专利名称：具有遗传相似性的片段的积累的制作方法
相关申请本申请是1999年11月29日递交的美国申请系列09/429,999的一个部分，该申请的全部引入作为参考。
本发明的详细说明本发明涉及鉴定两个个体中具有遗传相似性的DNA片段。如上所述，申请人已经设计了简单的方法生产富完全匹配的杂合体DNA IBD的DNA片段的样品，方法中利用了两个DNA样品的变性和再退火，接着选择性消化特定的DNA片段。这些方法可以用于简化归因于影响两个个体的疾病的遗传突变的鉴定。
在本发明的方法中，从两个个体如，从具有，怀疑具有，或携带或怀疑携带归因于感兴趣的疾病(例如，囊纤维变性，带有淀粉样变的遗传性脑出血(冰岛类型)，或成骨不全)的变化的遗传缺陷的个体(“测试个体”)中各获取含有基因组DNA的测试样品。在优选的实施方案中，归因于疾病的发展的遗传缺陷不需要知道，遗传缺陷是未知的，本发明的方法是用于鉴定是IBD，所以可以含有遗传缺陷的DNA区域。测试个体可以是成人，小孩或胎儿。含有基因组DNA的测试样品可以来自含有基因组DNA的任何来源，如，血液样品，羊膜液样品，脑脊髓液样品，或来自皮肤，肌肉，胎盘，胃肠道或其它器官的组织样品。来自胎儿细胞或组织的测试样品可以通过适当的方法获取，如，羊膜穿刺或绒膜取样。在优选的实施方案中，测试个体是远亲，即他们是第二亲等或更远的(即，表亲，祖辈和孙辈，或更远的亲缘个体)。更远的关系提供了更大量的遗传差异，因此增强了具有遗传相似性的DNA片段成为感兴趣的片段(例如，含有归因于疾病的发展的遗传缺陷)的可能性。可以利用常规技术(例如，溶解细胞，除去细胞碎片，从存在于混合物中的蛋白质，脂或其它成份中分离DNA)可以首先加工含有基因组DNA的测试样品，分离或部分地从其他细胞成分中纯化基因组DNA(参见例如，分子克隆实验室手册，第二版(Sambrook等人编辑)，CSHL实验室出版社，冷泉港，纽约，1989年)。
含有基因组DNA的测试样品(本文指“第一基因组DNA样品”和“第二基因组DNA样品”)起先是用限制性内切酶消化的，产生了更小的DNA片段(本文称为“初步消化”DNA样品)。在优选的实施方案中，限制性内切酶产生的初步消化DNA片段，约为5到10kb长度，优先地具有3‘突出端(例如，PstI，产生了具有4个碱基对的3’突出端)。如下面详细叙述，当外切酶III消化用于消除错配的异源杂合体DNA时，特定地，3‘末端的突出是优选的。如果利用其它特定的外切酶，也可以利用产生其它突出端或末端的限制性酶。
然后，利用标准技术将一个初步消化的DNA样品甲基化(例如，Marinus，M.G.，《遗传学年评》，21卷113-131页(1987年))。在优选的实施方案中，为了基本完全地甲基化来自一个来源的DNA序列，利用了序列特异甲基化酶，如Dam甲基化酶，或限制性甲基化酶。其它初步消化DNA样品仍然是未甲基化的。
然后，将已甲基化的样品(“已甲基化的初步消化DNA样品”)和未甲基化的样品(“未甲基化初步消化的DNA样品)混合，形成“DNA样品混合物”。将该DNA样品混合物进行适当的调节，允许样品中的DNA变性(“形成“变性DNA样品混合物”)，并随后再退火形成“退火的DNA样品混合物”。例如，变性可以利用标准的方法进行，如通过在约85到99度，优先地在95度加热样品混合物。如果加热变性DNA样品混合物，那么当样品混合物冷却时，发生再退火。在优选的实施方案中，在存在基于酚的乳液时，进行再退火过程，增强了再退火方法的效率(如Casna等人(核酸研究，14卷7285-7303页(1986年)；和Kohne，D.E.等人，生物化学，16卷(24)5329-41(1977年)所述的甲酰胺酚乳液化结合技术(FPERT)，这些参考文献的全部内容引入作为参考)。对于FPERT，将样品混合物与含有硫氰化钠，Tris HCl，EDTA和甲酰胺的FPERT混合物接触，产生FPERT反应混合物。然后，为了在反应混合物中再退火DNA片段，温育FPERT反应混合物。
