评估施用自身或者其代谢中间物被ugt1a1酶代谢的化合物引起严重毒性的方法

专利名称：评估施用自身或者其代谢中间物被ugt1a1酶代谢的化合物引起严重毒性的方法
技术领域：
本发明涉及通过分析编码参与药物新陈代谢的酶的基因的多态性，评估药物的不良药物反应表现风险的方法。本发明也涉及用于评估药物不良反应表现风险的试剂盒。而且，本发明涉及根据药物不良反应表现风险的评估结果降低药物的不良药物反应表现风险的方法。
更具体地，本发明涉及通过分析编码UGT的基因的多态性，评估化合物施用引起药物不良反应表现风险的方法，该化合物或者本身被UDP-葡糖醛酸基转移酶(UGT)新陈代谢，或其代谢中间物被UGT新陈代谢；还涉及评估药物不良反应表现风险的试剂盒，及降低药物不良反应表现风险的方法。
背景技术：
在人类中有两种类型的UDP-葡糖醛酸基转移酶(UGT)，UGT1和UGT2，UGT1家族由一个基因以及多个启动子和与共同外显子2进行拼接的第一外显子组成(Ritter，J.K.，Chen，F.，Sheen，Y.Y.，Tran，H.M.，Kimura，S.，Yeatman，M.T.，和Owens，I.S.，J.Biol.Chem.，2673257-3261，1992)。因此，酶的底物特异性取决于第一外显子。
UGT1家族之一的UGT1A1基因由启动子和最接近外显子2到5的第一外显子组成。
主要负责缀合胆红素的UGT1A1酶能使药物(例如乙炔基雌二醇)、异生物素化合物(例如，酚，蒽醌和黄酮)和内源类固醇葡糖醛酸化(Senafi，S.B.，Clarke，D.J.，Bruchell，B.，Biochem.J.，303233-240，1994)。目前，已知在启动子区和外显子中有可以降低酶活性和引起体质性未结合型黄疸、克-纳(Crigler-Najjar)综合症或吉尔伯特病(Gilbert’s)综合症的不少于30种遗传多态性(Mackenzie，P.I.，等，Pharmacogenetics，7255-269，1997)。最近的体外分析表明UGT1A1同工型负责SN-38的葡糖醛酸化，而且此遗传多态性与降低的SN-38葡糖醛酸化活性及胆红素葡糖醛酸化活性有关(Iyer，L.，等，J.Clin.Invest.，101847-854，1998，Iyer，L.，等，Clin.Pharmacol.Ther.，65576-582，1999)。此外，本发明人提出了根据UGT1A1基因型的不同，个体间在SN-38和SN-38葡糖苷酸的药物代谢动力学方面存在差异(Ando，Y.，Saka，H.，Asai，G.，Sugiura，S.，Shimokata，K.，和Kamataki，T.，Ann.Oncol.，9845-847，1998)。
中间代谢物被UGT1A1酶代谢(缀合)的化合物之一是依立替康(irinotecan)(CPT-11)。羧酸酯酶使依立替康代谢形成活性的SN-38，SN-38进一步与UGT1A1缀合并被解毒产生其β-葡糖苷酸。然后葡糖苷酸通过胆汁排泄到小肠，细菌葡糖醛酸酶分解此葡糖苷酸为前体SN-38和葡糖醛酸(Takasuna，K.，Hagiwara，T.，Hirohashi，M.，Kato，M.，Nomura，M.，Nagai，E.，Yokoi，T.，和Kamataki，T.，Cancer Res.，563752-3757，1996)。SN-38药物代谢动力学的个体间差异被认为可以引起药物效果的变化(Gupta，E.，Lestingi，T.M.，Mick，R.，Ramirez，J.，Vokes，E.E.，和Ratain，M.J.，Cancer Res.，543723-3725，1994，Kudoh，S.，Fukuoka，M.，Masuda，N.，Yoshikawa，A.，Kusunoki，Y.，Matsui，K.，Negoro，S.，Takifuji，N.，Nakagawa，K.，Hirashima，T.，Yana，T.，和Takada，M.，Jap.J.Cancer Res.，86406-413，1995)。
依立替康是喜树碱类似化合物，而且，已知其通过抑制拓扑异构酶I具有强的抗肿瘤活性。尽管现在，特别是对于结肠直肠癌和肺癌治疗，广泛使用依立替康，但是存在对引起白细胞减少和/或腹泻的依立替康剂量限制性毒性的担忧(Negoro，S.等，J.Natl.Cancer Inst.，831164-1168，1991，Akabayashi，A.，Lancet，350124，1997，Pharmaceuticals and CosmeticsDivision，Pharmaceutical Affairs Bureau，Ministry of Health andWelfare(编辑)，Summary basis of Approval(SBA)NO.1(修订版)irinotecan hydrochloride.TokyoYakuji Nippo，Ltd.，1996)。依立替康的药物不良反应偶尔是致命的(Rougier，P等，Lancet，3521407-1412，1998，Kudoh，S.等，J.Clin.Oncol.，161068-1674，1998，Masuda，N.等，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.，18459a，1999，Negoro，S.等，J.Natl.Cancer Inst.，831164-1168，1991)，而且，在依立替康临床试验期间，实际上据报告1245例患者中有55例因依立替康药物不良反应而死亡(Akabayashi，A.，Lancet，350124，1997，Pharmaceuticals and Cosmetics Division，PharmaceuticalAffairs Bureau，Ministry of Health and Welfare(主编)，Summary Basis ofApproval(SBA)No.1(修订版)irinotecan hydrochloride.TokyoYakujiNippo，Ltd.，1996)。
Retain等建议了一种通过利用可以增强UGT活性的化合物降低依立替康药物不良反应的方法(美国专利号5786344)。
发明的公开如上所述，其代谢与UGT1A1酶有关的药物的不良药物反应是一个严重问题。然而，没有评估这种药物不良反应的已知有效方法。另一方面，因为在癌症化疗中在许多情况下会限制治疗指数，所以根据个体制定药物剂量以降低药物的不良反应及增强其效果变得非常重要。
鉴于这种情况，本发明的一个目的是提供降低化合物，如依立替康的施用的药物不良反应的划时代方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被此酶代谢。即，本发明的目的是提供评估由化合物给药引起的药物不良反应的表现风险的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被此酶代谢；利用该方法的试剂盒；降低化合物的药物不良反应表现风险的方法。
为了解决上述问题，本发明人致力于研究编码UGT1A1酶的基因的多态性。更具体地，调查研究了在癌症化疗期间接受依立替康给药的患者的UGT1A1基因多态性与依立替康药物不良反应间的相关性。特别地，研究了UGT1A1基因的启动子区、外显子1、外显子4和外显子5中的多态性。结果，认识到依立替康药物不良反应和多态性间的相关性，所述多态性为由于启动子区中TA重复数目的不同引起的多态性或由于外显子1中的单碱基置换(211位置的碱基，686位置的碱基)引起的两种多态性。这些发现表明在UGT1A1基因的这些多态性与化合物给药引起的药物不良反应程度之间存在相关性，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被该酶代谢。因此，分析这些UGT1A1基因多态性被认为是评估化合物，如依立替康给药引起的药物不良反应表现风险的有效方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被该酶代谢。特别地，对于启动子区的多态性和由于外显子1中686位置碱基置换引起的多态性，认识到这些多态性的每一个都单独地与依立替康药物不良反应具有相关性，因此，这两个多态性的分析被认为可以独立地成为评估化合物给药引起的药物不良反应表现风险的有效方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被该酶代谢。本发明是根据上述发现和研究结果进行的，有下列特征1、评估化合物给药引起的药物不良反应表现风险的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被该酶代谢，所述方法包括至少(a)分析编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复数的步骤。
