专利名称：肉的嫩化的制作方法
技术领域：
本发明涉及采用具有有限的底物特异性的不耐热酶的肉嫩化方法和组合物。
本发明
背景技术：
柔软性是影响肉产品的市场价格和消费者接受度的主要品质属性。牛肉一贯缺乏柔软性是造成牛肉在美国消费量递减的主要原因。为了改善肉的柔软性，有这样几种方法，包括机械嫩化、升温贮存、注射氯化钙、电刺激、肌肉伸展、冲击波施压、干和湿法老化和酶处理。最常用的一种方法是用酶处理，例如使用木瓜蛋白酶、波萝蛋白酶或无花果蛋白酶。然而这些酶具有非常宽广的特异性，且因此不加选择地对主要的肉蛋白(结缔组织/胶原和肌原纤维蛋白)进行水解，产生过嫩的(即糊状的)产品。而且，最常用的木瓜蛋白酶对热相当稳定，在烹饪期间或之后会造成不受控制的结构变质。
因此，在该技术领域中就有了对肉嫩化方法的需要，所述的方法采用了与木瓜蛋白酶不同的酶，所述的酶具有窄的底物特异性表现出对肉蛋白质的自限水解；水解两种主要肉蛋白质成分其中之一，而不是两者；不耐热，且因此在烹饪温度下，易于失活；且对风味没有不良影响。
本发明概述本发明提供了嫩化肉的方法，该方法是通过将肉与包含有效嫩化量的不耐热蛋白酶的溶液接触而实现的。优选该蛋白酶具有有限的底物特异性，使得其(a)对肉蛋白的消化只达了有限的程度和/或(b)只对两种主要的肉蛋白质成分中的一种进行消化。在一些实施方案中，该蛋白酶源自根粘菌属(Rhizomucor)的种，优选R.miehei。在一些实施方案中，蛋白酶源自哺乳动物，例如牛凝乳酶。该蛋白酶可以直接从R.miehei细胞分离，或者从用编码该蛋白酶的核酸转化的重组宿主细胞分离。优选该蛋白酶用过氧酸处理，以使其更不耐热。
接触步骤包括，但不仅限于对肉的注射；浸渍；或在屠宰之前对动物注射，且也可以包括在嫩化溶液中翻动(tumbling)所接触的肉。一般，用约0.001至约0.1AU/100g肉的重量比来进行蛋白酶与肉的接触，优选重量比是约0.005至约0.05AU/100g肉。
本发明方法提供的嫩化肉，显示出的相对剪切力(通过Warner-Bratzler方法测量得到)是嫩化之前的肉的相对剪切力的约50％至约90％，优选约60％至约80％。
另一方面，本发明提供使用本文所述方法制备的嫩化肉产品。
在还有的一个方面中，本发明提供一种肉嫩化组合物，该组合物包括具有有限底物特异性的不耐热蛋白酶和一种或多种的盐水、腌制剂和风味剂。
附图简述
图1表示的是不耐热的R.miehei蛋白酶(菱形标记)和木瓜蛋白酶(方块标记)的不耐热性情况。
图2表示的是用不耐热的R.miehei蛋白酶(菱形标记)和木瓜蛋白酶(方块标记)处理的肉的相对剪切力情况。
图3表示的是冷藏对嫩化肉的相对剪切力的影响。菱形标记，对照；方块标记是不耐热的R.miehei蛋白酶；三角标记，木瓜蛋白酶。
本发明的详细描述本发明提供用于嫩化肉的方法和组合物。本发明基于这样的发现，用具有有限底物特异性的不耐热蛋白酶处理肉，得到的肉相对于未嫩化的肉或用常规嫩化酶，例如木瓜蛋白酶处理的肉，显示出更优异的特性。
蛋白酶如本文中所使用的，不耐热蛋白酶指的是在高温下，例如在约50℃以上，其酶活性降低水平表达的蛋白酶，这是由于(a)通过蛋白酶催化的酶反应的不耐热性和/或(b)蛋白酶自身的结构不耐热性造成的。根据本发明，当酶反应在至少约70℃，优选至少约60℃，更优选至少约50℃的温度下进行时，不耐热蛋白酶显示出小于约75％，优选小于约50％，更优选小于约25％，最优选小于约10％的其最大酶活性。作为替换，或者与上述结合，不耐热蛋白酶是在至少约70℃，优选至少约60℃，更优选至少约50℃的温度下孵育5-30分钟之后，其活性降低至小于约75％，优选小于约50％，更优选小于约25％，最优选小于约10％的其最大酶活性的蛋白酶，且这是在未处理的酶正常显示其最大活性的温度下，测量其酶活性的。
