一种利用微波照射的简单、有效且加速的酶催化体外核酸修饰及合成方法

专利名称：一种利用微波照射的简单、有效且加速的酶催化体外核酸修饰及合成方法
技术领域：
本发明涉及利用2300至2500MHz、600至900瓦特输出功率的不间断短暂(brief)微波照射5至120秒的、简单、有效、且加速的酶催化体外核酸修饰及合成方法，；以及进一步，利用所述方法的装置。
背景技术：
对于分子生物学家来说核酸酶促反应是重要的。分子生物学中最常使用的酶促反应有位点特异性切割、连接、去磷酸化、磷酸化(激活)和体外DNA和RNA合成反应。这些反应由不同的酶例如限制性内切核酸酶、连接酶、磷酸酶、激酶、DNA聚合酶、反转录酶和RNA聚合酶完成。这些反应产物在分子生物学中有广泛的用途。
几种限制性内切核酸酶(RENs)的发现开创了现代分子生物技术。这些酶通过在相对链上产生切割而催化双链DNA的序列特异性水解切割。
连接酶是另一种重要的酶，它能够通过在双链DNA的相容性末端和DNA-DNA和DNA-RNA杂合体中的单链切口之间形成磷酸二酯键来修饰核酸。[Engler，M.J.和Richardson，C.C.(1982)，The Enzymes(Boyer，P.D，ed)第5卷，p.3，Academic Press，San Diego]。DNA连接酶催化反应的产物是基因克隆和操作所必需的。
磷酸酶催化核酸末端磷酸基团的去除[Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)Molecular cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork]并且是在克隆和用[γ32P]ATP做末端标记中降低载体背景所必需的。
多核苷酸激酶通过从ATP的γ位转移或交换磷酸基团至多核苷酸羟基末端(双和单链DNA和RNA)以及核苷3’单磷酸来对核酸进行修饰[Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，(1989)Molecularcloning，A Laboratory Manual，second edition，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York]。
由相应的聚合酶催化的模板指导的DNA和RNA合成是在重组DNA研究中常规进行的。DNA模板指导的DNA合成用于通过切口平移制备放射性标记的杂交探针[Rigby等人(1977)，J.Biol.Chem.113237]、DNA片段标记和用于连接的末端填平反应、第二链cDNA合成、聚合酶链式反应(PCR)、DNA测序等。
由反转录酶催化的RNA模板指导的DNA合成是cDNA合成以及经RT-PCT的基因扩增所必需的。DNA模板指导的RNA合成(转录)被用于RNA聚合酶特异性启动子的鉴定、耦联的转录和翻译反应以及制备高度标记的RNA探针等。
这些方法在传统上是通过在保持于使酶表现最大活性的适宜温度下的水浴中温育来完成的。根据特定酶和底物及其浓度，温育时间从几分钟至几小时。为实现特定目的，大多数反应常常需要连续完成，因为一个反应的产物就是另一个反应的底物。即使这些反应中的大多数需要几分钟至几小时，为完成特定反应组的总时间还是相当高的。通常优选给出较长的反应时间以保证反应完全。
传统方法的缺陷是反应时间长，而且分子生物学家不得不花费他们大量的宝贵时间用这些酶来完成这项耗时的试验。加速酶催化反应的一种途径是激活酶或底物之中任一或两者。有机反应通常通过加热来促进，但是由于酶而使这并非总是可行的，因为大多数酶都是容易热失活的。加速化学或生物反应的另一途径是使用微波作为能量来源。实际上，使用微波来加速有机反应的速率很早就已知了。
1986年，Gedbye等人和Giguere等人证明了通过微波照射可以非常快的进行许多有机反应[Gedye，R.N.等人，Tetrahedron Lett.(1986)，26，279；Giguere，R.J等人，Tetrahedron Lett.(1986)，27，4945-4948]。自此后，许多作者在大量有机反应中证实了“微波诱导的有机反应增强”(MORE)化学的多样性，例如催化氢化反应、Diels-Alder反应、自由基反应、酰化作用、脱酰化作用等[Bose.A.K，等人，Res.Chem.Intermed.(1994)20，1-11；Bose.A.K等人，J.Org.Chem.(1991)56，6968-6970；Nahar，P.Tetrahedron Lett.(1997)，38，7253-7254]。实践中所有这些反应都在以2450MHz的频率和约700瓦特的最大输出功率下于家用微波炉中完成。通常这些微波炉根据不同的输出功率有10级水平，第十级水平具有最大输出功率而第一级具有微波炉的最低输出功率。尽管微波反应的主要优点是时间上的大大减少，但是也报道了反应的选择性或特异性[Nahar，P.TetrahedronLett.(1997)，38，7253-7254]。
微波能量已被成功应用于蛋白质分析[Akins，Jr.等人；U.S.专利号5,403,747和5,478,748]和免疫组织化学[Boon，M.E.等人；Am.J.Clin.Pathol.(1989)，Boon，M.E.等人；In Microwave Cookbook ofPathologyThe art of Microscopic Visualisation]。还研究了利用微波照射的腺苷三磷酸的水解[Jahngen，E.G.E.等人J.Org.Chem.(1990)55，3406-3409]。