2、如1的方法，其中分析TA重复数的步骤是检测TA重复数为5到8之任何一个的步骤。
3、如1的方法，其中分析TA重复数的步骤是检测TA重复数为6或7的步骤。
4、如1到3任一项的方法，其中进一步包括扩增含有编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复区的DNA的步骤。
5、如1到4任一项的方法，其是评估化合物给药引起的药物不良反应表现风险的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被该酶代谢，所述方法进一步包括(b)分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的步骤，和/或(c)分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的步骤。
6、如5的方法，其中分析核苷酸第686位碱基的步骤是分析是否核苷酸第686位碱基是胞嘧啶或腺嘌呤的步骤。
7、如5的方法，其中分析核苷酸第211位碱基的步骤是分析是否核苷酸第211位碱基是鸟嘌呤或腺嘌呤的步骤。
8、如5到7任一项的方法，进一步包括步骤扩增含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的DNA，和/或含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的DNA。
9、评估化合物给药引起的药物不良反应表现风险的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被该酶代谢，所述方法包括至少(b)分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的步骤。
10、如9的方法，其中分析核苷酸第686位碱基的步骤是分析是否核苷酸第686位碱基是胞嘧啶或腺嘌呤的步骤。
11、如9或10的方法，其中进一步包括扩增含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的DNA的步骤。
12、如1到11任一项的方法，其中化合物是喜树碱类似化合物。
13、如12的方法，其中喜树碱类似化合物是喜树碱衍生物。
14、如13的方法，其中喜树碱衍生物是拓扑替康(topotecan)或依立替康。
15、如13的方法，其中喜树碱衍生物是依立替康。
16、制定化合物剂量的方法，其包括步骤根据1到15任一项的评估药物不良反应表现风险的方法的结果制定化合物的剂量。
17、用于分析编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复数的核酸，其与来源于含有编码UGT1A1酶的基因的TA重复区碱基的区域的DNA片段特异性地杂交，并可以利用引物SEQ ID No.7和SEQ ID No.8通过PCR方法扩增。
18、用于分析编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复数的核酸，其与来源于含有编码UGT1A1酶的基因的TA重复区碱基的区域的DNA片段特异性地杂交，并可以利用引物SEQ ID No.9和SEQ ID No.10通过PCR方法扩增。
19、用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的核酸，其与来源于含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的区域的DNA片段特异性地杂交，并可以利用引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2通过PCR方法扩增。
20、用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的核酸，其与来源于含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的区域的DNA片段特异性地杂交，并可以利用引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4通过PCR方法扩增。
21、评估化合物给药引起的药物不良反应表现风险的试剂盒，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被该酶代谢，所述试剂盒包括用于分析编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复数的核酸。
22、如21的试剂盒，其进一步包括用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的核酸，和/或用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的核酸。
23、评估化合物给药引起的药物不良反应的表现风险的试剂盒，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被该酶代谢，所述试剂盒包括用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的核酸。
24、如21到23任一项的试剂盒，其中化合物是喜树碱类似化合物。
25、如24的试剂盒，其中喜树碱类似化合物是喜树碱衍生物。
26、如25的试剂盒，其中喜树碱衍生物是拓扑替康(topotecan)或依立替康。
27、如25的试剂盒，其中喜树碱衍生物是依立替康。
28、预先评估依立替康药物不良反应的表现风险的试剂盒，其包括至少(a)用于分析编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复数的核酸，或(b)用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的核酸。
29、如28的试剂盒，其是评估依立替康药物不良反应的表现风险的试剂盒，其进一步包括用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的核酸。
30、评估依立替康药物不良反应的表现风险的试剂盒，其包括至少(a)用于分析编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复数的核酸，或(b)用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的核酸，并且其进一步包括用于扩增含有编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复区的DNA、或含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的DNA的试剂。
31、如30的试剂盒，其是用于评估依立替康药物不良反应的表现风险的试剂盒，其进一步包括用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的核酸和用于扩增含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的DNA的试剂。
附图简述

图1是概述实施例中分析的UGT1A1基因多态性的表。211G→A表示在位置211处腺嘌呤置换鸟嘌呤，686C→A表示在位置686处腺嘌呤置换胞嘧啶，1099C→G表示在位置1099处鸟嘌呤置换胞嘧啶，和1456T→G表示在位置1456处鸟嘌呤置换胸腺嘧啶。此外，G71R表示在密码子71位精氨酸置换甘氨酸，P229Q表示在密码子229位谷氨酰胺置换脯氨酸，R367G表示在密码子367位甘氨酸置换精氨酸，和Y486D表示天冬氨酸置换酪氨酸。
图2是概述患者临床信息的表，这些患者是实施例中的受试者。“a”基于日本临床肿瘤学协会(Japan Society of Clinical Oncology)的标准。此外，“b”表示卡方检验的结果，“c”表示Mann-Whitney U检验的结果。