如本文所使用的，具有有限底物特异性的蛋白酶是只识别特定多肽中的氨基酸子集作为水解蛋白质进攻靶标的蛋白酶。具有有限底物特异性的蛋白酶对实施本发明是有用的，包括但不仅限于，当将肉按例如下述实施例2中所述接触时，能(a)消化两种肉蛋白质成分中的一种或两种达到小于约10％，优选小于约5％，且最优选小于约2％的水解程度(DH)，和/或(b)只消化肉的两种主要蛋白质成分中的一种的那些蛋白酶。DH可以采用本领域中任何公知的方法进行测量，包括但不仅限于使用OPA(邻苯二醛)测量游离氨基的方法(Church等人，Anal.Biochem.146343，1985)(参见下文实施例3)；测量pH的减低；和测量重量摩尔渗透压浓度的增加。用于胶原和肌原纤维蛋白质水解的比较方法描述于例如下述实施例4中。
用于本发明的蛋白酶可以包含野生型或突变型酶。该酶可以从其原生细胞分离出来或可以使用本领域公知的常规方法重组制备出来。只要求蛋白酶显示出不耐热性，且优选具有有限的底物特异性和能够如本文所述对肉实行嫩化作用。
在一个实施方案中，用于实施本发明的蛋白酶源自根粘菌属物种，包括但不仅限于R.miehei或R.pusillus，优选R.miehei。R.miehei蛋白酶序列公开于美国专利US5800849中。
在另一个实施方案中，用于本发明的蛋白酶源自哺乳动物，例如，牛凝乳酶(从例如Chris Hansen，Inc.市售得到)。
上述酶可以是固有的不耐热或可以是通过本领域任何公知的方法赋予不耐热性，这些方法包括，但不仅限于天然酶的化学或其它处理，或通过将突变引入酶序列，产生增强的不耐热性。在一些实施方案中，通过用含活性氯(US4357357)或脂肪族或无机过氧酸(US4591565)的氧化剂处理，使R.miehei蛋白酶被赋予了更强的不耐热性。
嫩化肉的方法本发明提供嫩化肉的方法，该方法包括将肉与含有有效嫩化量的不耐热蛋白酶的溶液接触。在优选的实施方案中，蛋白酶具有有限的底物特异性。
本文所使用的“肉”包括但不仅限于肌肉，不管它是来源于活的动物还是屠体，或者屠宰得来的新鲜肉，以及冻肉、冷冻干燥肉和任何形式的再制肉(restructured meat)。
嫩化指的是使肉的质地更易于咀嚼，或者以其它方式令消费者更满意的方法。嫩化一般通过测量肉的相对剪切力或通过感官评定来进行评价。可使用Warner-Bratzler方法(Olson等人，《食品科学杂志》(J.Food Sci.)，42506，1977；和Fogle等人，《食品科学杂志》，471113，1982)来测量相对剪切力。在该方法中，肉样品被切割成直径0.75cm的圆柱体，沿着肉纤维的纵截面构成该圆柱体的轴。该样品被放置于V-形Warner-Bratzler刀片上，该刀片以2mm/秒的固定速度通过30-50mm的固定距离沿着样品的长度方向向下移动切割。通过各样品进行切割所需要的最大的力就是剪切力。
蛋白酶的有效嫩化量是导致相对剪切力降低至约50-90％，优选约60-80％的未处理肉的相对剪切力所需要的量。