数位研究者已经研究了微波照射对生物聚合物的效应，尤其是对酶和DNA。然而，关于微波照射对生物分子的效应却有着相反的报道。在一些情况中，微波被用于使小型试验动物的大脑酶失活[Galli Claudio和Racagni Giogio，Methods in enzymology，(1982)86，636-642]。然而，Byus，C.V.等人，已经发现用微波能量使得培养细胞鸟氨酸脱羧酶活性提高[Byus等人，Cancer Res.(1988)48，4222-4226]。还有报道说同时观察到了细胞酶活性的增强和抑制[Dutta，S.K.和Verma，M.Current Scince(1989)58，58-63；Dutta，S.K.和Verma，M.CurrentScince(1988)57，779-786]。Maleev，V.Ya.等人不能发现DNA增强微波吸收后的任何效果(Maleev，V.Ya.等人。Biopolymers(1987)26，1965-1970)。然而，根据Narasimhan等人，DNA分子暴露于微波后能够表现出单链断裂、双链断裂、局部链分离等[Narasimhan，V.和Huh，W.K.；Biochem.International(1991)25，363-370]。
尽管Jhingan(U.S.专利号5,350,686)报道了用限制性酶对核酸的消化，但是在之前并未报道微波对核酸合成及修饰的酶促反应的增强。作者通过利用处于最低功率水平(该水平是标准微波炉700瓦特输出功率的10％)的微波能用限制酶消化了DNA。反应过程中，作者还利用了一系列的时间间隔，在这些间隔中没有对反应混合物施加微波功率。在该方法中，大多数酶用于消化反应的总反应时间介于6至15分钟。然而，当一些质粒DNA对照样品在37℃温育时，它们产生完全消化产物。从该试验，并不清楚微波照射多大程度影响了上述酶促反应，因为大多数反应时间内酶都并未获得适当的微波。在这些情况中似乎时间比微波扮演了更重要的角色。
已经报道的、微波介导的酶催化大分子修饰的方法(U.S.专利号5,350,686)有几个缺陷，例如(1)所费时间不够吸引人。在微波炉外37℃下相同时间内一些限制酶的消化反应有可能得到相当的结果，(2)该方法需要一系列间隔，在这些间隔中微波功率并不施加于反应混合物，(3)酶促反应没有一致的条件。在大多数情况中，作者对使用限制酶的消化反应使用了不同的微波暴露时间，以及(4)由于(a)长反应时间和(b)反应条件的非一致性使得该方法的自动化不太奏效。
申请人在本发明中已经克服了所有上述缺陷。对于任何反应都需要一个最适宜的条件。最适宜的热能使得酶促反应加速，在温和条件下(低于最适宜条件)反应减缓，而在剧烈条件下(高于最适宜条件)酶失活。对于利用微波能的反应来说也是一样。如果没有保持最适宜条件，那么酶促反应就可能被破坏或者给出不完全反应产物。在本发明中，发现了适宜的反应条件，其中大多数与已报道的方法相反、或者在现有技术中是未知的。
此外，除酶和底物之外，借助微波的酶促反应大大依赖于反应混合物的组成。缓冲液、其pH、盐浓度和其它成分在酶促反应中起重要作用，更特别是在微波中完成反应的时候。我们已经发明了，在含有50％(v/v)甘油的稀释缓冲液中，当限制酶持续暴露于高功率微波下时会失活，甚至暴露很短的时间(15秒及以上)，而在37℃的常规反应中它保持有活性。当需要稀释高浓度酶时稀释缓冲液由供应商推荐。
与Jhingan(U.S.专利号5,350,686)所报道的工作相反，我们现在已经发明，生物大分子的酶促修饰可以在微波炉最高输出功率设置下完成，该微波炉在2450MHz频率和700瓦特功率下工作。此外，我们还发现，在微波介导的酶促反应过程中不需要间断，这再次与上述工作相反。
发明目的本发明的主要目的是提供快速有效的酶促反应方法，以产生在分子生物学和重组DNA技术及其它领域中必需的这些酶催化反应的特异性产物。
本发明的另一目的是提供一种方法，它简单、可重复并且不需要另外的专门技术或昂贵的仪器。
本发明的再一目的是提供一种方法，它能够以简单的方式自动化以在单个装置中完成生物技术或分子生物学中使用的大多数酶促反应。
本发明的另一目的还是，开发涉及照射但不导致对酶不利效果的方法。
发明概述本发明涉及利用2300至2500MHz、600至900瓦特输出功率的不间断短暂微波照射5至120秒的、简单、有效、且加速的酶催化体外核酸修饰及合成方法，；以及进一步，利用所述方法的装置。
发明详述因此，本发明涉及一种利用不间断短暂微波照射的简单、有效、且加速的酶催化体外核酸修饰及合成方法。
在本发明的一种实施方式中，提供了在小微量离心管中或小片石蜡膜(parafilm)上的反应混合物，它含有(i)选自限制性内切核酸酶、连接酶、磷酸酶、激酶、反转录酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶的酶，(ii)用作所选择酶的底物的选自DNA、RNA或寡核苷酸的生物分子，(iii)适合特定酶的缓冲液以及(iv)其它成分。
在本发明另一实施方式中，将载有反应混合物的所述微量离心管或石蜡膜片放进微波炉。
在本发明进一步的另一实施方式中，用频率介于2300至2500MHz的微波以介于600至900瓦特的输出功率持续照射所述微量离心管或石蜡膜。
在本发明进一步的另一实施方式中，时间介于5至120秒。
在本发明进一步的另一实施方式中，通过加入乙二胺四乙酸(EDTA)和/或在75℃水浴中加热3-15分钟使反应终止，之后加入凝胶上样染料。
在本发明进一步的另一实施方式中，用琼脂糖凝胶电泳、放射自显影、放射性计数、和常规程序中所使用的其它技术对反应产物进行分析。
在本发明进一步的另一实施方式中，其中核酸选自DNA、RNA、和寡核苷酸。
在本发明进一步的另一实施方式中，其中所用的其它成分选自MgCl2、MgSO4、NaCl、KCl、CH3COOK、乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇、亚精胺、BSA、triton x-100、核苷酸、模板DNA、模板RNA、和寡核苷酸引物。
在本发明进一步的另一实施方式中，其中限制性内切核酸酶选自Hind III、BamHI、EcoRI、Hae III、Bgl II、Pst I、Bst E II、和Bst NI。
在本发明进一步的另一实施方式中，其中所用的连接酶是T4 DNA连接酶。