该FPERT反应混合物产生了含有下述三种可能的DNA复合物类型的退火DNA样品再退火来自于第一个个体的基因组DNA样品的DNA的互补链产生的完全甲基化同源杂合体；再退火来自于第二个个体的基因组DNA样品的DNA的互补链产生的完全未甲基化的同源杂合体；退火来自各个个体的单链DNA产生的含有一条甲基化链和一条未甲基化链DNA的“半甲基化”异源杂合体。从各个样品的单链DNA的准确配对形成的半甲基化异源杂合体表示的是两个个体之间共享的IBD片段。
为了选择性地消化同源杂合体，将退火后的DNA样品混合物与一种或多种限制性内切酶，优选地是甲基化敏感限制性内切酶接触。例如，选择能够消化未甲基化的同源杂合体或甲基化的同源杂合体，而不能裂解半甲基化的异源杂合体的限制性内切酶。在优选的实施方案中，利用了限制性内切酶DpnI(消化甲基化同源杂合体)和MboI(消化未甲基化的同源杂合体)。或者，利用一种以上类型的内切酶靶击每种同源杂合体类型。得到的同源杂合体-消化的，退火的DNA样品混合物是富异源杂合体片段的。如本文所用，术语“富”是指，当与没有进行同源杂合体的选择性消化的退火DNA样品混合物比较时，异源杂合体片段与其他相同大小的(同源杂合体)片段的比例在同源杂合体-消化的，退火的DNA样品混合物中有相当大的增加。
将同源杂合体-消化的，退火的DNA样品混合物与选择性消化含有一种或多种错配碱基对的DNA异源杂合体，而保留了互补准确的匹配DNA异源杂合体的内切酶接触。选择性消化DNA异源杂合体的内切酶是在发生错配的点裂解双链DNA的两条链的内切酶。在优选的实施方案中，内切酶是T7内切酶I。利用T7内切酶产生了没有非特异5‘突出端的小DNA片段(小于约5kb)。这些小片段可以进一步用外切酶如外切酶III消化。完整的片段(T7内切酶I不切割)将能抵抗外切酶III的裂解，因为他们具有PstI3’突出端抗性。
得到的错配已消化样品混合物富完全匹配的异源杂合体片段；即，当与没有进行选择性消化错配异源杂合体样品混合物比较时，完全匹配的异源杂合体片段与其它相同大小的(含有错配)的片段的比例相当大地增加了。错配已消化样品含有包括遗传性片段(IBD片段)的完全匹配DNA杂合体。
然后，如果需要，可以进一步加工错配消化样品混合物中的IBD片段。例如，消化含错配的异源杂合体产生的小片段可以富重复序列。如果需要，通过将消化错配的DNA样品混合物与重复DNA(例如，COT-1重复DNA)的样品一起温育，可以使这些小片段对IBD片段的分析影响最小。例如，在允许富重复序列的小片段与重复DNA杂交的条件下(例如，加热混合物变性DNA片段，然后允许逐步冷却，从而允许富重复序列的小片段再退火成重复DNA)，将消化错配的DNA样品混合物与过量的富重复的DNA样品接触。
为了简化IBD片段的分析，可以利用标准方法，将IBD片段与具有限制性内切酶初步消化过程中产生的突出端兼容的末端的核酸接受体(例如，如果利用PstI，接受体与4个碱基对的3‘突出端兼容)连接。这些核酸接受体是具有已知序列的约15到40个碱基对长度的小DNA片段。在一个实施方案中，接受体的GC含量优选地约等于或小于60％。特定地，如果与富重复的DNA的杂交如上所述地进行接受体不连接没有突出端的片段(即，不连接重复DNA序列，因为它们已经退火成富重复的DNA)，那么接受体则简化了IBD片段操作。