周后进行常规光照培养，获得脱毒新会大红柑丛生芽;严格控制上述培养条件，利于提高了后期苗的抗恶劣环境性及结果时期坐果率和品质；[〇〇31]所述改良MT培养基包括如下含量的组分:NH4N〇3 1700mg/L;KN03 1800mg/L;CaCl2 ? 2H20 8300mg/L；MgS〇4 ? 7H20 7300mg/L；KH2PO4 3150mg/L；KI 0.80mg/L；H3B〇3 6.0mg/L；MnS〇4 ? 4H20 22.0mg/L；Na2Mo〇4 ? 2H20 0.2mg/L；CuS04 ? 5H20 0.02mg/L；CoCl2 ? 6H2O 0.02mg/L;FeS〇4.7H20 27.0mg/L;Na2-EDTA 37.0mg/L;烟酸4mg/L;盐酸吡哆醇 19mg/ L;盐酸硫胺素0.3mg/L;甘氨酸1.5mg/L;[〇〇32]所述保护培养基的配方为:改良MT培养基+30(wt)%甘油+ 15(wt)%乙二醇+15 (wt) %二甲基亚砜+鹿糖50g/L;[〇〇33]所述继代培养基的配方为:改良MT培养基+BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L+琼脂6.5g/L+鹿糖50g/L;[〇〇34]步骤二、砧木选择:
[0035]将柠檬或香橙种子在超净工作台经酒精、升汞消毒后接种到1/2MS培养基，待种子萌发后挑选出粗壮、生长状态好的幼苗，待幼苗生长到第二片真叶形成后，作为接种砧木待微嫁接；[〇〇36]步骤三、微嫁接:
[0037]在超净工作台上放置接种槽，然后在接种槽内放置灭菌的糯米纸并将糯米纸固定在接种槽内，将步骤二的接种砧木在距离根部4-5cm处截断，放置在糯米纸上;再将步骤一继代增殖得到的脱毒新会大红柑丛生芽的形成层对齐砧木并插入砧木切口内，压实砧木和脱毒新会大红柑丛生芽后，将糯米纸对折固定，获得微嫁接苗；[〇〇38]步骤四、培养移栽:[〇〇39]向试管内注入1/4体积的液体培养液，并环形放入2cm滤纸作为固定，经灭菌后，将步骤三获得的微嫁接苗，转移到液体培养液中，置于温度25°C、光照强度为2500-30001UX的恒温环境下培养30天，待砧木根部开始生长，丛生芽叶片正常舒展生长后，置于自然光中炼苗30天后，即可洗苗移栽，移栽成活率99 %。
[0040]其中，所述液体培养液的配方为:改良MT培养基+IBA 0.5mg/L。[〇〇41 ] 实施例2
[0042]新会大红柑脱毒试管苗微嫁接方法，主要包括如下步骤:
[0043]步骤一、脱毒新会大红柑丛生芽的获得:[〇〇44]将消毒、灭菌处理的新会大红柑母枝在超净工作台上切取茎尖1mm，转移到改良MT 培养基中预培养，在4 °C黑暗条件下进行预培养5天后，将茎尖组织转移到保护培养基中冰冻适应lh，后将其转移到冷冻管并迅速投入液氮中，使茎尖组织快速降温到-196°C并持续 lh，然后再快速转移到45°C水中解冻恢复，然后接种到继代培养基中，25°C暗培养一周后进行常规光照培养，获得脱毒新会大红柑丛生芽；[〇〇45]所述改良MT培养基包括如下含量的组分:NH4N〇3 1800mg/L;KN03 2000mg/L;CaCl2 ? 2H20 8500mg/L；MgS〇4 ? 7H20 7500mg/L；KH2PO4 3200mg/L；KI 0.90mg/L；H3B〇3 6.5mg/L；MnS〇4 ? 4H20 23.0mg/L；Na2Mo〇4 ? 2H20 0.3mg/L；CuS04 ? 5H20 0.03mg/L；CoCl2 ? 6H2O 0.03mg/L;FeS〇4.7H20 28.0mg/L;Na2-EDTA 38.0mg/L;烟酸6mg/L;盐酸吡哆醇21mg/ L;盐酸硫胺素0 ? 5mg/L;甘氨酸2 ? 5mg/L;[〇〇46]所述保护培养基的配方为:改良MT培养基+30(wt)%甘油+ 15(wt)%乙二醇+15 (wt) %二甲基亚砜+鹿糖50g/L;
[0047]所述继代培养基的配方为:改良MT培养基+BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L+琼脂6.5g/L+鹿糖50g/L;[〇〇48]步骤二、砧木选择:
[0049]将柠檬或香橙种子在超净工作台经酒精、升汞消毒后接种到1/2MS培养基，待种子萌发后挑选出粗壮、生长状态好的幼苗，待幼苗生长到第二片真叶形成后，作为接种砧木待微嫁接；