在本发明进一步的另一实施方式中，其中所用的激酶是T4多核苷酸激酶(TPNK)。
在本发明进一步的另一实施方式中，其中所用的磷酸酶是牛肠碱性磷酸酶(CIP)。
在本发明进一步的另一实施方式中，其中聚合酶选自大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段、T7 RNA聚合酶、和SP6RNA聚合酶。
在本发明进一步的另一实施方式中，其中所用的反转录酶是禽成髓细胞瘤病毒-反转录酶(AMV-RT)。
在本发明进一步的另一实施方式中，其中所用的DNA选自基因组DNA、λ噬菌体DNA、质粒DNA、杆状病毒DNA、植物DNA、和哺乳动物DNA。
在本发明进一步的另一实施方式中，其中核酸的双重消化使用了不只一种限制性内切核酸酶。
在本发明进一步的另一实施方式中，其中双重消化所用的限制性内切核酸酶是EcoRI和Hind III。
在本发明进一步的另一实施方式中，其中微波照射可以在能够产生微波的任何装置或腔室中完成。
在本发明进一步的另一实施方式中，其中所述方法可通过经特异设计的装置部分或完全自动化。
在本发明进一步的另一实施方式中，适于完成酶促反应的装置如上所述。
在本发明进一步的另一实施方式中，反应室由磁电管、排气扇、纤维光学温度计、冷却系统、和旋转反应平台组成。
在本发明进一步的另一实施方式中，基于微处理器的计算手段以给出通过适宜硬件软件完成不同反应的预编程序命令。
在本发明进一步的另一实施方式中，其中在约2450MHz频率、100瓦特至800瓦特的输出功率下工作的磁电管是微波来源。
在本发明进一步的另一实施方式中，本发明涉及生物分子位点特异性切割、修饰及合成的快速有效方法。更特别的是，描述了利用短暂不间断微波照射通过酶催化反应生产经过设计的生物分子。所发明的方法可适用于生物技术，更特别的是分子生物学、基于酶的工业加工以及污水处理，还适于相关领域的自动化。
在本发明进一步的另一实施方式中，本发明特别涉及通过被微波增强的酶促反应快速有效进行生物分子位点特异性切割、修饰、及体外合成的方法。本发明特别涉及通过短暂持续而不间断微波照射实施酶催化核酸位点特异性切割、修饰和体外合成的快速有效方法。优选的微波频率为2000至2800MHz，输出功率为500至900瓦特。优选的微波照射时间是5至120秒。在更特别由限制性内切核酸酶、连接酶、磷酸酶、激酶、反转录酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶催化的反应中实现核酸切割、修饰及合成。这些酶促反应的特异性产物对于分子生物学和重组DNA技术中的基因操作是必需的。
在本发明进一步的另一实施方式中，本发明涉及一种快速制备酶催化反应产物的方法。本发明特别涉及一种完成酶催化的核酸的位点特异性切割、修饰和体外合成的快速、有效方法。核酸的合成、修饰和切割更特别地是在反应中由限制性内切核酸酶、连接酶、磷酸酶、激酶、DNA聚合酶、反转录酶和RNA聚合酶催化获得。这是一种完成位点特异性切割、连接、去磷酸化、磷酸化(kination)和体外DNA和RNA合成反应的非常快速的方法。这些酶催化反应的特异性产物对于分子生物学和重组DNA技术中的基因分析和操作来说是必需的。
在本发明进一步的另一实施方式中，为实现本发明目的并克服酶促反应已知方法的不足，通过微波介导的酶促反应为核酸的位点特异性切割、修饰和体外合成提供了一种快速有效的方法。本发明中完成了分子生物学中使用的酶促反应，即位点特异性切割、连接、去磷酸化、磷酸化(激活)，体外DNA合成和体外RNA合成。
在本发明进一步的另一实施方式中，本发明包括(a)将含有酶、底物、适宜缓冲液和其它成分(如实施例中所述)的反应混合物在处于微波炉最高输出功率(700瓦特)的微波炉中短暂且不间断地暴露于微波。
在本发明进一步的另一实施方式中，该方法在5至120秒内导致核酸的位点特异性切割、修饰和体外合成。由本发明方法完成的酶促反应显示了使该方法多样化的可重复结果。为大分子，更特别是核酸，的切割、修饰和合成公开了对酶-底物反应混合物的短暂且不间断微波暴露不超过140秒这一新发现。
在本发明进一步的另一实施方式中，就目前已知对酶催化的核酸位点特异性切割、修饰和体外合成而言这是一种非常快速的方法。本发明方法中的体外合成包括DNA模板指导的DNA和RNA合成和RNA模板指导的DNA合成(反转录)。该方法具有自动化的潜力。
在本发明进一步的另一实施方式中，本发明的新颖性是，大多数反应在5-150秒内完成，其中微波效应得到时间效应的清楚证实。
在本发明进一步的另一实施方式中，本发明的另一新颖性是这一发现处于含有50％(v/v)甘油的稀释缓冲液中的限制性酶短时间暴露于高输出功率的微波能时它会丧失其酶促特性。
在本发明进一步的另一实施方式中，本发明的另一新颖性是，处于消化缓冲液中的限制性酶短时间(至少140秒)不间断暴露于高输出功率(700瓦特)的微波能时它会保持其活性。
在本发明进一步的另一实施方式中，本发明的另一新颖性是与已经报道的方法相反其反应条件更加一致，在已经报道的方法中大多数情况下，由不同限制性酶做的DNA消化需要不同的反应条件。
在本发明进一步的另一实施方式中，本发明的另一新颖性是几乎所有通常在分子生物学中使用的酶促反应可以通过本发明的方法完成。
在本发明进一步的另一实施方式中，本发明的另一新颖性是可以通过简单的方式将本发明自动化以在单一的装置中完成大部分酶促反应。
在本发明进一步的另一实施方式中，本发明通过微波诱导的酶促反应，即位点特异性切割、连接、去磷酸化、磷酸化(激活)、体外DNA合成和体外RNA合成，为核酸的位点特异性切割、修饰和体外合成提供了一种快速有效的方法。该方法包括将含酶反应混合物在处于最高功率水平的微波炉中短时间不间断地暴露于微波。酶促反应是精细的方法，其中不适当的条件会妨碍结果。