另外，如果需要IBD片段的扩增，利用接受体特异引物可以进行PCR或LR-PCR，以致只有在两个末端具有接受体的片段被扩增。参见，PCR技术DNA扩增的原理和应用(H.A.Erlich，Freeman出版社，NY，NY，1992年)；PCR方案方法和应用指导(Innis，等人，学术出版社，San Diego，CA，1990年)；Mattila等人，核酸研究，19卷，4967页(1991年)；Eckert等人，PCR方法和应用，1卷，17页(1991年)；PCR(McPherson等人，IRL出版社，牛津)；和美国专利4,683,202。在优选的实施方案中，利用了LR-PCR(参见例如，美国专利5,512,462，Burland，V.，和Kusukawa，N.，生物技术，23卷1070-1072页，1074-1075页(1997年)；Cheng，S.等人，美国国家科学院院刊，915695-5699页(1994年))。其它适当的扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)(参见Wu和Waliace，遗传学，4卷560页(1989年)，Landegren等人，科学，241卷，1077(1988年)，转录扩增(Kwoh等人，美国国家科学院院刊，86卷，1173页(1989年))，和，自身维持的序列复制(Guatelli等人，美国国家科学院院刊，87卷，1874页(1990年))和基于核酸的序列扩增(NASBA)。
在两个测试个体之间，一些IBD片段将偶而被共享，所以，将不包括含有归因于感兴趣的疾病的遗传突变的基因组区域(“感兴趣的基因组区域”)。为了使这样的“偶然”IBD片段的存在量最小，为了增加可能含有感兴趣的基因组区域的IBD片段(即，“感兴趣的IBD片段”)的存在量，可以利用IBD片段代替“第一基因组DNA样品”重复如上所述的方法。将IBD片段与来自第三的，远亲个体的新基因组DNA样品(“第三基因组DNA样品”)一起利用。第三个个体，和如上所述的第一和第二个个体一样，是具有，怀疑具有，携带或怀疑携带归因于感兴趣的疾病的发展的遗传缺陷的个体。将IBD片段和第三个基因组DNA样品消化，并且进行FPERT和如上所述的内切酶和外切酶消化。利用在每个循环中产生的感兴趣的IBD片段作为第一个基因组DNA样品，和来自第四，第五等等个体的基因组DNA的样品作为第二个基因组DNA样品，可以在循环的方法中重复上面的过程。如果需要，可以利用来自其它测试个体的基因组DNA样品尽可能多次地重复这些循环。循环过程除去了偶然共享的IBD区域，并且富感兴趣的IBD片段。
通过如上所述的方法得到的IBD片段可以分析他们的生物学功能，他们可以用于基因组图谱的基因拷贝，也可以用作鉴定感兴趣的基因的低核苷酸探针，以及用于鉴定可以归因于感兴趣的疾病的基因中的突变。例如，(利用32P，通过任意引导，如Smith，D.R.，分子生物学方法，58卷27-29(1996年))可以标记IBD片段，并且，这些片段可以用于探测文库，如细菌人工染色体(BAC)文库，或基因条排列(Hacia，J.G.和Collins，F.S.，医学遗传杂志，36卷(10)730-6页(1999年))，鉴定感兴趣的基因。
本文所述的方法提供了鉴定具有遗传相似性的基因组DNA区域的简单而便利的方法。本文所述的方法利用了识别异源杂合体中所有8个可能的错配的内切酶(例如，T7内切酶I)，而基因组错配扫描(GMS)中利用的MutHLS系统识别了7个；另外，利用单个内切酶需要的条件最佳化明显比三酶MutHLS系统要少。因为内切酶裂解错配DNA的两条链，随后，用外切酶消化裂解的片段，可以明显消除背景干扰。所以，不需要进行其他步骤(例如，在GMS中苯甲酰化，萘基化DEAE纤维素的步骤)除去单链DNA片段。另外，通过循环这些方法过程可以明显消除背景，从而，去除了对扩增IBD片段的需要。
