一种由珠心胚诱导顶坛花椒快速繁殖的方法
【专利摘要】本发明涉及一种由珠心胚诱导顶坛花椒快速繁殖的方法，属于植物生物技术领域。本发明以贵州地方品种顶坛花椒的未成熟果实为外植体，通过不同浓度的细胞分裂素和生长素组合诱导产生珠心胚和胚状体，并对珠心胚再生培养过程进行了研究，建立了顶坛花椒离体再生体系，为花椒种质资源的有效利用、脱毒保存、生物技术改良等提供理论依据和技术支持。
【专利说明】
一种由珠心胚诱导顶坛花椒快速繁殖的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及花椒组织培养的快繁方法，属于植物生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 顶坛花椒(Zanthoxylum planispinum var.dintanensis)是芸香科(Rutaceae)花 椒属（Zanthoxylum)竹叶椒（Zanthoxylum planispinum)的1个变种，分布于贵州北盘江花 江峡谷喀斯特山地或路旁，历来以"香味浓，麻味重，产量高"而著称，迄今已有数百年的栽 培历史。当顶坛花椒树龄处于5~9年时，生殖力达到峰值，要想获得较大的经济效益，应及 时砍伐老龄化个体，同时补植相应的幼株。顶坛花椒目前的繁殖方式主要是种子脱脂育苗， 由于其种壳坚硬，富含油脂，不透水，发芽较为困难，一粒种子最多产生一颗小苗。关于花椒 属植物的组织培养国内外均有报道，但主要是以嫩茎、叶片为外植体，很少以花椒种子为外 植体进行组织培养，而且对于顶坛花椒组培再生研究较少。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是顶坛花椒珠心胚诱导脱毒苗的方法，本研究通过建 立顶坛花椒离体再生体系，为花椒种质资源的有效利用、脱毒保存、生物技术改良等提供理 论依据和技术支持。
[0004] 本发明所要解决的技术问题是通过以下方案来实现的：
[0005] -种由珠心胚诱导顶坛花椒快速繁殖的方法，包括如下步骤：
[0006] (1)取顶坛花椒绿色果实内的珠心组织进行离体培养；
[0007] (2)MS+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 0.4mg/L+3%蔗糖+0.4%Gelzan为诱导培养基，诱导 珠心组织产生珠心胚；
[0008] (3)珠心胚继代培养，得到胚状体，继代培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 0.4mg/ L+3% 鹿糖+0 · 4%Gelzan;
[0009] (4)将胚状体于WPM+0.5mg/L 6-BA+O.lmg/L IBA的分化培养基进行培养，形成丛 生芽；
[0010] (5)将小芽切下转接到生根培养基l/2WPM+0.2mg/L IBA上培养并从主根上萌发侧 根，叶片青绿色；
[0011] (6)生根后的顶坛花椒进行炼苗移栽。
[0012] 所述绿色果实为成熟前7 -10天的果实。
[0013] 所述珠心组织取出前需要对绿色果实进行消毒，所述消毒步骤包括:在无菌条件 下用75%医用酒精浸泡杀菌1〇111；[11，无菌水冲洗一遍，用0.1%升萊灭菌301]1；[11，最后用无菌 水冲洗4~5次，吸水纸吸干表面水分。
[0014] 所述步骤(2)(3)(4)(5)的培养条件均为温度25±1°(：、光照强度1500~2000以、光 周期 16h/8h。
[0015] 所述步骤(2)的培养时长12 - 15天，所述步骤(3)的培养时长为25 - 35天。
[0016] 所述步骤(5)的培养时长为40 - 50天。
[0017]所述步骤(6)的生根苗为主根长达5cm，且侧根有4~5条。
[0018]所述步骤(6)中的生根苗移栽前在自然光下适应3 - 5天，取出冼净基部培养基再 移栽。
[0019]所述步骤(6)中移栽基质为珍珠岩:菜园土 = 1:3。
[0020] 所述步骤(6)中移栽后的生根苗加盖保鲜膜。
[0021] 本发明的方法:7月中上旬采集接近成熟的果实为外植体，要求是果实表面光滑、 无明显病斑、绿色果皮，在无菌条件下用75 %医用酒精浸泡杀菌lOmin，无菌水冲洗一遍，用 0.1% (w/v，含有tween_§〇?_)升萊灭菌30min，最后用无菌水冲洗4~5次，吸水纸吸干表面水 分。用枪状镊夹住消毒后的种子，23 #手术刀切取珠心组织进行离体培养。以MS+3%蔗糖(w/ v) +0.4 % Ge 1 zan (w/v)为基本培养基，pH5.8。添加细胞分裂素6-BA 2. Omg/L和生长素2，4-D 0.4mg/L诱导珠心组织产生诛心胚，培养条件为温度(25±1)°C、光照强度1500~20001x、光 周期16h/8h，15天左右出现明显的珠心胚。珠心组织培养产生的珠心胚继代培养一次，1个 月左右产生大量的胚状体。然后转接到WPM+0.5mg/L 6-BA+O. lmg/L IBA的分化培养基进行 培养，形成丛生芽。将小芽切下转接到生根培养基（l/2WPM+0.2mg/L IBA)上培养45d左右， 从主根上萌发侧根，主根长达5cm，形成侧根4~5条，叶片青绿色。生根试管苗在自然光下适 应4d，取出冼净基部培养基，移栽至基质为珍珠岩:菜园土=1:3的花盆中，加盖保鲜膜、保 持湿度，保证较高的移栽成活率。