在实施本发明中，酶与肉接触的(重量)比是约0.001至约0.1Anson单位(AU)/100g肉，优选约0.0025至约0.05AU/100g肉，最优选约0.005至约0.05AU/100g肉。一个AU被定义为在25℃，pH7.5条件下，10分钟以初始速率消化变性的血红蛋白的酶的量，其中释放三氯乙酸可溶性物质的量等于一毫当量的酪氨酸，这是使用酚试剂通过产生颜色而测定的。
接触步骤可以包括以下一种或多种方式(a)对肉直接注射；(b)浸渍肉；或(c)在屠宰之前对活的动物进行注射。应该理解，肉与蛋白酶接触的时间，以及肉接触的温度，将依赖于所采用的接触的方式(或方式组合)。例如，肉可以用含蛋白酶的溶液注射，并在5℃下贮存长达约2周时间。或者，在5-10℃下，浸渍肉约0.5至10小时。肉还可以在烹饪期间与蛋白酶接触。
该方法还可以包括在例如浸渍溶液中对肉进行翻动，例如在5-10℃下，翻动1-3小时。
应该理解，各反应条件(例如蛋白酶浓度、蛋白酶与肉的比例、接触方式、pH、温度和时间)可以变化，这依赖于肉和/或酶的来源和所需嫩化的程度。还应该理解，通过确立条件矩阵和测试该矩阵中不同的点，采用常规的实验手段可以得到最佳的反应条件。
在其它的实施方案中，本发明包括使用上述方法和组合物已被嫩化的肉和肉制品。
在其它实施方案中，本发明包括嫩化肉的组合物，其中除了不耐热蛋白酶以外，还包括盐水、腌制剂和风味剂中的一种或多种。盐水包括，但不仅限于氯化钠、磷酸盐、葡萄糖和其它成分。腌制剂包括，但不仅限于亚硝酸盐、糖和异抗坏血酸盐。风味剂包括但不仅限于香料(herbs)、调味品和液体熏制剂。
下述实施例只是举例说明，并不意味着是对本发明的限制。
实施例1R.miehei蛋白酶的不耐热性进行下述实验用以对R.miehei蛋白酶与嫩化肉最常用的木瓜蛋白酶的不耐热性进行比较。
在50、60和70℃下对酶进行30分钟热处理，之后使用Protazyme试剂盒(Megazyme International Ireland Ltd.)，按下述方法确定其残余的活性。
将1ml酶(在100mM磷酸氢二钠、30mM盐酸半胱氨酸、30mM EDTA，pH7.0中)添加进1ml含protazyme的缓冲液(100mM磷酸氢二钠、1％w/v十二烷基硫酸钠，pH7.0)，在连续搅拌下在40℃下培养10分钟，之后通过在剧烈搅拌下，添加10ml的2％(w/v)磷酸三钠(pH为12.3)将反应终止。容许该反应在室温下再维持2分钟，之后通过Whatman No.2过滤器将其过滤。对比空白基质，测定590nm下的上层清液吸光率，除了添加1ml缓冲液替代酶以外，该空白基质含同样的成分。
结果(
图1)显示不耐热R.miehei蛋白酶在大于60℃温度下，快速丧失其活性。
实施例2使用R.miehei蛋白酶的肉的嫩化进行下述实验以评定使用R.miehei蛋白酶的肉的嫩化情况。
方法购自当地屠宰场的牛肉(过了尸僵期的牛胴腱子肉，即死后72小时的)，并在新鲜状态下使用。样品经称重和用酶溶液注射净增量5％(湿肉重)，注射时，注射针相距约1英寸，压力为50psi。将肉在小型冷却器(5℃)中以7rpm翻动2小时，之后样品被切割成1″厚度的部分。
在5℃下，贮藏样品1周，并在第1、7和14天进行分析，然后进行如下的Warner-Bratzler剪切力的测定源自熟肉的核心样品(1”直径)在TAXT2结构分析器中进行Warner-Bratzler剪切力分析，且最大力作为柔软度的指标。通过30mm的固定距离测试速度是2mm/s。