本发明进一步通过下面的实施例说明，这些实施例不是用于限制的。所有本文引证的参考文献已全部引入作为参考。实施例鉴定与淀粉样变的遗传性脑出血(冰岛类型)相关的突变有淀粉样变的遗传性脑出血(冰岛类型)是一种鉴定得很好的疾病，是由于亮氨酸的密码子68中的T→A的点突变导致单个碱基变化Leu68→Gln(参见，例如，Levy，E.等人，实验方法杂志，69(5)1771-8(1989)；Johnsdottir，S.和Palsdottir，A.，生化医学代谢生物学49(2)117-23(1993)；Abrahamson，M.，和Grubb，A.，美国国家科学院院刊，91(4)1416-20(1994)；OlafssonI.，等人，脑病理学，6(2)121-6(1996)；Abrahamson，M.，ScandJ Clin Lab Invest Suppl，22647-56(1996)；Wei，L.等人，生物化学杂志，273(19)11806-14(1998)；Asgeirsson，B.等人，生物化学杂志，329(Pt3)497-503(1998)；Benedikz，E.等人，淀粉样变，6(3)172-82(1999))。突变通常是通过单个限制片段长度多态性(RFLP)试验确定的。由于这一特异于冰岛紊乱的建立者效应而具有远亲关系的两个受影响的个体被测试了确定是否基因组循环积累可以用于鉴定与疾病相关的突变。
样品的最初的处理和甲基化从静脉穿刺获取的血样中，得到来自每个个体的DNA样品。利用限制性内切酶PstI，浓度为10单位/μg DNA，混合物如下，独立地消化来自各个个体的DNA(12.5μg)PstI(100单位/μl) 2.5μl10X缓冲液3 100μl100XBSA 10μldH2O达到1000μl总共 1000μl缓冲液3∶100毫摩尔/升NaCl，50毫摩尔/升Tris-HCl，10毫摩尔/升MgCl2，1毫摩尔/升二硫苏糖醇(pH7.9，25度)。
在2小时后补充PstI(2.5μl)，然后，在37度温育混合物过夜。然后，在-80度，在100％的乙醇中(3倍体积)沉淀消化的DNA，然后，在4度离心30分钟。除去上清液，真空干燥沉淀20分钟。
将没有甲基化的样品在67.5μl dH2O中再悬浮，将甲基化的样品在105μldH2O样品中再悬浮。将每种样品5μl在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳，证明它们的消化。
将甲基化的样品与浓度为10单位/μg DNA的dam甲基化酶一起温育。在每个反应中，利用了下面的混合物DNA100μldH2O 147.9μl10X dam甲基化酶缓冲液 31.25μldam甲基化酶(8单位/μl) 31.25μlS-腺甲硫氨酸(32毫摩尔/升) 1.6μl总共 312.5μldam甲基化酶缓冲液50毫摩尔/升Tris-HCl(pH7.5)，10毫摩尔/升EDTA，5毫摩尔/升2-巯基乙醇。
在2小时后补充S-腺苷甲硫氨酸(1.6μl)，然后，将混合物在37度温育另外2小时。然后，在100％的乙醇中(3倍体积)，在-80度沉淀DNA，然后，在4度离心30分钟。除去上清液，真空干燥沉淀20分钟。在62.5μl dH2O中再悬浮样品。
甲酰胺酚乳液再结合技术(FPERT)然后，应用FPERT(参见，例如，Casna等人，(核酸研究，147285-7303页(1986)；Kohne，D.E.等人，生物化学，16卷(24)5329-41页(1977年))。将未甲基化的样品和甲基化样品一起混合，得到总共125μl样品混合物。然后，在95度热变性样品混合物10分钟，用下面的FPERT反应混合物再退火