在本发明进一步的另一实施方式中，本发明人已经发现了在微波炉最高功率水平微波下(700瓦特)暴露5至120秒的短时间后的酶促活性。我们的结果与报道(U.S.专利号5,350,686)相反，该报道中在更低的功率水平下微波暴露后酶失活。这可能是由于这一事实，现有技术使用了15至31分钟这一长得多的照射时间以及不同次数的间隔。本发明人通过在最高功率水平下短时间不间断微波照射完成了酶促反应。
附图详述附

图1。
HindIII暴露于700瓦特微波的稳定性。
将消化缓冲液中的HindIII暴露于微波不同时间0(泳道1)、30(泳道2)、50(泳道3)、70(泳道4)、90(泳道5)、110(泳道6)和130(泳道7)秒。对照射了不同时间的HindIII通过λDNA消化进行检测——将它们暴露于700瓦特的微波50秒。在1.0％琼脂糖凝胶的各泳道中，载入1.0μg经消化的DNA(实施例1)。
附图2经700瓦特微波照射的、DNA的限制性内切核酸酶消化。
用20.0μl反应体积中的2.0μg DNA、1.0μl各自消化缓冲液中的各酶完成了以下λDNA经HindIII(泳道2)、BamHI(泳道3)、EcoRI(泳道4)的消化，λDNA经EcoRI和HindIIII的双重消化(泳道5)，以及PstI对豌豆凝集素cDNA克隆在PUC19载体PstI位点的消化(泳道6)。在EcoRI消化缓冲液中用HindIII和EcoRI完成了双重消化。对照反应(泳道1)中，20.0μl HindIII消化缓冲液中使用了2.0μg λDNA，不含酶。在1.0％琼脂糖凝胶各泳道中加载了1.0μgDNA(实施例2)。
附图3在微波炉中由T4 DNA连接酶催化的λHindIII片段的连接以及由HindIII催化的所连接DNA的片段化。
泳道1载有在HindIII消化缓冲液中经微波照射50秒的未经切割的λDNA(1.0μg)。泳道2代表经HindIII切割的λDNA(1.0μg)，其通过将反应混合物暴露于微波50秒制备而得。泳道3载有在经HindIII切割的λDNA的连接反应中获得的产物，其中连接反应在37℃经45分钟完成。泳道5载有在经HindIII切割的λDNA的连接反应中获得的产物，其中连接反应在微波照射下20秒完成。将在泳道3和5中得到的DNA再次用HindIII通过微波照射50秒进行切割，并分别载入1.0％琼脂糖凝胶的泳道4和6中。这些泳道中各自含有1.5μg DNA(实施例3)。
附图460mer寡核苷酸经T4多核苷酸激酶的激活(kination)。
60mer寡核苷酸(5’CCCCGCCCCGCG 3’)5经T4多核苷酸激酶在微波下暴露20(泳道1)、30(泳道2)、50(泳道3)和0(泳道4)秒(实施例5b)的激活。
附图5。泳道1。
微波介导的经大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段的DNA合成。
HindIII消化λDNA，之后用大肠杆菌DNA聚合酶I完成末端补齐反应所得产物的1％琼脂糖凝胶的放射自显影。这两个反应都分别通过700瓦特微波照射50和20秒完成(实施例7)。
附图5。泳道2。
微波介导的消化、去磷酸化、和激活反应。
TPNK催化已经用CIP去磷酸化的DNA EcoRI片段的激活。产物的1％琼脂糖凝胶的放射自显影，所述产物如下制得对λDNA进行EcoRI消化，之后用CIP对EcoRI片段5’-末端去磷酸化，并用TPNK对已经去磷酸化的EcoRI片段5’-末端激活(实施例5a)。
附图6微波介导的、经AMV-RTase的E-选择蛋白mRNA模板指导的cDNA合成。
当AMV-RTase催化反应产物于48℃在45分钟内(泳道2)用Tf1 1DNA得到了一个501bp特异性cDNA，所述反应产物通过微波照射10(泳道1)、30(泳道3)和50(泳道4)秒得到。RT-PCR反应产物在1.4％琼脂糖凝胶中做分析(实施例8)。
附图7微波介导的、经AMV-RTase的合成mRNA模板指导的cDNA合成。
当AMV-RTase催化反应产物于48℃在45分钟内(泳道3)用Tf1 1 DNA聚合酶进行PCR扩增时得到了一个323bp特异性cDNA，所述反应产物通过微波照射30(泳道5)和50(泳道6)秒得到。RT-PCR反应产物在1.4％琼脂糖凝胶中做分析。在对照反应中，泳道2(45分钟48℃)和泳道4(50秒微波暴露)未添加RNA模板(1151nt体外合成的RNA，获自Promega)。泳道1中，载有pBR 322 BstN1标记DNA(实施例9)。
表1现有技术与本发明的比较以及本发明相对现有技术的优点



在本发明进一步的另一实施方式中，本发明包括经微波诱导的酶促反应完成的核酸位点特异性切割、修饰和体外合成，即限制性内切核酸酶消化、连接、去磷酸化、磷酸化(kination)、体外DNA合成、反转录和体外RNA合成，的快速有效方法。该方法包括将含有酶和底物的混合物在处于最大输出功率的微波炉中短期连续暴露于微波。
在本发明进一步的另一实施方式中，该方法导致核酸在5至120秒内的高度选择性特异性切割、修饰和合成。所有反应进行不同的微波暴露持续时间以寻找最适宜的反应时间。各自的酶在微波照射下对其反应混合物所产生的产物与通过常规方法在最适宜温度(37℃或以下)进行30分钟至数小时所产生的一致。在微波炉外进行相同时间(与由微波介导的反应所使用的时间一样)的对照反应未产生目的反应产物。用或不用酶时出现的非特异性DNA条带的缺失显示，微波既不诱导非特异性核酸酶活性也不导致由本发明反应条件产生的DNA片段化。
在本发明进一步的另一实施方式中，研究了HindIII在最高功率水平(700瓦特)下在微波中暴露0-130秒的稳定性。观察到，在700瓦特下照射0-130秒后，HindIII在含有50％甘油(v/v)的稀释缓冲液中失去其活性。
在本发明进一步的另一实施方式中，相反，发现在700瓦特下微波照射0-130秒后，相同的酶(HindIII)在其消化缓冲液(反应混合物的总甘油含量为6.25％v/v)中是稳定的(实施例1，附图1)。
在本发明进一步的另一实施方式中，我们已经发现，通过本发明的方法，即在最高功率水平对反应混合物不间断持续微波照射，可以完成限制性内切核酸酶消化。这与报道的方法相反，在已报道的方法中发现酶在最高功率水平丧失其活性。