图3是概述患者的依立替康化疗信息的表，这些患者是实施例中的受试者。a日本临床肿瘤学协会(Japan Society of Clinical Oncology)的标准，b卡方检验，c费希尔确切检验(Fisher’s Exact test)。
图4是概述基因型分布的表。6/6表示TA重复数是6的等位基因的纯合子，6/7表示TA重复数是6的等位基因和TA重复数是7的等位基因的杂合子，和7/7表示TA重复数是7的等位基因的纯合子。Gly/Gly表示71位密码子是甘氨酸的等位基因的纯合子，Gly/Arg表示71位密码子是甘氨酸的等位基因和71位密码子是精氨酸的等位基因的杂合子，Arg/Arg表示71位密码子是精氨酸的等位基因的纯合子。Pro/Pro表示229位密码子是脯氨酸的等位基因的纯合子，Pro/Gln表示229位密码子是脯氨酸的等位基因和229位密码子是谷氨酰胺的等位基因的杂合子。a日本临床肿瘤学协会(Japan Society of Clinical Oncology)的标准，b平均值(四分位间距)。
图5的表显示了UGT1A1*28和其它因素对严重毒性的影响的统计比较(多重逻辑回归分析)结果。a.协同因素，b依立替康和其它抗癌药剂(除了铂制剂外)联合的治疗方案。
最佳实施方式本发明涉及评估化合物给药引起的药物不良反应的表现风险的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被该酶代谢，所述方法包括(a)分析编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复数的步骤。
UGT1A1酶是一种UDP(尿苷二磷酸)-葡糖醛酸基转移酶(UGT)分子。UGT是在活体中催化内源物质如胆红素和类固醇、有特定结构的药物等与葡糖醛酸缀合(葡糖苷酸缀合)的酶的总称，并且其参与许多药物的解毒作用。如上述，已知UGT1A1积极参与依立替康的代谢。
编码UGT1A1酶的基因(此后称为“UGT1A1基因”，Gen Bank记录号AF297093)有启动子区、外显子1、和外显子1后排列的外显子2到外显子5。已知在启动子区和外显子1到外显子5中存在大量多态性。启动子区的多态性是由于一对碱基(TA)的重复(TA重复)数目的差异引起的，而且存在称为(TA)5，(TA)6，(TA)7和(TA)8(分别表示存在的TA重复数为5，6，7，8)的多态性(Monaghan，G.等，Lancet，347578-581，1996，Bosma，P.J.等，N.Engl.J.Med.，3331171-1175，1995，Lampe JW等，Pharmacogenetics，9，341-349，1999)。
本发明中“分析TA重复数”意思是检测试验基因的启动子区中的TA重复数其包括检测为5到8之任一个的TA重复数；检测为6或7的TA重复数。
另一方面，可以制定出评估化合物给药引起的药物不良反应的表现风险的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被酶代谢，该方法包括(b)分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的步骤。
此外，可以通过包括上述步骤(a)和(b)构成本发明的方法。并且，可以通过包括上述步骤(a)和步骤(c)分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的步骤构成本发明的方法。而且，可以通过包括上述步骤(a)，(b)和(c)构成本发明的方法。这里，核苷酸第686位的碱基是UGT1A1基因中按下游方向从转录起始位点计算的第686位碱基；核苷酸第211位碱基是以同样方法计算的第211位碱基。
步骤(b)是分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的步骤。已知在核苷酸位置686存在多态性，即两种碱基胞嘧啶(C)或腺嘌呤(A)(Aono，S.等，Lancet，345958-959，1995)。因此，“分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基”特别指检测核苷酸位置686的碱基是否胞嘧啶或腺嘌呤。
步骤(c)是分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的步骤。已知在核苷酸位置211存在碱基多态性，即两种碱基鸟嘌呤(G)或腺嘌呤(A)(Aono，S.等，Lancet，345958-959，1995)。因此，“分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基”特别指检测核苷酸位置211的碱基是否鸟嘌呤或腺嘌呤。
如上所述，在检测核苷酸位置686的碱基、核苷酸位置211的碱基和/或启动子区中TA重复数时，两个等位基因都可以是分析的靶。
对分析TA重复数的方法和分析核苷酸位置686或211的碱基的方法并不进行特别限定，但是可以利用已知的分析方法如利用PCR方法的PCR-RFLP(聚合酶链式反应限制性片段长度多态性)方法，PCR-SSCP(单链构象多态性)，(Orita，M等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.86，2766-2770(1989)等)，PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)方法，ASO(等位基因特异性寡核苷酸)杂交方法(其中联合PCR-SSO方法和点杂交方法(Saiki，Nature，324，163-166(1986)等))，TaqMan-PCR方法(Livak，KJ，Genet Anal，14，143(1999)，Morris，T.等，J.Clin.，Microbiol.，34，2933(1996))，侵入者(Invader)方法(Lyamichev V等，Nat Biotechnol，17，292(1999))，利用引物延伸方法的MALDI-TOF/MS(矩阵)方法(Haff LA，Smirnov IP，Genome Res 7，378(1997))，RCA(滚环扩增)方法(LizardiPM等，Nat Genet 19，225(1998))，利用DNA芯片或微阵列的方法(WangDG等，Science 280，1077(1998)等)，引物延伸方法，Southern印迹杂交方法，点杂交方法(Southern，E.，J.Mol.Biol.98，503-517(1975))等等。而且，通过直接对这些序列的相关部分测序，也可以进行分析。这些方法可以通过和其它方法任意组合使用。此外，当至少进行(a)到(c)中两个步骤来评估药物不良反应表现风险时，当然不仅可以对所有步骤使用相同分析方法，也可以对每个步骤使用任意选定的不同方法。
从检测灵敏度或精确性的角度考虑，当试验DNA量少的时候，优选通过利用PCR方法的PCR-RFLP方法等进行分析。作为替代方案，可以在通过PCR方法或根据PCR方法的基因扩增方法提前扩增试验DNA后，应用上述分析方法的任何一种。另一方面，当分析多种试验DNA时，特别优选利用TaqMan-PCT方法，侵入者(Invader)方法，利用引物延伸方法的MALDI-TOF/MS(基质)方法，RCA(滚环扩增方法)，或利用DNA芯片或微阵列的方法。
通过公知的提取方法或纯化方法，可以从试验者的血液，皮肤细胞，粘膜细胞，头发等等得到UGT1A1基因。此外，含有本发明分析的碱基部分的任何基因，无论其DNA是全长还是部分，都可以用做本发明的UGT1A1基因。换而言之，在分析启动子区中(TA)重复数的步骤中，可以利用任意长度的DNA片段，只要其含有此重复部分即可。此外，在分析核苷酸位置686的碱基的步骤中，也可以利用任意长度的DNA片段，只要其含有此相关碱基部分即可。类似地，在分析核苷酸位置211的碱基的步骤中，也可以使用任意长度的DNA片段，只要其含有此相关碱基部分即可。
而且，在每一步骤中亦可以用UGT1A1基因的转录产物mRNA进行分析。在这种情况下，例如，从试验者血液或类似物提取和纯化UGT1A1基因的mRNA，之后通过反转录制备cDNA。通过分析cDNA的碱基序列，可以提前评估与基因组DNA多态性有关的部分的序列。
并且，通过利用UGT1A1基因的表达产物，可以检测外显子1中的两种多态性。即，通过分析外显子1多态性部分的表达产物(氨基酸)，可以检测其基因型。在这种情况下，只要此外显子1的多态性部分含有相应的氨基酸，甚至可以检测部分肽。具体地，因为外显子1位置211的多态性可以改变71位密码子(产生甘氨酸或精氨酸)，故可以利用至少含有对应于密码子71的氨基酸的肽作为检测的对象。类似地，因为外显子1位置686的多态性可以改变229位密码子(产生脯氨酸或谷氨酰胺)，故可以利用至少含有对应于密码子229的氨基酸的肽作为检测的对象。当利用含有对应于密码子71的氨基酸和对应于密码子229的氨基酸的肽或蛋白质时，同时分析两种多态性是可能的。