同源杂合体的消化为了消化(所以量最少的)来自杂交的DNA样品的甲基化DNA和未甲基化的DNA的同源杂合体，用DpnI(消化甲基化的，双链DNA)和MboI(消化未甲基化的，双链DNA)消化已杂交的DNA样品。对于每个反应，利用了下面的消化混合物已杂交的DNA样品(模板)100μlDpnI(20unit/μl) 5μlMboI(5unit/μl) 5μl10X缓冲液4 60μl100XBSA 6μldH2O 424μl总共 500μl缓冲液4∶50毫摩尔/升乙酸钾，20毫摩尔/升Tris-乙酸，10毫摩尔/升乙酸镁，1毫摩尔/升二硫苏糖醇(pH7.9，25度)。
在37度温育消化混合物2小时。在-80度，100％的乙醇(3倍体积)中沉淀DNA 30分钟，然后在4度离心30分钟。除去上清液真空干燥沉淀20分钟。在202.5μldH2O中再悬浮得到的已消化DNA样品。利用在紫外光下，夹子胶片“点”的方法评估DNA产量(分子克隆实验室手册，第二版(Sambrook等人)，CSHL实验室出版，冷泉港，N.Y.1989年，E5-E6)。为此，将2.5μl已消化的DNA样品与2.5μl溴化乙锭(2μg/ml)一起点样，和水对照比较强度。已消化的DNA样品含有异源杂合体DNA。在除去错配异源杂合体DNA之前，将已消化的DNA样品分成4个40μl的等分。
除去错配的异源杂合体利用下面的错配反应混合物，利用T7内切酶I除去错配的异源杂合体T7内切酶(1∶100稀释)1μl内切酶I 10X缓冲液**29μl模板(含有异源杂合体DNA的已消化DNA样品) 50μldH2O129μl总共 200μl**内切酶I缓冲液50毫摩尔/升DTT(储备液，1摩尔/升，3毫升，150μl)；100毫摩尔/升MgCl2(储备液，1摩尔/升，3毫升，300μl)；500毫摩尔/升Tris-HCl，pH8.0(储备液，1摩尔/升，3毫升，1500μl)；1毫克/毫升BSA(储备液，10毫克/毫升，300μl)。
在37度，温育错配反应混合物30分钟；加入50单位的外切酶III(约25单位/微克DNA)，再温育45分钟。然后，在75度失活外切酶III 15分钟。然后，在-80度在100％的乙醇(3倍体积)中沉淀DNA，然后在4度离心30分钟。除去上清液，真空干燥沉淀20分钟。在30微升dH2O中再悬浮得到的完全匹配的DNA样品。
为了从完全匹配的DNA样品中除去具有PstI突出端的重复序列，在95度与COT-1(GIBCO)一起温育完全匹配的DNA样品(含有完全匹配的DNA异源杂合体)10分钟，允许冷却到室温1小时。
扩增序列为了扩增带有PstI突出端的完全匹配的异源杂合体，将接受体连接到完全匹配的DNA异源杂合体的每个末端(长接受体寡聚物，AGCTACATGGTAGATCGAATTCTCACTGCA(SEQ IDNO1)；短接受体寡聚物，GTGAGAATTCGATCTACCATGTAGCT-磷酸化(SEQ ID NO2))。通过将接受体寡聚核苷酸加热到95度维持5分钟，然后，允许通过慢慢降温到50度，再退火寡聚核苷酸，产生了PstI接受体溶液(1微摩尔/升)。连接反应混合物包括如下完全匹配DNA异源杂合体 5微升10X连接缓冲液 1微升DNA连接酶(400U/微升) 0.1-0微升接受体寡聚核苷酸(1微摩尔/升) 1微升dH2O 2.5-2.9微升(10微升)总共 10微升在室温下，与下面的对照dH2O+接受体，PstI-消化DNA+接受体，PstI-消化DNA-接受体一起温育连接反应混合物3小时。利用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen)，在柱上清洁得到的完全匹配DNA杂合体连接物。以50微升收集流出物。