在本发明进一步的另一实施方式中，该方法导致核酸在相当少的时间内以最高特异性(经过消化的DNA是可再连接的)的高度选择性消化。当含有底物DNA、酶和相容缓冲液的混合物暴露于最高功率水平的微波时，限制性酶例如BamHI、EcoRI、HindIII、HaeIII、BglII、PstI和BstEII的内切核酸酶活性被增强。在典型试验中，当暴露于微波30-70秒后，在20μl反应体积中1μg λDNA被5-20单位(如New EnglandBiolabs所定义的)各限制性酶完全消化(实施例2，附图2)。在暴露于微波的相同时间内，还发现底物DNA用两种酶例如EcoRI和HindIII的双重消化也是完全的。经本发明方法的限制性内切核酸酶消化的另一优点是，该方法对于很宽范围内的限制性内切核酸酶以及底物DNA都相当一致。底物DNA包括λ噬菌体、杆状病毒、质粒、植物和哺乳动物。用本发明的、和常规的程序，通过连接反应来核实根据本发明方法的限制性酶催化的底物DNA位点特异性切割。
在本发明进一步的另一实施方式中，由HindIII产生的交错切割的DNA片段和由HaeIII产生的平末端DNA片段在10至15秒内通过微波照射被T4 DNA连接酶完全连接。根据各常规方法于16℃ 8小时完成对照试验。
在本发明进一步的另一实施方式中，将由限制性内切核酸酶产生的DNA片段(由常规的以及本发明的方法)用作连接反应的底物，将所连接的DNA再次用相同的酶做限制性内切核酸酶消化时产生了相同的特异性片段(实施例3，附图3)。
在本发明进一步的另一实施方式中，修饰的核酸即去磷酸化的、磷酸化的和连接的DNA是分子生物学中的重要工具。反应混合物在微波中暴露10-60秒内得到了充足量的所有这些产物，与常规方法相比这是一个显著缩短的反应时间。因此，用牛肠碱性磷酸酶(CIP)在微波中经20-50秒的不同时间完成了对由限制性内切核酸酶所产生的DNA片段的末端磷酸基团去磷酸化。当微波介导的反应产物(去磷酸化DNA)不能被T4 DNA连接酶连接但是可以被T4多核苷酸激酶(实施例4)激活时，该反应产物即得到验证。去磷酸化的、限制性内切核酸酶切割的DNA片段被T4多核苷酸激酶(TPNK)和[γ32P]ATP在微波炉中10至50秒内磷酸化。用三氯乙酸可沉淀计数和放射自显影两者估测DNA的磷酸化。在30秒微波反应内获得的磷酸化程度与由37℃常规反应20分钟得到的相同(实施例5)。
在本发明进一步的另一实施方式中，还用合成寡核苷酸作为微波炉内激活反应以及之后的去磷酸化反应的底物。对于核酸这两个反应都以相同的效率发生(实施例5b，附图4)。在本发明进一步的另一实施方式中，本发明方法中的酶催化体外合成包括DNA模板指导的DNA和RNA合成和RNA模板指导的DNA合成(反转录)。
在本发明进一步的另一实施方式中，以切口DNA模板(切口平移)和带有3’凹陷末端的交错切割限制性内切核酸酶片段为模板通过微波照射完成了由大肠杆菌DNA聚合酶I催化的DNA依赖的DNA合成。在微波炉中完成了经不同时间的切口平移。DNA合成通过三氯乙酸(TCA)可沉淀计数中[α32P]dCTP的掺入来监控。发现，每微克切口DNA在45秒微波反应中的TCA可沉淀计数与在16℃下常规反应60分钟的相同。然而发现，在30秒微波反应中所获得的结果比常规反应的结果要差，而在60秒内获得的结果比常规反应给出的结果要好(实施例6)。
在本发明进一步的另一实施方式中，通过本发明方法在切口平移中所合成DNA的保真性进一步通过与模板DNA(非切口的)的Southern杂交来验证。当将含大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段和带3’凹陷末端的DNA模板的反应混合物暴露于微波时，在20秒内产生了平末端DNA。发现，20秒微波照射中的DNA合成程度与37℃ 30分钟完成的对照试验中的相同。微波暴露较少的时间显示不完全的结果，而较长的时间显示相同或稍好的结果。微波下合成的DNA经(i)[α32P]dCTP的掺入、(ii)放射自显影和(iii)与平末端载体DNA(实施例7；附图5，泳道1)连接，来确定。
在本发明进一步的另一实施方式中发现，RNA聚合酶和反转录酶的催化活性在微波影响下加速。因此，用两个模板RNA和模板特异性引物通过不同时间的微波照射完成了由禽成髓细胞瘤病毒反转录酶(AMV-RT)催化的RNA指导的DNA(cDNA)合成。发现最适宜的暴露时间是50秒，它给出了与对照反应中相同的合成量，对照反应通过常规方法于48℃ 45分钟完成。甚至在微波暴露10秒钟内就出现了可以感知的反应程度。经Tf1聚合酶在反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)中监控扩增后的cDNA合成(实施例8，附图6和实施例9，附图7)。
在本发明进一步的另一实施方式中，DNA指导的RNA合成(转录)需要特异性DNA序列(启动子)以使RNA聚合酶与模板DNA结合引发转录。分别用pSPT 18和pSPT 19-新DNA模板(Boehringer MannheimGermany，Cat No.999644)完成了由T7 RNA聚合酶催化的RNA体外合成。通过[α32P]UTP掺入和特定大小转录物的合成检测了由对反应混合物微波照射介于5-20秒不同时间得到的产物。发现在5秒微波反应中得到的三氯乙酸可沉淀计数几乎与在37℃ 20分钟完成的常规反应中得到的相同。
在本发明进一步的另一实施方式中，所有反应在约2450MHz频率、最大输出功率约700w下工作的家用微波炉(BPL，India)中完成。所有反应在处于最高功率水平(水平10)下的微波炉中实施，这意指700瓦特输出功率的100％磁电管工作循环，这意味着磁电管负载循环为700瓦特输出功率的100％。