作为利用肽或蛋白质分析对应于多态部分的氨基酸的方法，可以利用熟知的氨基酸序列分析方法(利用Edaman法的方法)。此外，估计由于氨基酸的改变，UGT1A1基因的表达产物构象将改变，由此通过免疫方法可以分析氨基酸的种类。免疫方法的例子包括ELISA方法(酶联免疫吸附测定法)，放射免疫测定法，免疫沉淀方法，免疫扩散方法等等。
“本身被UGT1A1酶代谢或其代谢中间物被该酶代谢的化合物”指当向活体给药时在体内直接被UGT1A1酶代谢的化合物；或指这样的化合物，其曾被酶或类似物进行过代谢，而由此产生的代谢物(中间代谢物)被UGT1A1酶代谢。只要化合物有这种属性，不对其作特别限定；例如，对应于此化合物的喜树碱类似化合物。任何化合物都是适宜的并不存在限制，只要该化合物是有上述属性的喜树碱类似化合物即可；例如，已知的喜树碱衍生物，如拓扑替康(topotecan)，依立替康(CPT-11)等等。而且，在保持上述属性的情况下，所述化合物可以是在公共已知的喜树碱类似化合物和喜树碱衍生物(拓扑替康(topotecan)，依立替康等)中将一个或几个取代基替代为其它原子或原子基团的化合物。
本身被UGT1A1酶代谢或其代谢中间物被该酶代谢的化合物的适宜例子是依立替康。
本发明中药物不良反应的表现风险指由化合物给药引起药物不良反应的风险。这里，药物不良反应指当施予本发明化合物后与预期效果(药物效力)不同的作用或效果，不仅包括对活体的有害影响，也包括化合物固有作用的降低。因此，在本发明的方法中，化合物给药时出现固有作用降低的风险也包括在药物不良反应表现风险中。
当本发明化合物是依立替康时，药物不良反应的例子是白细胞减少和腹泻。这些症状对服用依立替康的患者偶尔有致命的有害作用。
可以利用药物不良反应表现风险的评估结果来设定化合物的剂量。这样，本发明的另一方面是制定化合物剂量的方法，其包括步骤根据上述评估药物不良反应表现风险的方法的结果制定化合物的剂量。根据这种剂量制定方法，通过比较化合物给药引起的药物不良反应的程度和最初预期的化合物给药的效果程度，对每个服药的受试者(患者)制定适合的剂量是可能的。因此，用化合物进行有效的治疗并同时抑制药物不良反应的出现是可能的。换而言之，本发明提供了降低化合物的药物不良反应的方法。
本发明的另一方面提供了用于分析编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复数的核酸(此后称为“TA重复数分析核酸”)，用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的核酸(此后称为“686位置分析核酸”)和用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的核酸(此后称为“211位置分析核酸”)。
TA重复数分析核酸的例子包括这样的核酸，其与来源于含有编码UGT1A1酶的基因的TA重复区碱基的区域的DNA片段特异杂交，并可以利用下列两个引物组中的任一组通过PCR方法扩增引物组SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8，或引物组SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。
正向引物(SEQ ID No.7)5’-AAGTGAACTCCCTGCTACCTT-3’反向引物(SEQ ID No.8)5’-CCACTGGGATCAACAGTATCT-3’正向引物(SEQ ID No.9)5’-GTCACGTGACACAGTCAAAC-3’反向引物(SEQ ID No.10)5’-TTTGCTCCTGCCAGAGGTT-3’686位置分析核酸的例子包括这样的核酸，其与来源于含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的区域的DNA片段特异杂交，并可以利用引物组SEQ ID No.3和SEQ ID No.4通过PCR方法扩增。
正向引物(SEQ ID No.3)5’-AGTACCTGTCTCTGCCCAC-3’反向引物(SEQ ID No.4)5’-GTCCCACTCCAATACACAC-3’211位置分析核酸的例子包括这样的核酸，其与来源于含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的区域的DNA片段特异杂交，并可以利用引物组SEQ ID No.1和SEQ ID No.2通过PCR方法扩增。
正向引物(SEQ ID No.1)5’-CTAGCACCTGACGCCTCGTTGTACATCAGAGCC-3’反向引物(第393-412位)(SEQ ID No.2)5’-CCATGAGCTCCTTGTTGTGC-3’本发明的另一方面提供了用于评估化合物给药引起的药物不良反应的表现风险的试剂盒，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被此酶代谢，所述试剂盒包括用于分析编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复数的核酸(TA重复数分析核酸)。
另一方面，通过包括用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的核酸(686位置分析核酸)，亦可以构建用于评估化合物给药引起的药物不良反应的表现风险的试剂盒，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被此酶代谢。
作为替代方案，可以通过包括TA重复数分析核酸及686位置分析核酸，构成本发明的试剂盒。而且，除了包括TA重复数分析核酸外，通过进一步包括用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的核酸(211位置分析核酸)，亦可以构成本发明的试剂盒。此外，上述各试剂盒可以根据使用每个试剂盒的方法，通过一个试剂或2个或多个试剂联合而构成。例如，通过联合用于扩增含有UGT1A1酶的编码基因的TA重复区的DNA的试剂、用于扩增含有UGT1A1酶的编码基因的686位置碱基区的DNA的试剂和/或用于扩增含有UGT1A1酶的编码基因的211位置碱基区的DNA的试剂，可以构成试剂盒。
上述核酸是可以用在前述各分析方法，PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)方法、PCR-SSCP(单链构象多态性)方法(Orita，M等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.86，2766-2770(1989))等中的核酸，在各试剂盒中其用作引物和探针。引物的例子包括可以特异扩增含有将要分析的多态性位点(启动子区，686位置碱基，211位置碱基)的区域的引物。此外，当组成用于进行PCR-RFLP方法的试剂盒时，可以例如，利用设计的引物，这样具有特定多态性时在多态性部分中将形成特定限制性位点；由此当对PCR扩增产物进行限制性酶处理时，即可区分出基因型。当组成用于进行TaqMan-PCR方法，侵入者(Invader)方法或类似方法的试剂盒时，核酸的例子包括用在各方法中的引物和/或探针。
作为探针或引物，根据分析方法，可以适当使用DNA片段或RNA片段。探针或引物的碱基长度可以是能发挥其各自功能的长度，引物的碱基长度的例子是约15到30bp，优选约20到25bp。
如上述，为了容易实施本发明的方法，优选利用适合这个方法的基因型检测试剂盒。根据上述说明，可以容易地设计这种试剂盒，我们将通过侵入者(invader)方法作为例子进一步说明这种试剂盒，所述侵入者方法可以用基因组DNA进行实施，但基本上不必通过PCR方法或类似方法扩增试验DNA。
当根据侵入者(invader)方法构成试剂盒时，利用两种非荧光标记的寡核苷酸(1)和(2)，一种荧光标记的寡核苷酸(3)及具有识别和切割DNA结构的特异内切核酸酶活性的酶(4)。两种非荧光标记的寡核苷酸分别称作“等位基因探针(或信号探针或报告探针)”和“侵入者(invader)探针”，荧光标记的寡核苷酸称作“FRET探针”，有识别和切割DNA结构的特异内切核酸酶活性的酶称作“切割酶”。