结果测试的两种酶中，木瓜蛋白酶对牛肉的柔软度显示出较大的影响。在最低的浓度时，木瓜蛋白酶降低柔软度超过40％，且在更高的浓度下，使肉降低至呈糊状，使其不能够获得任何的柔软度评定结果(图2)。相反，不耐热R.miehei蛋白酶提供最佳的肉嫩化水平。而且，采用这种酶允许嫩化的肉的冷藏，不带有进一步的肉的水解降解(图3)。
实施例3水解程度(DH)的测量如下通过OPA对蛋白质水解产物进行DH分析通过将7.620g的十水四硼酸二钠(Aldrich22、133-3)和200mg的十二烷基硫酸钠(Sigma L-3771)溶于150ml水中，制备OPA试剂。
将160mg的97％的邻苯二醛(Sigma P-0657)溶于4ml乙醇中并添加进混合物中，用去离子水添加至200ml。将3ml OPA试剂添加进试管中，之后添加400μl标准丝氨酸或样品。在混合之后，该混合物被正好温育2分钟。之后在340nm测量吸光率。使用下式计算DH 丝氨酸NH2＝meqv丝氨酸NH2/g蛋白质X＝g样品P＝样品中蛋白质％0.1＝样品体积的升数h＝丝氨酸-NH2-βmeqv/g蛋白质b.DH＝h/htot*100％实施例4蛋白酶对于胶原和肌原纤维的水解潜力测量进行下述实验对肉的两种主要蛋白质成分的每一种进行蛋白酶相对活性的评定。
胶原酶活性1.将200μl的胶原酶(或蛋白酶)溶液(1mg/ml在Tris缓冲液中)添加进悬浮于3.8ml Tris缓冲液(0.02M三羟甲基氨基甲烷、0.005MCaCl2，pH7.4)的源自牛腱的20mg胶原中(Sigma)，使总体积是4.0ml。
2.在40℃下温育该混合物3小时，或在70℃下温育30分钟。
3.在微型离心机中，将该反应混合物以14000rpm下离心10分钟。
4.将1.5ml上清液与4.5ml 5N的HCl混合，并放置于110℃的烘干炉中16小时(过夜)，用于可溶肽的完全水解。
5.接着按如下对水解产物进行羟脯氨酸含量分析
羟脯氨酸含量1.用蒸馏水将水解产物稀释25倍。
2.将1.00ml的氯胺-T溶液添加进1.00ml的稀释水解产物中，并让该混合物在室温下放置20分钟。
3.在这段时间之后，添加1.00ml的显色试剂，且该反应混合物转移至60℃的水浴中，并温育15分钟。
4.取出试管，并冷却至室温。
5.在560nm下测量吸光率。
肌原纤维的提取(Olson等人，1976，J.Food Sci.，411036-1041)。
1.将100g的切碎肉在10倍体积(v/w)KCl-磷酸盐缓冲液(100mM KCl，20mM磷酸钾-pH7.0)中，以11000rpm匀浆30秒。
2.将匀浆物于1000g离心15分钟，且沉淀物再悬浮于5倍体积(v/w)缓冲液中，且在同样条件下再离心。
3.将沉淀物又一次再悬浮于5倍体积缓冲液中，并倾注通过滤网，用以去除结缔组织和碎屑。
4.将得到的肌原纤维悬浮液以1000g离心15分钟，再悬浮，并用缓冲液清洗两次。
5.将肌原纤维提取物悬浮在缓冲液中，并使用Leco蛋白质分析器确定蛋白质含量。
可溶蛋白质分析1.将0-100μl的酶溶液(1mg蛋白质/ml)添加进2.9-3.0ml肌原纤维提取物中，且在70℃下将反应混合物温育30分钟。
2.通过添加1.5ml的15％的三氯醋酸使反应停止，并且让该混合物在室温下放置15分钟。
3.在10000rpm下，将悬浮液离心8分钟，测量280nm的上清液的吸光度。
或者，1.向1.95ml肌原纤维提取物添加50μl的酶溶液(1mg蛋白质/ml)，并在70℃下温育30分钟。
2.通过添加2ml的15％的三氯醋酸使反应停止，并且让该混合物在室温下放置15分钟。