在本发明进一步的另一实施方式中，如同常规程序，通过缓冲液、底物和酶以确定体积相继混合进行反应。在本发明进一步的另一实施方式中，所有这些酶催化反应在常规反应所使用的pH和离子环境中完成。反应混合物被置于微量离心管中并置于微波炉转盘的中心。优选将反应混合物暴露于微波5-120秒。在微波照射期间，保持微量离心管不加盖。微波照射结束后通过加入乙二胺四乙酸(EDTA，pH8.0)和/或于75℃加热3-15分钟立即使反应终止。通过常规方法例如琼脂糖凝胶电泳、放射自显影、三氯乙酸(TCA)可沉淀计数、连接、激活、杂交、和转化，来分析反应产物。将用本发明方法做的所有反应结果与在常规反应中得到的作比较，其中，所述常规反应通过将反应混合物在对该酶的适宜温度水浴中孵育而完成。
对于核酸的位点特异性切割、修饰和合成，本发明是对迄今现有方法的独特改进实例。
以下实施例描述了本发明的细节，仅通过举例说明的方式产生，且由此不应被解释为对本发明范围的限制。可以预计，如同下文中所要求的该发明可以在其范围内作出各种修饰。
实施例1消化缓冲液中的HindIII在暴露于700瓦特微波后的稳定性。
5μl(100单位)HindIII用16μl 10×HindIII消化缓冲液(100mM Tris HCl，pH7.9，500mM NaCl，100mM MgCl2，10mM DTT)与107μl水的混合物稀释至144μl后，以16μl等分量置于微量离心管中。将各等分量在700瓦特(功率水平10)微波下暴露不同时间0、30、50、70、90、110和130秒。通过常规和微波介导反应对λDNA的消化来检测各经照射的酶。
向各管中加入4μl(2.0μg)λDNA后用经照射酶完成消化。将其半量放入微量离心管，并如同常规方法一样在37℃孵育4小时。
在微波介导的反应中，将余下的一半点在一张石蜡膜上，将膜置于微波炉中心并用700瓦特微波照射50秒。
全部反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，其中各孔中载有1.0μg消化的DNA(附图1)。
实施例2700瓦特微波照射对DNA的限制性内切核酸酶消化。
将反应混合物点在石蜡膜上在微波炉内50秒同时完成所有消化。在20.0μl反应体积中用2.0μg DNA、1.0μl各自缓冲液中的各酶完成了HindIII、BamHI、EcoRI对λDNA的消化、EcoRI和HindIIII对λDNA的双重消化以及PstI对豌豆凝集素cDNA克隆在PUC19载体PstI位点的消化。在EcoRI消化缓冲液完成了HindIII和EcoRI的双重消化。对照反应在20.0μl HindIII消化缓冲液中使用了2.0μg λDNA，不使用酶。每μl酶含有20.0(HindIII和EcoRI)或10.0(BamHI和pstI)单位。1.0％琼脂糖凝胶各泳道加载1.0μg DNA(附图2)。
实施例3通过微波照射用HindIII消化λDNA之后用T4 DNA连接酶作连接反应8.0μg DNA在1.5-ml微量离心管内的160.0μl含有5.0μl(100单位)HindIII和16.0μl 10×HindIII消化缓冲液的反应体积中在微波炉内消化50秒，制备了用于连接反应的HindIII片段。
将含有6.0μg HindIII片段、2.0μl 10×连接缓冲液(50mMTris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、10mM DDT、1mM ATP和25μg/mlBSA)和20粘附单位(cohesive unit)T4 DNA连接酶(New EnglandBiolab.Inc.USA)的20.0μl连接反应混合物以10.0μl等分量分置于两个0.5ml微量离心管中。将一个含有反应混合物的管暴露于微波20秒，另一管在37℃保持45分钟。65℃加热5分钟使反应终止。如上述再通过微波照射用HindIII切割各微量离心管中的一半DNA(1.5μg)。余下的一半用于通过琼脂糖凝胶电泳确证连接片段的产生。
在对照试验中，未切割的λDNA(1.0μg)在HindIII消化缓冲液中用700瓦特微波照射50秒以找出是否有非特异性切割(附图3)。
实施例4经碱性磷酸酶的去磷酸化反应。
用5单位牛肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)在含有1.0μgDNA、10mM Tris-HCl(pH7.9)、10mM MgCl2、50mM NaCl和1mM DTT的20μl反应体积于微波炉中完成了λEcoRI片段5’磷酸基团的去磷酸化。微波暴露30秒后，通过加入2μl 0.5mM EDTA(pH8.0)之后于75℃温育15分钟使反应终止。DNA通过苯酚-氯仿抽提除去蛋白质，最后用乙醇沉淀。发现由此获得的经磷酸酶处理的DNA片段不能被T4 DNA连接酶连接但是可以被多核苷酸激酶有效的激活，这证实了30秒内去磷酸化的功效。
实施例5经T4多核苷酸激酶的激活反应。
a)如实施例2中所述用EcoRI经50秒内微波照射使λDNA片段化。
如上述在微波炉中用1.0μg DNA和1.0单位CIP在1.5ml微量离心管内的20.0μl反应体积中完成了经CIP的去磷酸化反应。
将20μl含有T4多核苷酸激酶(Bangalore Genei)、70mM Tris-HCl(pH7.6)、10mM MgCl2、5mM DTT和20μCi[γ32P]ATP(Sp.活性＞4000Ci/mmole)的反应混合物点在石蜡膜上并暴露于微波20秒，由此完成了0.5μg λDNA去磷酸化EcoRI片段的5’羟基基团的磷酸化。通过加入EDTA(pH8.0)至5mM(终浓度)之后加热至65℃10分钟使反应终止。通过旋转柱(spin column)Sephadex G-50凝胶过滤除去未掺入的放射活性。通过载入0.1μl的反应体积利用放射自显影验证DNA片段的磷酸化。
b)如上所述用微波照射不同时间(0，50，30和20秒)完成了T4多核苷酸激酶对0.1μg 60mer寡核苷酸(5’CCCCGCCCCGCG 3’)55’羟基基团的磷酸化(附图4)。