(1)设计等位基因探针使它具有与作为模板的UGT1A1酶编码基因(此后缩写为“UGT1A1基因”)中待分析的多态性位点(此后称为“多态性位点”)5’侧互补的碱基异列，并具有不能与多态性位点3’侧一个碱基互补结合的任意碱基序列(称为“副翼”)。更具体地，当观察等位基因探针本身时，它从5’-末端开始按照下列顺序组成副翼部分，与多态性位点5’-侧的模板序列互补的序列部分。作为副翼序列，所用的是不能与样品中的UGT1A1基因序列、等位基因探针或侵入者(invader)探针及除了UGT1A1基因以外的任何DNA互补结合的序列。
(2)设计侵入者(invader)探针使它互补结合模板UGT1A1基因中多态性位点3’侧的序列，而对应于多态位点的序列可以是任意碱基(N)。更具体地，当观察侵入者(invader)探针本身时，它从5’-末端开始按照下列顺序组成与多态性位点3’-侧的模板序列互补的序列部分和在3’-末端的N。
以这种方式组成的(1)和(2)对应于本发明的“TA重复数分析核酸”，“686位置分析核酸”或“211位置分析核酸”。当两种探针(1)与(2)和UGT1A1基因互补结合时，侵入者(invader)探针能侵入两者间的多态性位点，它的单碱基(N)造成具有碱基对重叠的结构。
(3)可以由与UGT1A1基因没有关系的序列构成FRET(荧光共振能量转移)探针，该FRET探针的序列可以是普通的且不依赖于要检测的多态性位点。FRET探针在其自身5’侧具有可以与探针本身互补结合的序列，并且在3’侧具有与副翼互补的序列。此外，用荧光色素标记FRET探针的5’-末端，而在其上游位点处结合猝灭剂。
(4)切割酶是有特异内切核酸酶活性的酶，其分类为结构特异性副翼内切核酸酶(FEN)；识别和切割DNA结构；检测排列有3个碱基的部分，其中所述碱基各自属于模板DNA、侵入者(invader)探针和等位基因探针，且等位基因探针5’末端为副翼样的；切割副翼部分。
当利用上述三种探针(1)到(3)和切割酶(4)时，可以概略地产生下面两个阶段反应。
首先，当等位基因探针(1)和UGT1A1基因互补结合时，侵入者(invader)探针(2)的3’-末端(N)侵入它们的多态性位点。切割酶(4)识别这三个碱基排列处的多态性位点结构，切割等位基因探针(1)的副翼部分，释放副翼部分。然后，因为副翼部分有与FREP探针(3)互补的序列，所以从等位基因探针(1)释放的副翼部分与FREP探针(3)互补结合。于是，在副翼部分3’-末端存在的多态性位点侵入FRET探针(3)的自我互补结合位点中。接着，切割酶(4)识别该结构，切割与荧光色素结合的位点。由此，荧光色素与猝灭剂分离，发出荧光。可以测定荧光强度以检测和分析多态性。
例如，可以通过联合(1)和(2)或(3)和(4)作为两种试剂的组合物而利用(1)到(4)，或可以提前干燥(3)和(4)以包封到微滴定板中。这样，可以减少用于测定的步骤数。而且，可以适当地将镁，缓冲液等加入到含有(1)和(2)的试剂组合物中以优化反应。而且，除了(1)到(4)外，可以混入防止样品在测定期间蒸发的矿物油，从而获得试剂盒。
此外，如果针对等位基因探针(1)制备了两种探针，则可以区别出UGT1A1基因是纯合子或是杂合子。因为在测序后基因组科学“用于SNP基因多态性的策略”，Yozo Onishi，94-135，Nakayamashoten，2000；Treble，M.，等，Genetic Medicine，468-72，2000，提纲；及国际公布WO97/27214和WO98/42873中图解和描述了这些，故通过参考这些公开出版物进行最佳设计是可能的。
因为可以用本发明试剂盒提前评估化合物给药引起的药物不良反应表现风险，所以可以根据评估结果，制定针对每个用药个体的适宜化合物剂量，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被此酶代谢。换而言之，可以用本发明试剂盒制定化合物的剂量，所述化合物或者其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被此酶代谢。
通过向接受化合物给药的患者的细胞中，特别是在UTG1A1酶对化合物进行代谢和解毒的位点向细胞中引入具有遗传多态性的UGT1A1基因，其中该遗传多态性经测定具有较小的药物不良反应表现风险(换而言之，在启动子区中有6个TA重复，在外显子1位置211为鸟嘌呤(G)，和/或在外显子1位置686为胞嘧啶)，或引入含有这些多态性位点中至少一个的DNA片段，可以降低化合物的药物不良反应表现风险。在化合物给药前、给药期间或给药后，可以进行基因的引入。例如，可以通过方法，如用质粒或病毒载体引入基因的方法，电穿孔(Potter，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，7161-7165(1984))、脂转染(Felgner，P.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，7413-7417(1984))、微注射的方法(Graessmann，M.&Graessmann，A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.73，366-370(1976))等等进行基因的引入。
通过实施例将更详细地阐述本发明。在实施例中，统计分析了依立替康给药引起的药物不良反应和UGT1A1基因多态性间的相关性。
患者和临床信息受试者是在1994年7月到1999年6月的化疗中接受依立替康给药的日本患者。为了确定患者的安全性，首先确保每个患者在使用依立替康前有足够的骨髓功能白细胞数3×109/升或更高，血小板数100×109/升或更高。此外，有水泻、麻痹性肠梗阻、间质性肺炎或肺纤维化、大量腹水或胸腔积液、显性黄疸或依立替康过敏症的既往病历的患者排除在依立替康应用外。结果，用118位患者作为本实施例的受试者。
为了证实对依立替康的适应性，一周至少进行一次全血计数、血小板计数和血清化学。而且也一直测定胆红素水平。
我们回顾地检查了临床记录，包括患者的特征(例如，年龄，性别等)、依立替康给药的剂量和进度表、其它药物或放射疗法应用的记录和观察到的依立替康(输注)引起的药物不良反应。我们计数了患者接受粒细胞集落刺激因子(G-CSFs)或盐酸氯苯哌酰胺的天数，其中在日本后者通常是针对依立替康引起的腹泻的处方药。G-GSF的预防性给药防止了中性粒细胞减少的明显发作。因为已知依立替康的剂量限制性毒性会引起白细胞减少和腹泻，我们将4级白细胞减少(≤0.9×109个/升)和3级或更严重的腹泻(对于水泻，3级是5天或更多天；4级，伴有出血或脱水的腹泻，此为根据日本癌症治疗协会的标准所分级)定义为“严重毒性”。在本实施例中不包括其它药物不良反应，因为这些药物不良反应受各种患者背景影响。用刚好在依立替康给药前的分数和依立替康治疗后的最高分数记录血清总的胆红素水平。
基因型分析在将依立替康给予每位患者后，从每个患者(118位患者)中取血样，分析他们的基因型。首先，用QIAamp血液试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，德国)从全血(100-200μl)制备基因组DNA。然后，根据所附的手册进行测定。
对于每个基因组DNA，我们分析了下列变异序列(见图1)在TATA盒子中两个额外核苷酸(TA)的插入，其导致在位置-39到-53产生了序列(TA)7TAA，该类型称为UGT1A1*28；(Monaghan，G.，Ryan，M.，Seddon，R.，Hume，R.，和Bruchell，B.，Lancet，347578-581，1996，Bosma，P.J.等，N.Engl.J.Med.，3331171-1175，1995)；外显子1中密码子71位甘氨酸改变为精氨酸的转换(在转录起始位点下游区域+211位从(G)到(A))(用G71R表示，该类型称为UGT1A1*6)；外显子1中密码子229位脯氨酸改变为谷氨酰胺的颠换(用P229Q表示，该类型称为UGT1A1*27)；外显子4中在位置+1099从(C)到(G)的颠换使密码子367位由精氨酸转变为甘氨酸(用R367G表示，该类型称为UGT1A1*29)；外显子5中密码子486位使酪氨酸(Y)转化为天冬氨酸(D)的颠换(+1456，T到G)(用Y486D表示，该类型称为UGT1A1*7)。(Monaghan，G.，Ryan，M.，Seddon，R.，Hume，R.，和Bruchell，B.，Lancet，347578-581，1996，Bosma，P.J.等，N.Engl.J.Med.，3331171-1175，1995，Aono，S等，Lancet，345958-959，1995，Aono，S 等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1971239-1244，1993)。