3.在10000rpm下，将悬浮液离心8分钟，测量280nm的上清液的吸光度。
实施例5牛凝乳酶的不耐热性进行下述实验，以测试牛凝乳酶的不耐热性。
对酶(来自Chris Hansen，Inc.的Chy-Max)在55、65和75℃下进行热处理30分钟，之后用Neutrase标准在pH7.5测定残余活性(使用血红蛋白作为底物以Anson单位表达)。
结果显示在超过60℃的温度下，牛凝乳酶快速丧失其活性，在加热到75℃后，只保留了10-15％的活性。
本文提到的所有专利、专利申请和文献以其全文的形式引入作为参考。
根据上述详细描述，本发明的许多变化对本领域普通技术人员是显而易见的。这些明显的变化均在附及的权利要求书的范围内。
权利要求
1.用于嫩化肉的方法，所述的方法包括将肉与有效嫩化量的不耐热蛋白酶接触。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的蛋白酶具有有限的底物特异性。
3.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白酶源自根粘菌属物种。
4.根据权利要求3的方法，其中所述的根粘菌属物种是R.miehei。
5.根据权利要4的方法，其中所述的蛋白酶在所述的接触之前用过氧酸处理。
6.根据权利要求1的方法，其中所述的蛋白酶源自哺乳动物。
7.根据权利要求6的方法，其中所述的哺乳动物是牛。
8.根据权利要求7的方法，其中所述的蛋白酶是凝乳酶。
9.根据权利要求1的方法，其中所述的蛋白酶从用编码所述蛋白酶的核酸转化的重组宿主细胞获得。
10.根据权利要求1的方法，其中嫩化后的所述肉显示出的相对剪切力是嫩化之前的所述肉的约50％至约90％。
11.根据权利要求10的方法，其中嫩化后的所述肉显示出的相对剪切力是嫩化之前的所述肉的约60％至约80％。
12.根据权利要求1的方法，其中所述的接触包括注射或浸渍。
13.根据权利要求12的方法，还包括将所述肉翻动。
14.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白酶与所述肉接触的比例是约0.001至约0.05AU/g肉。
15.根据权利要求1的方法，其中所述的肉选自新鲜肉、冻肉、冷冻干燥肉和再制肉。
16.使用权利要求1的方法获得的嫩化肉产品。
17.使用权利要求5的方法获得的嫩化肉产品。
18.一种嫩化肉的组合物，包括有效嫩化量的(i)不耐热蛋白酶和(ii)一种或多种风味剂。
19.根据权利要求18的组合物，其中所述的蛋白酶具有有限的底物特异性。
20.根据权利要求18的组合物，其中所述的蛋白酶源自根粘菌属物种。
21.根据权利要求20的组合物，其中所述的根粘菌属物种是R.miehei。
22.根据权利要求18的组合物，其中所述的蛋白酶是牛凝乳酶。
23.根据权利要求18的组合物，还包括盐水和/或腌制剂。
24.根据权利要求18的组合物，其中所述的风味剂选自香料、调味品、液体熏制剂和前述的任意组合。
25.一种嫩化肉的组合物，包括(i)有效嫩化量的不耐热蛋白酶和(ii)亚硝酸盐。
全文摘要
本发明涉及用于嫩化肉的方法,所述的方法包括将肉与有效嫩化量的不耐热蛋白酶接触。
文档编号A23L1/318GK1368854SQ00810617
公开日2002年9月11日 申请日期2000年7月21日 优先权日1999年7月22日
发明者I·阿什, T·索兰森, P·M·尼尔森 申请人:诺沃奇梅兹北美公司, 诺沃奇梅兹有限公司