实施例6经大肠杆菌聚合酶I的DNA合成。
将含有1μg切口λ噬菌体DNA或苜蓿银纹夜蛾核型多角体(Autographa Californica nucleopolyhedrosis)病毒(AcNPV)DNA模板(用5毫微微克Dnase I处理)、5单位大肠杆菌DNA聚合酶I(NEB)、50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgSO4、1mM二硫苏糖醇(DTT)、50μg/ml牛血清白蛋白(BSA，pentax fraction V)、未标记dATP、dTTP、dGTP(各1nM)、100μCi[α32P]dCTP(Sp.活性＞4000Ci/mmole)的50μl反应体积在微波炉内保持不同时间，完成大肠杆菌DNA聚合酶I催化的DNA合成反应。暴露于微波后加入4μl 0.25M EDTA(pH8.0)使反应终止。经小Sephadex G-50柱离心除去未掺入放射性核苷酸后用三氯乙酸(TCA)沉淀检测法测定使用各DNA模板的DNA合成。45-秒微波反应中合成的DNA量与在16℃ 60分钟完成的常规反应中合成的相同。经本发明方法合成的标记DNA与模板DNA的未标记限制性内切核酸酶消化物有效杂交。
实施例7经大肠杆菌聚合酶I Klenow片段的DNA合成在微波炉中20μl反应体积内完成由大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段催化的DNA合成，其中所述反应体积内含有1μg HindIIIλ噬菌体DNA片段(如实施例1所述由微波照射产生的)、1μl(8单位)大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段、50mM Tris HCl(pH7.2)、10mMMgSO4、1mM DTT、50μg/ml BSA、4pmoles[α32P]dCPT(Sp.act.＞4000μCi/mmole)和2n moles各dTTP、dATP、dGTP。将反应混合物点至石蜡膜上，暴露于微波20秒，之后加入4μl 0.25M EDTA(pH8.0)使反应终止。如果使用的是放射性核苷酸，则通过Sephadex G-50旋转柱除去未掺入的核苷酸。通过TCA可沉淀计数测定DNA合成对模板DNA 3’凹陷末端的补平，并通过放射自显影以及与平末端载体DNA的连接来确证DNA合成的特异性。由本发明微波反应合成DNA的程度与37℃用常规方法30分钟得到的相同(附图5，泳道1)。
实施例8用AMV-RTase完成的、微波介导的E-选择蛋白mRNA模板指导的cDNA合成。
利用E-选择蛋白[Tucker等人(1991)J.Biol.Chem.，266，2466-2473]和特异性正向引物，通过将反应混合物分别暴露于微波10、30和50秒，完成了三组不同的由禽成髓细胞瘤病毒反转录酶(AMV-RTase)催化的cDNA合成试验。加入模板特异性正向和反向引物和Tf1 DNA聚合酶对第一链cDNA反应产物进行扩增后通过琼脂糖凝胶电泳鉴定了具有特定大小的cDNA。对E-选择蛋白mRNA模板所用的正向和反向引物分别是5’-GAGTGGGCATGTGGAATGATG-3’和3’-GGTCTCGGAAGTCACATGGA-5’。将AMY反转录酶失活(94℃下2分钟)后经40循环(94℃ 30秒/变性，60℃ 1分钟/退火，68℃ 2分钟/延伸)完成了第二链cDNA合成和PCR扩增。50μl反应体积中的RT-PCR反应组合物为50mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、10mM MgCl2、0.5mM亚精胺、10mM DTT、0.2mM dNTP(每种)、1μM正向引物、1μM反向引物、1mM MgSO4、5单位AMV-Rtase和5单位Tf1 DNA聚合酶。加入RNA起始该反应。除了E-选择蛋白mRNA及其引物，所有RT-PCR反应成分均获自Promega。
特定大小扩增产物的形成，对于E-选择蛋白mRNA模板，在本发明以及常规方法中该大小都为501bp，证实了mRNA的特异性第一链cDNA合成。50秒内合成的扩增cDNA量比在常规反应中得到的要多(附图6)。
实施例9用AMV-RTase完成的、微波介导的合成mRNA模板指导的cDNA合成。
利用合成的mRNA模板(获自Promega的1151nt体外合成的RNA)和特异性正向引物，通过将反应混合物分别暴露于微波10、30和50秒，完成了三组不同的由禽成髓细胞瘤病毒反转录酶(AMV-Rtase)催化的cDNA合成试验。加入模板特异性正向和反向引物和Tf1 DNA聚合酶对第一链cDNA反应产物进行扩增后通过琼脂糖凝胶电泳鉴定了具有特定大小的cDNA。对合成的mRNA模板所用的正向和反向引物分别是5’GCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTC-3’和3’GACTGAACTGCCGCCGA-5’。特定大小扩增产物的形成，对于合成的mRNA模板，在本发明以及常规方法中该大小都为323bp，证实了mRNA的特异性第一链cDNA合成。50秒内合成的扩增cDNA量比在常规反应中得到的要多。
将AMV反转录酶失活(94℃下2分钟)后经40循环(94℃ 30秒/变性，60℃ 1分钟/退火，68℃ 2分钟/延伸)完成了第二链cDNA合成和PCR扩增。50μl反应体积中的RT-PCR反应组合物为50mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、10mM MgCl2、0.5mM亚精胺、10mM DTT、0.2mMdNTP(每种)、1μM正向引物、1μM反向引物、1mM MgSO4、5单位AMV-Rtase和5单位Tf1 DNA聚合酶。加入RNA起始该反应。所有RT-PCR反应成分均获自Promega。
实施例10经T7 RNA聚合酶的RNA合成。