[0050]步骤三、微嫁接:
[0051]在超净工作台上放置接种槽，然后在接种槽内放置灭菌的糯米纸并将糯米纸固定在接种槽内，将步骤二的接种砧木在距离根部4-5cm处截断，放置在糯米纸上;再将步骤一继代增殖得到的脱毒新会大红柑丛生芽的形成层对齐砧木并插入砧木切口内，压实砧木和脱毒新会大红柑丛生芽后，将糯米纸对折固定，获得微嫁接苗；[〇〇52]步骤四、培养移栽:
[0053]向试管内注入1/4体积的液体培养液，并环形放入2cm滤纸作为固定，经灭菌后，将步骤三获得的微嫁接苗，转移到液体培养液中，置于温度25°C、光照强度为2500-30001UX的恒温环境下培养30天，待砧木根部开始生长，丛生芽叶片正常舒展生长后，置于自然光中炼苗30天后，即可洗苗移栽，移栽成活率98 %。[〇〇54]其中，所述液体培养液的配方为:改良MT培养基+IBA 0.5mg/L。
[0055]实施例3
[0056]新会大红柑脱毒试管苗微嫁接方法，主要包括如下步骤:[〇〇57]步骤一、脱毒新会大红柑丛生芽的获得:[〇〇58]将消毒、灭菌处理的新会大红柑母枝在超净工作台上切取茎尖2mm，转移到改良MT 培养基中预培养，在4 °C黑暗条件下进行预培养5天后，将茎尖组织转移到保护培养基中冰冻适应lh，后将其转移到冷冻管并迅速投入液氮中，使茎尖组织快速降温到-196°C并持续 lh，然后再快速转移到45°C水中解冻恢复，然后接种到继代培养基中，25°C暗培养一周后进行常规光照培养，获得脱毒新会大红柑丛生芽；[〇〇59]所述改良MT培养基包括如下含量的组分:NH4N〇3 1750mg/L;KN03 1900mg/L;CaCl2 ? 2H20 8400mg/L；MgS〇4 ? 7H20 7400mg/L；KH2PO4 3180mg/L；KI 0.83mg/L；H3B〇3 6.3mg/L；MnS〇4? 4H20 22.6mg/L；Na2Mo04 ? 2H20 0.25mg/L；CuS04? 5H20 0.025mg/L； C〇C12.6H2〇 0.025mg/L;FeS〇4.7H2〇 27.8mg/L;Na2-EDTA 37.3mg/L;烟酸5mg/L;盐酸吡哆醇20mg/L;盐酸硫胺素0 ? 4mg/L;甘氨酸2mg/L;
[0060]所述保护培养基的配方为:改良MT培养基+30(wt)%甘油+ 15(wt)%乙二醇+15 (wt) %二甲基亚砜+鹿糖50g/L;[0061 ] 所述继代培养基的配方为:改良MT培养基+BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L+琼脂6.5g/L+ 鹿糖50g/L;[0〇62] 步骤二、站木选择:
[0063]将柠檬或香橙种子在超净工作台经酒精、升汞消毒后接种到1/2MS培养基，待种子萌发后挑选出粗壮、生长状态好的幼苗，待幼苗生长到第二片真叶形成后，作为接种砧木待微嫁接；[〇〇64]步骤三、微嫁接:
[0065]在超净工作台上放置接种槽，然后在接种槽内放置灭菌的糯米纸并将糯米纸固定在接种槽内，将步骤二的接种砧木在距离根部4-5cm处截断，放置在糯米纸上;再将步骤一继代增殖得到的脱毒新会大红柑丛生芽的形成层对齐砧木并插入砧木切口内，压实砧木和脱毒新会大红柑丛生芽后，将糯米纸对折固定，获得微嫁接苗；[〇〇66]步骤四、培养移栽:
[0067]向试管内注入1/4体积的液体培养液，并环形放入2cm滤纸作为固定，经灭菌后，将步骤三获得的微嫁接苗，转移到液体培养液中，置于温度25°C、光照强度为2500-30001UX的恒温环境下培养30天，待砧木根部开始生长，丛生芽叶片正常舒展生长后，置于自然光中炼苗30天后，即可洗苗移栽，移栽成活率98 %。[〇〇68]其中，所述液体培养液的配方为:改良MT培养基+IBA 0.5mg/L。[〇〇69]实验证明，本培养法采用改良MT培养基预培养，改良之后继代增值系数大于4,基本没有出现玻璃化现象，变异也大大减少;本培养法使得新会大红柑的果皮发育更好，色泽和品质更优秀，更容易适应南方潮湿多雨的气候环境，成活率也大大提高。
[0070]以上所述仅为本发明示意性的【具体实施方式】，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作出的等同变化与修改，均应属于本发明保护的范围。
【主权项】