[0022] 本发明方法用材少，外植体获取方便，果实消毒后切取珠心组织培养成活率高，无 褐变、无污染。珠心胚诱导胚状体产生丛生芽，再生繁殖系数高。
【附图说明】
[0023] 图1顶坛花椒接近成熟但尚未成熟的果实，
[0024]图2珠心胚的诱导培养，
[0025]图3胚状体的诱导培养，
[0026] 图4丛生芽的诱导，
[0027]图5生根培养，
[0028]图6移栽成活的花椒植株。
【具体实施方式】
[0029]下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0030] 以从贞丰县兴北镇引种到贵州省农业生物工程重点实验室转基因植物试验示范 基地的8年生顶坛花椒雌株为材料。
[0031] 7月12日采集大小接近成熟、表面光滑、无明显病斑、绿色果皮的未成熟果实见图1 为外植体，在无菌条件下用75%医用酒精浸泡杀菌lOmin，无菌水冲洗一遍，用0.1% (w/v， 含有tWeen80? )升汞灭菌30min，然后用无菌水冲洗4~5次，吸水纸吸干表面水分。用枪状镊 夹住消毒后的种子，23#手术刀切取珠心组织培养。
[0032] 以MS+6-BA 2.0mg/L+2,4_D 0.4mg/L+3%鹿糖(w/v)+0.4%Gelzan(w/v)、pH5.8为 初始培养基诱导珠心组织见图2，培养条件为温度(25 ± 1) °C、光照强度1500~2000lx、光周 期16h/8h，15天左右出现明显的珠心胚。
[0033]珠心组织培养产生的珠心胚继代培养一次，1个月左右产生大量的胚状体。见图3 [0034] 然后将得到的胚状体转接到WPM+0.5mg/L 6-BA+O.lmg/L IBA+3%蔗糖(w/v) + 0.4%Gelzan(W/V)分化培养基上进行培养，胚状体形成丛生芽。见图4 [0035] 将3cm高的小芽切下转接到生根培养基（l/2WPM+0.2mg/L IBA)上培养45d左右，从 主根上萌发侧根，主根长达5cm，形成侧根4~5条，叶片青绿色。见图5
[0036] 生根试管苗在自然光下适应4d，取出冼净基部培养基，移栽至基质为珍珠岩:菜园 土 = 1:3的花盆中，加盖保鲜膜、保持湿度。见图6。
[0037] 本发明方法用材少，外植体获取方便，果实消毒后切取珠心组织培养成活率高，无 褐变、无污染。珠心胚诱导胚状体产生丛生芽，再生繁殖系数高。
[0038] 表1不同6-BA和2,4-D对顶坛花椒珠心胚诱导率的影响(n = 20)
[0039]
【主权项】
1. 一种由珠心胚诱导顶坛花椒快速繁殖的方法，包括如下步骤： (1) 取顶坛花椒绿色果实内的珠心组织进行离体培养； (2) MS+6_BA 2·Omg/L+2，4_D 0·4mg/L+3%鹿糖+0·4%Gelzan为诱导培养基，诱导珠心 组织产生珠心胚； (3) 珠心胚继代培养，得到胚状体，继代培养基为MS+6-BA 2 · Omg/L+2，4-D 0 · 4mg/L+ 3%||^j|+0.4%Gelzan; (4) 将胚状体于WPM+0.5mg/L 6-BA+O. lmg/L IBA的分化培养基进行培养，形成丛生芽； (5) 将小芽切下转接到生根培养基l/2WPM+0.2mg/L IBA上培养并从主根上萌发侧根， 叶片青绿色； (6) 生根后的顶坛花椒进行炼苗移栽。2. 根据权利要求1所述的由珠心胚诱导顶坛花椒快速繁殖的方法，所述绿色果实为成 熟前7 -10天的果实。3. 根据权利要求1所述的由珠心胚诱导顶坛花椒快速繁殖的方法，所述珠心组织取出 前需要对绿色果实进行消毒，所述消毒步骤包括:在无菌条件下用75%医用酒精浸泡杀菌 lOmin，无菌水冲洗一遍，用0.1%升萊灭菌30min，最后用无菌水冲洗4~5次，吸水纸吸干表 面水分。4. 根据权利要求1所述的由珠心胚诱导顶坛花椒快速繁殖的方法，所述步骤(2)(3)(4) (5)的培养条件为温度25±1°C、光照强度1500~20001x、光周期16h/8h。5. 根据权利要求4所述的由珠心胚诱导顶坛花椒快速繁殖的方法，所述步骤(2)培养时 间12 - 15天，所述步骤(3)的培养时长为25 - 35天。6. 根据权利要求4所述的由珠心胚诱导顶坛花椒快速繁殖的方法，所述步骤(5)的培养 时长为40 - 50天。7. 根据权利要求6所述的由珠心胚诱导顶坛花椒快速繁殖的方法，所述步骤(6)的生根 苗为主根长达5cm，且侧根有4~5条。8. 根据权利要求7所述的由珠心胚诱导顶坛花椒快速繁殖的方法，所述步骤(6)中的生 根苗移栽前在自然光下适应3 - 5天，取出冼净基部培养基再移栽。9. 根据权利要求8所述的由珠心胚诱导顶坛花椒快速繁殖的方法，所述步骤(6)中移栽 基质为珍珠岩:菜园土 = 1: 3。10. 根据权利要求9所述的由珠心胚诱导顶坛花椒快速繁殖的方法，所述步骤(6)中移 栽后的生根苗加盖保鲜膜。
【文档编号】A01H4/00GK106069779SQ201610613782
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月30日 公开号201610613782.5, CN 106069779 A, CN 106069779A, CN 201610613782, CN-A-106069779, CN106069779 A, CN106069779A, CN201610613782, CN201610613782.5
【发明人】赵德刚, 李建容, 曾晓芳
【申请人】贵州大学