LR-PCR进行LR-PCR是为了增强完全匹配的DNA的异源杂合体连接。美国专利申请系列号(DCGI 99-01)中详细地叙述了LR-PCR，该申请的全部内容引入作为参考。LR-PCR反应混合物如下
完全匹配DNA异源杂合体连接物6微升3.3X缓冲液 9.0微升(最后-1X)MgOAc 1.2微升(最后-1毫摩尔/升)dNTP(2毫摩尔/升) 3微升(最后-200微摩尔/升)GCE引物(微摩尔/升)***3微升(最后-0.5微摩尔/升)rTth pol混合物 0.6微升(最后-0.6U)dH2O 7.2微升总共 30微升***GCE 引物AGCTACATGGTAGATCGAATTCTCACTGCAG(SEQ ID NO3)在6微升DNA片段(模板)中加入24微升混合物，立即置于rTth pol外切核酸活性的热循环中。利用的是下面的循环(PE9600GeneAmp)1个循环是94度30秒；35个循环是90度10秒，60度10秒，和65度10分钟。
将5-10微升的得到的PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳。利用“Prep-a-Gene”试剂盒(Biorad)分离DNA，以便选择完全匹配的DNA异源杂合体连接反应中不同大小的PCR产物，用于BAC探测。
BAC探测为了进行BAC探测，通过将约10-20微升的PCR产物与12-22微升的dH2O混合，在95度加热5分钟，在冰上冷却，然后与下面的成分一起在37度温育1-4小时α32PdCTP(10毫居里/毫升)(7微升)；5X寡聚标记的混合物(10微升)，和克莱诺片段(1微升)(Amersham药学生物技术公司)，这样首先标记含有完全匹配的DNA异源杂合体连接物的PCR产物。
加入标记的PCR产物，预杂交(在65度快速杂交2小时)BAC膜，在65度杂交16小时。BAC膜包括一个400型任选膜，和已知包括与疾病相关的突变的PFLP-PCR产物的参考膜。然后，用2XSSC+0.1％SDS，在65度洗涤膜30分钟，两次。如果放射活性高(4,000-5,000cpm)，用0.1XSSC+0.1％SDS洗涤膜，直到放射活性水平下降到4,000cpm以下。然后，室温下，在6XSSC中漂洗膜20秒，5次，除去剩余的SDS。在Whatman滤纸上干燥膜10分钟，放置于夹子胶片层(Pelicola)之间。然后，将它们放置在带有MS X放射胶片(柯达)的盒子中，在-70度下暴光适当的时间(根据信号，约2到48小时)，然后显影。结果表明，在PCR产物中鉴定有突变，因此表明，通过本文所述的基因组循环累积方法可以鉴定突变。
参考优选的实施方案，已经特定地展示并叙述了本发明，本领域技术人员能够理解的是，不脱离附加的权利要求定义的发明的精神和范围，可以作各种形式和细节的修改。
权利要求
1.鉴定完全匹配的异源杂合体DNA片段的方法，这些片段包括两个个体之间具有遗传相似性的DNA，方法包括步骤a)各从两个个体获取基因组DNA样品，从而提供第一个基因组DNA样品和第二个基因组DNA样品。