1.新会大红柑脱毒试管苗微嫁接方法，其特征在于，主要包括如下步骤:步骤一、脱毒新会大红柑丛生芽的获得:将消毒、灭菌处理的新会大红柑母枝在超净工作台上切取茎尖转移到改良MT培 养基中预培养，在4 °C黑暗条件下进行预培养3-5天后，将茎尖组织转移到保护培养基中冰 冻适应lh，后将其转移到冷冻管并迅速投入液氮中，使茎尖组织快速降温到-196°C并持续 lh，然后再快速转移到45°C水中解冻恢复，然后接种到继代培养基中，25°C暗培养一周后进 行常规光照培养，获得脱毒新会大红柑丛生芽；步骤二、站木选择:将柠檬或香橙种子在超净工作台经酒精、升汞消毒后接种到1/2MS培养基，待种子萌发 后挑选出粗壮、生长状态好的幼苗，待幼苗生长到第二片真叶形成后，作为接种砧木待微嫁 接；步骤三、微嫁接:在超净工作台上放置接种槽，然后在接种槽内放置灭菌的糯米纸并将糯米纸固定在接 种槽内，将步骤二的接种砧木在距离根部4-5cm处截断，放置在糯米纸上;再将步骤一继代 增殖得到的脱毒新会大红柑丛生芽的形成层对齐砧木并插入砧木切口内，压实砧木和脱毒 新会大红柑丛生芽后，将糯米纸对折固定，获得微嫁接苗；步骤四、培养移栽:向试管内注入1/4体积的液体培养液，并环形放入2cm滤纸作为固定，经灭菌后，将步骤 三获得的微嫁接苗，转移到液体培养液中，置于温度25°C、光照强度为2500-30001UX的恒温 环境下培养30天，待砧木根部开始生长，丛生芽叶片正常舒展生长后，置于自然光中炼苗30 天后，即可洗苗移栽。2.如权利要求1所述的新会大红柑脱毒试管苗微嫁接方法，其特征在于:步骤一中，所述改良MT培养基包括如下含量的组分:顺4如31700-180011^/1;謂03 1800-2000mg/L;CaCl2 ? 2H20 8300-8500mg/L;MgS04? 7H2〇7300_7500mg/L;KH2P〇4 3150-3200mg/ L；KI 0.80-0.90mg/L；H3B03 6.0-6.5mg/L；MnS〇4 ? 4H20 22.0-23.0mg/L；Na2Mo〇4 ? 2H20 0?2-0?3mg/L;CuS〇4? 5H200.02-0.03mg/L;CoCl2 ? 6H2O 0.02-0.03mg/L;FeS〇4? 7H20 27 ? 0-28 ? Omg/L;Na2-EDTA 37 ? 0-38 ? Omg/L;烟酸4-6mg/L;盐酸吡哆醇 19-21mg/L;盐酸硫胺 素0.3-0.511^凡;甘氨酸1.5-2.511^/匕3.如权利要求2所述的新会大红柑脱毒试管苗微嫁接方法，其特征在于，步骤一中，所述改良MT培养基包括如下含量的组分:NH4N〇3 1750mg/L;KN03 1900mg/L; CaCl2 ? 2H20 8400mg/L；MgS〇4 ? 7H20 7400mg/L；KH2PO4 3180mg/L；KI 0.83mg/L；H3B〇3 6.3mg/L；MnS〇4? 4H20 22.6mg/L；Na2Mo04 ? 2H20 0.25mg/L；CuS04? 5H20 0.025mg/L； C〇C12.6H2〇 0.025mg/L;FeS〇4.7H2〇 27.8mg/L;Na2-EDTA 37.3mg/L;烟酸5mg/L;盐酸吡哆 醇20mg/L;盐酸硫胺素0 ? 4mg/L;甘氨酸2mg/L。4.如权利要求3所述的新会大红柑脱毒试管苗微嫁接方法，其特征在于，步骤一中，所述保护培养基的配方为:改良MT培养基+30 (wt) %甘油+15 (wt) %乙二醇+ 15(wt) %二甲基亚砜+鹿糖50g/L。5.如权利要求3所述的新会大红柑脱毒试管苗微嫁接方法，其特征在于，步骤一中，所述继代培养基的配方为:改良MT培养基+BA 2mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂6.5g/L+鹿糖 50g/L。6.如权利要求3所述的新会大红柑脱毒试管苗微嫁接方法，其特征在于， 步骤四中，所述液体培养液的配方为:改良MT培养基+IBA 0.5mg/L。
【文档编号】A01H4/00GK105993633SQ201610579304
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月21日
【发明人】王立, 黄宏健, 谭沛涛, 胡杨, 陈小玲
【申请人】江门市新会区林业科学研究所