用以前报道过的方法(Monaghan，G.，等，Lancet，347578-581，1996，Ando，Y.等，Pharmacogenetics，8357-360，1998)，通过直接测序用PCR扩增反应产生的253-255碱基对，从最普通的等位基因(UGT1A1*1)中识别出UGT1A1*28。
利用ABI PRISM 310遗传分析器(ABI Prism DNA Sequencing Kit，Perkin-Elmer，Foster City，CA)，用染料终止测序反应进行循环测序。
通过PCR-RFLP分析从UGT1A1*1中识别出剩余的变异序列(如UGT1A1*6)。对于外显子1的分析，根据以前报道过的方法(Akaba，K.等，Biochem.Mol.Biol. Int.，4621-26，1998)，进行含有外显子1的923bp片段的第一步PCR扩增。
随后，对于UGT1A1*6分析，用设计以扩增235bp片段的嵌套引物进行第二组PCR扩增。错配的正向和反向引物如下(下划线表示错配位点)正向引物(+178到+210) (SEQ ID NO.1)5’-CTAGCACCTGACGCCTCGTTGTACATCAGAGCC-3’反向引物(+393到+412) (SEQ ID NO.2)5’-CCATGAGCTCCTTGTTGTGC-3’设计正向引物以在UGT1A1*1中，而不是UGT1A1*6中引入MspI(Takara Shuzo Co.，Ltd.，Otsu，日本)限制位点(+209到+212)。利用嵌套PCR，用1000倍稀释的第一步PCR反应产物进行第二步PCR，其中50μl体积的样品含有每种脱氧核糖核苷三磷酸各0.2mM，50Mm KCl，10mM Tris-HCl(pH 8.3)，1.5mM MgCl2，每种引物各0.5μM，和1.3单位Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.，Otsu，日本)。PCR条件如下95℃，5分钟，随后25个循环(94℃，30秒；60℃，40秒；及72℃，40秒)(PCR Thermal Cycler MP，Takara Shuzo Co.，Ltd.，Otsu，日本)。在37℃，用4单位MspI消化1μl PCR扩增产物1小时。消化来源于UGT1A1*1的DNA产生203和32bp的片段，而消化来源于UGT1A1*6的DNA产生了未被消化的235bp片段，来源于杂合基因型的DNA产生了所有的三个片段。
为了对UGT1A1*27测序，用下面设计以扩增399碱基对片段的半嵌套引物进行另一组第二步PCR正向引物(+485到+503) (SEQ ID NO.3)5’-AGTACCTGTCTCTGCCCAC-3’反向引物(+865到+867和内含子1)(SEQ ID NO.4)5’-GTCCCACTCCAATACACAC-3’在UGT1A1*27中存在两个BsrI(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)限制位点(+552到+556和+684到+688)，但是在UGT1A1*1中仅有一个位点(+552到+556)。一系列PCR扩增反应与上述用于MspI RFLP的PCR扩增反应相同。在65℃，用2.5单位Bsr I消化PCR扩增产物1小时。结果，从UGT1A1*27产生了199，132和68碱基对片段，而从UGt1A1*1生产了331和68碱基对。杂合基因型DNA产生了所有上述四个片段。
用嵌套引物，利用PCR-RFLP测定法也鉴定了UGT1A1*29的序列。根据略作修改的报道方法(Akaba，K.等，Biochem.Mol.Biol.Int.，4621-26，1998)进行包含外显子2，3和4的第一步PCR扩增反应。对于第二步PCR扩增反应，设计可以扩增285碱基对片段的包含错配序列的正向和反向引物如下(下划线表示错配位点)正向引物(内含子3和+1085到+1098)(SEQ ID NO.5)5’-TCCTCCCTATTTTGCATCTCAGGTCACCCGATGGCC-3’反向引物(内含子4)(SEQ ID NO.6)5’-TGAATGCCATGACCAAA-3’所设计的正向引物可以向UGT1A1*1但不是UGT1A1*29中引入Cfr13I(Takara Shuzo Co.，Ltd.，Otsu，日本)限制位点(+1095到+1099)。所用PCR反应试剂混合物与上述UGT1A1*6的第二步PCR反应中所用的PCR反应试剂混合物相同。用Cfr13 I酶消化PCR扩增产物。来源于UGT1A1*1的DNA被消化为252和33碱基对的片段，来源于UGT1A1*29的DNA产生了未消化的285碱基对的片段。
为了UGT1A1*7的检测，用以前报道的引物(Akaba，K.等，Biochem.Mol.Biol.Int.，4621-26，1998)，通过PCR方法，扩增外显子5的579碱基对片段。
所用PCR反应试剂混合物与UGT1A1*6的第二步PCR反应中所用的PCR反应试剂混合物相同。在UGT1A1*1序列中而不是UGT1A1*7中存在Bsr I限制位点(+1452到+1456)。因此，通过与Bsr I酶温育，来源于UGT1A1*1的DNA被消化为365和214碱基对的片段，来源于UGT1A1*7的DNA产生了未消化的579碱基对的片段。
通过4％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分析上述过程产生的限制性片段。通过直接测序分析证实了上述每种变异基因型的基因型分析结果。
鉴于获得的结果，确定了每位患者中UGT1A1基因的类型。
统计分析通过下面的统计方法进行依立替康的严重毒性和UGT1A1基因型(基因多态性)间相关性的分析和评估。
下面为可能因素性别，年龄，身体状况(PS)，主要疾病，远距离转移的存在，治疗史，糖尿病或肝病并发症，化疗方案，同时的放射治疗，和依立替康输注的计划进度表和每次剂量。化疗方案分为3类；单独依立替康，依立替康加铂(顺铂或卡铂)，依立替康加其它药剂(紫杉醇，docetaxel，足叶乙甙，丝裂霉素C或5-氟尿嘧啶)。用卡方检验评估潜在变量间的相关性或关联性，或用费希尔确切检验(Fisher’s Exact test)评估分类变量，或将Mann-Whitney U检验用于连续变量。在无条件多重逻辑回归分析(unconditional multiple logistic regression analysis)中包括看似与严重毒性相关联(P＜0.1)的可能变量。在多变量分析中，我们没有包括下面的因素，因为它们高度依赖于化疗的结果粒细胞集落刺激因子和盐酸氯苯哌酰胺两者的总实际剂量和应用。分别在0.25和0.1显著性水平，用正向和反向逐步程序选择最终统计模型中的变量。当控制其它变量时，验证了遗传多态性对严重毒性出现的重要性。
用JMP版本3.0.2软件(SAS Institute Inc.，Cary，NC)，我们进行了这些分析。当双尾P值在0.05以下时，认为该差异有统计显著性。
药物不良反应和临床信息我们评述了118位患者的临床信息。9位(8％)和38位(32％)患者分别经历了4级(≤0.9×109/升)和3级(1.9-1.0×109/升)白细胞减少。据报告，3位(3％)患者有4级腹泻(出血或脱水)，19位(16％)有3级腹泻(5天或更多天的水泻)。有4级白细胞减少的9位患者中，5位患者还有3/4级腹泻，有3/4级腹泻的22位患者中有16位患者遭受到3/4级白细胞减少。然后，我们鉴定了26位经历严重毒性的患者(此后称为“经历严重毒性的患者”)和92位没有经历严重毒性的患者(此后称为“未经历严重毒性的患者”)，并且在图中分别于表2和3中概括了这些临床信息和严重毒性数据。在未经历严重毒性的患者中观察到较低的依立替康实际总量和粒细胞集落细菌因子或盐酸氯苯哌酰胺的更频繁的应用。
基因型的分布用上文的方法检测了所有118位患者的基因型，其结果如图4所示。没有具有UGT1A1*29或UGT1A1*7的患者。此外，对于9位患者，利用已经报道的结果(UGT1A1*28)(Ando Y.，Saka，H.，Asai，G.，Sugiura，S.，Simotaka，K.，和Kamataki，T.，Ann.Oncol.，9845-847，1998)。此外，测定了117位患者的化疗前总胆红素水平和化疗期间总胆红素水平的最大值，在图4的表中也描述了其结果。