b)将第一个和第二个基因组DNA样品与限制性内切酶接触，从而分别形成第一个和第二个初步消化的DNA样品；c)甲基化初步消化的DNA样品，从而形成甲基化的初步消化DNA样品；d)将甲基化的初步消化DNA样品和第二个初步消化的DNA样品混合，形成DNA样品混合物；e)在允许变性DNA样品的条件下温育DNA样品混合物，从而形成变性的DNA样品混合物；f)在允许再退火DNA样品的条件下温育变性的DNA样品混合物，从而形成含有同源杂合体DNA片段和异源DNA片段的退火DNA样品混合物；g)将退火的DNA样品混合物与限制性内切酶接触，消化同源杂合体DNA片段，从而形成同源杂合体-消化的，退火DNA样品混合物；和h)将同源杂合体-已消化的，退火DNA样品混合物与内切酶接触，裂解含有错配的异源杂合体DNA片段的两条链，从而形成含有完全匹配的异源杂合体DNA片段的错配已消化的DNA样品混合物。其中，完全匹配的异源杂合体DNA片段含有两个个体之间具有遗传相似性的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的限制性内切酶是PstI。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤(e)中允许DNA样品变性的条件包括加热DNA样品混合物到约85-99度。
4.权利要求1所述的方法，其中步骤(f)中允许再退火DNA样品的条件包括在存在基于酚的乳液时，温育变性的DNA样品。
5.权利要求1所述的方法，其中步骤(g)中消化同源杂合体DNA片段的限制性内切酶包括DpnI和MboI。
6.权利要求1所述的方法，其中步骤(h)中裂解含有错配的杂合体DNA片段的两条链的内切酶含有T7内切酶I。
7.权利要求6所述的方法，另外包括步骤，将含有步骤(h)的完全匹配的异源杂合体DNA片段的错配已消化的DNA样品混合物与消化具有非特异5‘突出端的DNA片段的外切酶一起温育。
8.权利要求7所述的方法，其中外切核酸酶是外切酶III。
9.权利要求8所述的方法，另外包括步骤，将含有步骤(h)的完全匹配异源杂合体DNA片段的错配已消化的DNA样品混合物与重复DNA的样品在允许富重复序列的小片段与重复DNA杂交的条件下一起温育。
10.权利要求9所述的方法，其中重复DNA的样品含有COS-1DNA。
11.权利要求10所述的方法，其中另外包括步骤，将核酸接受体与完全匹配的异源杂合体DNA片段连接。
12.权利要求11所述的方法，其中另外包括进行LR-PCR，增与核酸接受体连接的异源杂合体DNA片段。
13.权利要求1所述的方法，其中另外包括利用完全匹配的异源杂合体DNA片段作为第一个基因组DNA样品，和将来自第三个个体的基因组DNA的样品作为第二个基因组DNA样品重复步骤(b)到步骤(h)。
14.鉴定含有在两个个体之间具有遗传相似性的DNA的完全匹配的异源杂合体DNA片段的方法包括步骤a)从两个个体各获取基因组DNA样品，提供了第一个基因组DNA样品和第二个基因组DNA样品；b)将第一个和第二个基因组DNA样品与限制性内切酶PstI接触，形成了第一个和第二个初步消化的DNA样品；c)将第一个初步消化的DNA样品甲基化，现成甲基化的初步消化的DNA样品；d)将已甲基化的初步消化DNA样品与第二个初步消化的DNA样品混合，形成DNA样品混合物；e)在允许变性DNA样品的条件下温育DNA样品混合物，形成变性的DNA样品混合物；f)在允许再退火DNA样品的条件下温育变性的DNA样品混合物，条件包括在存在基于酚的乳液中温育，从而形成含有同源杂合体DNA片段和异源杂合体DNA片段的退火DNA样品。g)将退火的DNA样品混合物与限制性内切酶DpnI和MboI接触，形成同源杂合体已消化的，退火DNA样品混合物；和h)将同源杂合体已消化的退火DNA样品混合物与T7内切酶I接触，形成含有完全匹配的异源杂合体DNA片段的错配已消化的DNA样品混合物。其中，完全匹配的异源杂合体DNA片段含有两个个体之间具有遗传相似性的DNA片段。