分别用经EcoRI切割的pSPT18-neo和pSPT19-neo DNA(BoehringerMannheim，Germany)在20μl反应体积中完成了由SP6和T7 RNA聚合酶催化的RNA合成。每一反应混合物含有0.5μg DNA模板，0.5mM各ATP、GTP、CTP、UTP，40mM Tris-HCl(pH7.9)，6mM MgCl2，2mM亚精胺，10mM DTT。为进行标记合成，用50μCi[α32P]UTP(＞400Ci/mmol)替代了0.5mM UTP。将反应混合物暴露于微波照射20秒，之后加入2μl 0.25M EDTA(pH8.0)使反应终止。在TCA可沉淀计数中通过[α32P]UTP的掺入测定了RNA合成。发现由本发明方法合成的TCA可沉淀RNA比在37℃下45分钟完成的常规方法多。通过甲醛-琼脂糖凝胶测定了用冷NTPs合成的RNA的大小，发现它与用常规方法得到的相同。
工业实用性本发明提供了可用于经短暂不间断微波照射快速有效制备由酶催化反应产生的产物的方法。本发明的方法适于生物技术，更特别是适于分子生物学、工业加工和污水处理。本发明方法也适于相关领域中的自动化。本发明的基于微波的方法对于快速位点特异性DNA切割、寡核苷酸和DNA修饰、以及核酸体外合成特别有用。反应包括DNA的限制性内切核酸酶消化，核酸连接、去磷酸化、激活、及体外合成。
其中获得的产物是分子生物学的关键，且为基因组作图、DNA扩增、DNA测序、基因表达、目的产物纯化、重组DNA技术中的基因操作等所需。本发明适于分子生物学中的自动化。
优点1.位点特异性切割、DNA和寡核苷酸的修饰、以及核酸合成中反应时间的大大减少是本发明的主要优点。对于限制性内切核酸酶消化、连接、去磷酸化、磷酸化(激活)、反转录、体外DNA合成和体外RNA合成，反应时间降至5-70秒。
2.分子生物学以及其它领域中使用的几乎所有酶促反应可以通过本发明的方法在极短的时间内完成，这节省了宝贵的时间并因此使本方法经济且全能化。
3.反应条件非常简单，而且不需要任何贵重的设备。
4.本发明的方法可用于分子生物学自动化。
5.本发明的方法可用于涉及酶促反应的生物技术工业。
权利要求
1.一种利用了不间断短暂微波照射的简单、有效、且加速的体外酶催化核酸修饰和合成方法，所述方法包括步骤(a)在小微量离心管或小片石蜡膜上提供反应混合物，该反应混合物含有(i)选自限制性内切核酸酶、连接酶、磷酸酶、激酶、反转录酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶的酶(ii)选自DNA、RNA或寡核苷酸的生物分子，以用作所选择酶的底物，(iii)适于特定酶的缓冲液以及(iv)其它成分，(b)将载有所述反应混合物的所述微量离心管或石蜡膜片置于微波炉内，(c)用600至900瓦特的输出功率、2300至2500MHz的频率的微波持续照射所述微量离心管或石蜡膜，(d)持续5至120秒，(e)加入乙二胺四乙酸(EDTA)和/或在75℃水浴中加热3-15分钟使反应终止，之后加入凝胶上样染料，(f)用琼脂糖凝胶电泳、放射自显影、放射计数和常规方法中使用的其它技术分析反应产物。
2.如权利要求1中所要求的方法，其中核酸选自DNA、RNA和寡核苷酸。
3.如权利要求1中所要求的方法，其中其它成分选自MgCl2、MgSO4、NaCl、KCl、CH3COOK、乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇、亚精胺、BSA、triton x-100、核苷酸、模板DNA、模板RNA和寡核苷酸引物。
4.如权利要求1中所要求的方法，其中限制性内切核酸酶选自Hind III、BamHI、EcoRI、Hae III、Bgl II、Pst I、Bst E II和BstNI。
5.如权利要求1中所要求的方法，其中所用的连接酶是T4 DNA连接酶。
6.如权利要求1中所要求的方法，其中所用的激酶是T4多核苷酸激酶(TPNK)。
7.如权利要求1中所要求的方法，其中所用的磷酸酶是牛肠碱性磷酸酶(CIP)。
8.如权利要求1中所要求的方法，其中聚合酶选自大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段、T7 RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶。
9.如权利要求1中所要求的方法，其中所用的反转录酶是禽成髓细胞瘤病毒-反转录酶(AMV-RT)。
10.如权利要求1中所要求的方法，其中所用的DNA选自基因组DNA、λ噬菌体DNA、质粒DNA、杆状病毒DNA、植物DNA和哺乳动物DNA。
11.如权利要求1中所要求的方法，其中使用了不只一种限制性内切核酸酶以用于核酸双重消化。
12.如权利要求11中所要求的方法，其中为双重消化所用的限制性内切核酸酶是EcoRI和Hind III。
13.如权利要求1中所要求的方法，其中微波照射可以在其中可以产生微波的任何装置或腔室中完成。
14.如权利要求1中所要求的方法，其中所述方法可以通过专门设计的装置被部分或完全自动化。
15.适于完成权利要求1的酶促反应的装置，其中所述装置含有(a)由磁电管、排气扇、纤维光学温度计、冷却系统和旋转反应平台组成的反应腔，(b)基于微处理器的计算手段，以通过适宜硬件和软件给出完成不同反应的预编程命令。
16.如权利要求15中要求的装置，其中磁电管是微波来源，在约2450MHz的频率、100瓦特至800瓦特的输出功率下工作。
全文摘要
本发明涉及利用2300至2500MHz、600至900瓦特输出功率的不间断短暂微波照射5至120秒的、简单、有效、且加速的酶催化体外核酸修饰及合成方法，以及进一步，利用所述方法的装置。
文档编号C12P19/00GK1650002SQ02829418
公开日2005年8月3日 申请日期2002年7月4日 优先权日2002年6月14日
发明者R·H·达斯, P·纳哈尔 申请人:科学与工业研究会