如图4表中所示，在5位患者中发现了基因型多态性的同时出现；其中两位(用箭头A表示)是UGT1A1*28和UGT1A1*6均杂合，其中3位是UGT1A1*27杂合并同时出现纯合(两个用箭头C表示)或杂合(一个用箭头B表示)UGT1A1*28。
UGT1A1*28和UGT1A1*6均杂合的两位患者(用箭头A表示)有正常范围内的胆红素水平；分别地，在治疗前是13.9μmol/升和15.4μmol/升，依立替康化疗后是10.3μmol/升和15.4μmol/升。除了这两位患者外，在治疗前(P＝0.031，Kruskal-Wallis检验)和依立替康治疗后(P＜0.001)，各基因型间胆红素水平的差异具有统计显著性。
对于经历严重毒性的患者和未经历严重毒性的患者，UGT1A1*28等位基因的频率分别是0.308(95％ CI，0.004-0.149)和0.087(95％ CI，0.046-0.128)；而且UGT1A1*6等位基因的频率分别是0.077(95％ CI，0.004-0.149)和0.136(95％ CI，0.086-0.185)。
对于UGT1A1*28，在有严重毒性经历的患者和无严重毒性经历的患者间等位基因分布差异有统计显著性(P＜0.001)，而对于UGT1A1*6没有显著性(P＞0.2，GENEPOP 3.1版本软件，Laboratoire de Gén étiqueet Environment，Montpellier，法国)。
基因型和药物不良反应的相关性逻辑回归分析表明，UGT1A1*28的杂合或纯合基因型被证明是严重毒性的有效预测器(优势比，5.21；95％CI，1.98-13.96；P＜0.001；表4)。相反地，没有观察到UGT1A1*6和严重毒性之间有统计关联性(优势比，0.55；95％CI，0.15-1.61；P＞0.2)。
然后，我们对在引起严重毒性方面有影响的其它因素和基因型的突变进行了比较。
如图2和图3的表中所示，看似不利影响严重毒性的因素是依立替康输注的计划进度表、“性别”，“化疗方案”。评估这些因素的相关性或关联性。在“化疗方案”和“计划进度表”间发现了显著关联性(P＜0.001，卡方检验)，换而言之，用依立替康以3或4周为周期进行治疗的19位患者中的12位(63％)除了接受依立替康外，曾接受过额外的其它抗癌药物。因为“化疗方案”是和依立替康严重毒性具有较强关系的变量，在统计模型中我们考虑包括“化疗方案”。
在“化疗方案”，“性别”和“UGT1A1*28基因型”间未观察到显著的其它相关性和关联性。女性和使用其它抗癌药物(除了铂以外)被发现是除了UGT1A1*28基因型外引起严重毒性出现的重要因素。这两个因素和UGT1A1*28的比较如图5的表中所示。如图5的表中所示，具有UGT1A1*28将增加依立替康严重毒性多达7倍。此外，在女性和依立替康严重毒性间未发现显著水平的相关性。这些发现阐明了UGT1A1*28的临床重要性，其可以作为UGT1A1缀合活性及急性暴露于依立替康的指标。
在同时有4级白细胞减少和3级或更严重腹泻的5位患者中，2位有UGT1A1*28和UGT1A1*27，其它两位是UGT1A1*6杂合，剩余的1位没有任何一个分析的变异基因型(UGT1A1*1纯合)。另一方面，值得注意的是同时在启动子区(UGT1A1*28)和外显子1(UGT1A1*6或UGT1A1*27)中有变异序列的5位患者中的4位(80％)遭受到危及生命的毒性。前述结果提示，UGT1A1*28的拥有将以高概率引起依立替康的严重毒性。因此，可以说，通过分析启动子区的突变(TA重复的差异)可以提前评估依立替康药物不良反应的表现风险。此外，还表明同时具有UGT1A1*28和UGT1A1*6或UGT1A1*27可以以高概率引起依立替康的严重毒性。因此，可以说，通过一起分析启动子区的突变和外显子1中的突变可以提前评估依立替康药物不良反应的表现风险。
而且，发现UGT1A1*6纯合的2位患者是未经历严重毒性的患者(图4中的表，用箭头D表示)，而且发现UGT1A1*27杂合的所有3位患者(相同的表，用箭头B和C表示)经历了严重毒性。这表明具有UGT1A1*27将以高概率引起依立替康的严重毒性。因此，可以说，通过分析UGT1A1*27的存在，即密码子229位的多态性可以提前评估依立替康药物不良反应的表现风险。
本发明不限于上述实施方案和实施例。只要不背离权利要求书的描述和本领域技术人员可以容易考虑到的范围，各种方面的变化都包括在本发明中。
工业实用性根据本发明的方法，可以提前评估化合物给药引起的药物不良反应的风险，该化合物或者本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被酶代谢，其代表是依立替康。因此，可以根据引起每位患者药物不良反应的风险来给予化合物(药物)，并且可以降低药物不良反应。特别地，可以提前评估药物不良反应，如依立替康给药引起的白细胞减少和腹泻的表现风险，然后可以降低药物不良反应的表现风险。
此外，20％或更多的日本人在UGT1A1中有突变，因为这个原因，可以认为他们有出现依立替康高毒性的高风险，因此，可以说，通过分析UGT1A1基因型，可以降低依立替康药物不良反应，尤其降低日本患者中依立替康的药物不良反应。
序 列 表<110>财团法人名古屋产业科学研究所(Nagoya Industrial Science Research Institute)<120>评估施用自身或者其代谢中间物被UGT1A1酶代谢的化合物引起严重毒性的方法<130>C0000101<140>
<141>
<150>JP P2000-376756<151>2000-12-12<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于扩增235-bp片段以分析UGT1A1*6的引物<400>1ctagcacctg acgcctcgtt gtacatcaga gcc 33<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于扩增235-bp片段以分析UGT1A1*6的引物<400>2ccatgagctc cttgttgtgc20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于扩增399-bp片段以分析UGT1A1*27的引物<400>3agtacctgtc tctgcccac 19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于扩增399-bp片段以分析UGT1A1*27的引物<400>4gtcccactcc aatacacac 19<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于扩增285-bp以分析UGT1A1*29的引物<400>5tcctccctat tttgcatctc aggtcacccg atggcc 36<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于扩增285-bp以分析UGT1A1*29的引物<400>6tgaatgccat gaccaaa17<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于分析TATA盒区域的PCR引物<400>7aagtgaactc cctgctacct t 21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于分析TATA盒区域的PCR引物<400>8ccactgggat caacagtatc t21<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于分析TATA盒区域的PCR引物<400>9gtcacgtgac acagtcaaac 20<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于分析TATA盒区域的PCR引物<400>10tttgctcctg ccagaggtt19
权利要求
1.评估化合物给药引起的药物不良反应的表现风险的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被该酶代谢，所述方法包括至少(a)步骤分析编码UGT1A1酶的基因的启动子区中的TA重复数。