15.权利要求14所述的方法，另外包括步骤，将含有步骤(h)的完全匹配异源杂合体DNA片段的错配已消化的DNA样品混合物与外切酶III一起温育。
16.权利要求15所述的方法，另外包括步骤，将含有步骤(h)的完全匹配的异源杂合体DNA片段的错配已消化的DNA样品混合物与重复DNA样品在允许富重复序列的小片段与重复DNA杂交的条件下一起温育。
17.权利要求16的方法，其中重复DNA的样品包含COS-1DNA。
18.权利要求17所述的方法，另外包括步骤，将核酸接受体与完全匹配的异源杂合体DNA片段连接。
19.权利要求18所述的方法，另外包括进行LR-PCR，扩增与核酸接受体连接的完全匹配异源杂合体DNA片段。
20.权利要求14所述的方法，其中包括利用完全匹配的异源杂合体DNA片段作为第一个基因组DNA样品，和来自第三个个体的基因组DNA样品作为第二个基因组DNA样品重复步骤(b)到步骤(h)。
21.鉴定含有两个个体之间具有遗传相似性的DNA的完全匹配的异源杂合体DNA片段的方法，包括步骤a)各从两个个体获取基因组DNA样品，从而提供第一个基因组DNA样品和第二个基因组DNA样品；b)将第一个和第二个基因组DNA样品与限制性内切酶PstI接触，从而形成第一个和第二个初步消化的DNA样品；c)甲基化第一个初步消化的DNA样品，形成甲基化的初步消化的DNA样品；d)将甲基化的初步消化的DNA样品和第二个初步消化的DNA样品混合，形成DNA样品混合物；e)将DNA样品混合物在允许变性DNA样品的条件下温育，形成变性的DNA样品混合物；f)将变性的DNA样品混合物在允许再退火DNA样品的条件下温育，条件包括在存在基于酚的乳液时温育，形成含有同源杂合体DNA片段和异源DNA片段的退火DNA样品混合物；g)将退火的DNA样品混合物与限制性内切酶DpnI和MboI接触，形成同源杂合体-已消化的，退火DNA样品混合物；h)将同源杂合体-已消化的，退火DNA样品混合物与T7内切酶I接触，形成含有完全匹配的异源杂合体DNA片段的错配已消化的DNA样品混合物；i)将含有步骤(h)的完全匹配的异源杂合体DNA片段的错配已消化的DNA样品混合物与外切酶III一起温育；j)将含有步骤(h)的完全匹配的异源杂合体DNA片段的错配已消化的DNA样品混合物与COS-1 DNA的样品在允许富重复序列的小片段与COS-1 DNA杂交的条件下温育；k)连接核酸接受体与完全匹配的异源杂合体DNA片段；和l)进行LR-PCR，扩增与核酸接受体连接的完全匹配的异源杂合体DNA片段，其中，完全匹配的异源杂合体DNA片段含有在两个个体之间具有遗传相似性的DNA片段。
全文摘要
公开了鉴定含有在两种个体之间具有遗传相似性的DNA的DNA片段的方法。这些方法包括步骤:各从两个个体获取基因组DNA样品;将基因组DNA样品与限制性内切酶接触;将一个DNA样品甲基化;将甲基化的DNA样品与未甲基化的DNA样品混合,在变性条件下,温育DNA样品混合物;另外,在允许再退火DNA样品形成含有同源杂合体DNA片段和异源杂合体DNA片段的混合物的条件下温育DNA样品混合物;将混合物与消化同源杂合体DNA片段的限制性内切酶接触;将混合物与裂解含有错配的异源杂合体DNA片段的两条链的内切酶接触,形成含有富在两个个体之间具有遗传相似性的DNA片段的完全匹配的异源杂合体DNA片段的DNA样品混合物。
文档编号C12Q1/68GK1382222SQ00814836
公开日2002年11月27日 申请日期2000年10月18日 优先权日1999年10月29日
发明者斯特劳恩·格兰特, 索瑞英尼·布洛恩戴尔 申请人:解码遗传Ehf公司