2.如权利要求1所述的方法，其中分析TA重复数的步骤是检测TA重复数为5到8之任何一个的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其中分析TA重复数的步骤是检测TA重复数为6或7的步骤。
4.如权利要求1到3任一项所述的方法，其进一步包括步骤扩增包含编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复区的DNA。
5.如权利要求1到4任一项所述的方法，其是评估化合物给药引起的药物不良反应的表现风险的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被该酶代谢，所述方法进一步包括(b)步骤分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基，和/或(c)步骤分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基。
6.如权利要求5所述的方法，其中分析核苷酸第686位碱基的步骤是分析是否核苷酸位置686的碱基是胞嘧啶或腺嘌呤的步骤。
7.如权利要求5所述的方法，其中分析核苷酸第211位碱基的步骤是分析是否核苷酸位置211的碱基是鸟嘌呤或腺嘌呤的步骤。
8.如权利要求5到7任一项所述的方法，其进一步包括步骤扩增含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的DNA，和/或含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的DNA。
9.评估化合物给药引起的药物不良反应的表现风险的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被该酶代谢，所述方法包括至少(b)步骤分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基。
10.如权利要求9所述的方法，其中分析核苷酸第686位碱基的步骤是分析是否核苷酸位置686的碱基是胞嘧啶或腺嘌呤的步骤。
11.如权利要求9或10所述的方法，其进一步包括步骤扩增含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的DNA。
12.如权利要求1到11任一项所述的方法，其中化合物是喜树碱类似化合物。
13.如权利要求12所述的方法，其中喜树碱类似化合物是喜树碱衍生物。
14.如权利要求13所述的方法，其中喜树碱衍生物是拓扑替康或依立替康。
15.如权利要求13所述的方法，其中喜树碱衍生物是依立替康。
16.制定化合物剂量的方法，其包括步骤根据权利要求1到15任一项用于评估药物不良反应表现风险的方法的结果制定化合物的剂量。
17.用于分析编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复数的核酸，其与来源于含有编码UGT1A1酶的基因的TA重复区碱基的区域的DNA片段特异性地杂交，并可以利用引物SEQ ID No.7和SEQ ID No.8通过PCR方法扩增。
18.用于分析编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复数的核酸，其与来源于含有编码UGT1A1的酶的基因的TA重复区碱基的区域的DNA片段特异性地杂交，并可以利用引物SEQ ID No.9和SEQ ID No.10通过PCR方法扩增。
19.用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的核酸，其与来源于含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的区域的DNA片段特异性地杂交，并可以利用引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2通过PCR方法扩增。
20.用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的核酸，其与来源于含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的区域的DNA片段特异性地杂交，并可以利用引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4通过PCR方法扩增。
21.评估化合物给药引起的药物不良反应的表现风险的试剂盒，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被该酶代谢，所述试剂盒包括用于分析编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复数的核酸。
22.如权利要求21所述的试剂盒，其进一步包括用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的核酸，和/或用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的核酸。
23.评估化合物给药引起的药物不良反应的表现风险的试剂盒，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代谢，或其代谢中间物被该酶代谢，所述试剂盒包括用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的核酸。
24.如权利要求21到23任一项所述的试剂盒，其中化合物是喜树碱类似化合物。
25.如权利要求24所述的试剂盒，其中喜树碱类似化合物是喜树碱衍生物。
26.如权利要求25所述的试剂盒，其中喜树碱衍生物是拓扑替康或依立替康。
27.如权利要求25所述的试剂盒，其中喜树碱衍生物是依立替康。
28.提前评估依立替康药物不良反应表现风险的试剂盒，其包括至少(a)用于分析编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复数的核酸，或(b)用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的核酸。
29.如权利要求28所述的试剂盒，其是评估依立替康药物不良反应表现风险的试剂盒，其进一步包括用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的核酸。
30.评估依立替康药物不良反应表现风险的试剂盒，其包括至少(a)用于分析编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复数的核酸，或(b)用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的核酸，并且其进一步包括用于扩增所要分析的含有编码UGT1A1酶的基因的启动子区中TA重复区的DNA或含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位碱基的DNA的试剂。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其是用于评估依立替康药物不良反应表现风险的试剂盒，其进一步包括用于分析编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的核酸和用于扩增含有编码UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位碱基的DNA的试剂。
全文摘要
本发明公开了评估依立替康给药引起的药物不良反应的表现风险的方法；和降低依立替康给药引起的药物不良反应的方法。分析了基于UGT1基因启动子区中TA重复序列的重复数差异的多态性和基于外显子1中单核苷酸多态性的两种多态性(在211和686位置的碱基)。根据分析的数据，可以评估依立替康给药引起的药物不良反应的表现风险。而且，依据药物不良反应的表现风险，可以设计针对每位患者的依立替康给药剂量，由此降低依立替康给药引起的药物不良反应。
文档编号C12Q1/68GK1547613SQ0182254
公开日2004年11月17日 申请日期2001年12月10日 优先权日2000年12月12日
发明者长谷川好规, 安藤雄一, 下方薰, 一 申请人:第一化学药品株式会社