专利名称：应用胎儿脐血阻断血友病a致病基因传递的方法
技术领域：
本发明涉及一种临床血液学和围产医学的技术方法，具体涉及一种应用胎儿脐血阻断血友病A致病基因传递的方法。
背景技术：
血友病A(HA)是一种常见的X连锁隐性遗传性出血性疾病，女性为携带者，男性发病。HA患者的特征为自发性或轻微外伤后出血不止，患者终生需要输注凝血因子VIII制品治疗和预防出血，给家庭和社会带来沉重的负担。若得不到及时诊断和治疗，患者可发生残疾，极大地影响其生活质量，严重的出血可引起患者死亡。虽然目前HA不能根治，但该病是一种遗传性疾病，医学上可以通过遗传学咨询和产前诊断方法，起到预防作用，避免新的HA患者出现，从而达到从源头上控制HA的目的。我国是人口大国，约13亿人口，HA的发病率约为3-5人/10万人口，为此开展HA的基因诊断、携带者检测和产前诊断，阻断致病基因的传递，对提高人口素质和全民族健康水平具有重要的现实意义。
致病基因的携带者检测与产前诊断无疑是减少发病及提高人口素质的一个有效手段，携带者及产前诊断的目的是区别携带者及正常女性，使后者可以正常婚育；对携带者的胎儿进行基因检测，主动阻断血友病A致病基因传递，避免新的HA患儿出生。
九十年代初有学者应用Southern杂交技术检测重型HA患者，发现约近一半的患者存在FVIII基因内含子22倒位(IVS22)。但Southern杂交技术存在着操作步骤复杂、周期长(约1周)、需要放射性同位素和污染环境等缺点。随着分子生物学技术的发展，特别是PCR技术建立和完善，近几年兴起的简便、灵敏而快速的PCR技术逐渐取代Southern杂交技术。刘敬忠等人应用长距离PCR(LD-PCR)技术进行了多家系患者和携带者的诊断和筛查，但未应用于产前诊断。外文文献曾报道应用改良的LD-PCR方法检测FVIII内含子22倒位，但仅在方法上进行了探讨，未将其应用于携带者和产前诊断。
上海第二医科大学瑞金医院王学锋教授等应用PCR技术，利用羊水对5名HA携带者进行了产前诊断，其方法是在孕妇妊娠16-22周时，在B超指引下抽取羊水20ml，提取脱落细胞DNA进行产前诊断。但该方法存在着所需样品量大、提取的脱落细胞DNA纯度低、易受母亲DNA污染等缺点，影响了产前诊断的可靠性。
发明内容本发明要解决的问题是，针对上述方法所存在的不足，提供一种简便、准确、切实可行而便于推广的应用胎儿脐血阻断血友病A致病基因传递的方法。利用本发明的方法可以有效确定胎儿是否为血友病患者，对HA胎儿实施终止妊娠，阻断致病基因的传递，降低HA的发病率，提高出生人口素质。
本发明的应用胎儿脐血阻断血友病A(HA)致病基因传递的方法，由以下步骤组成(1)样品制备选择有血友病A(HA)家族史的女性于妊娠20周后，在超声引导下经皮抽取胎儿脐带静脉血0.9ml或1.8ml，立即与0.1ml或0.2ml3.8％枸橼酸钠抗凝剂混匀，同时以相同方法和用量抽取携带者及其丈夫和正常人外周静脉血作对照；(2)离心将上述样品于4℃条件下，以2400～2500转/分钟离心20～25分钟，取上层1/3～2/3血浆进行凝血因子VIII活性(FVIIIC)和血管性血友病因子(vWF)血清学的生化测定；取白细胞层提取DNA进行PCR联合基因诊断；(3)筛选分型依据上述测定的血浆凝血因子VIII活性和血管性血友病因子浓度，确诊血友病A患者及其携带者，并根据血浆FVIIIC浓度将血友病A患者分为重型HA，其FVIIIC＜1％；中型HA，其FVIIIC1％～5％；轻型HA，其FVIIIC5％～25％、亚临床型HA，其FVIIIC25％～45％；(4)直接基因诊断应用长距离PCR(LD-PCR)技术对上述样品提取的DNA进行产前基因诊断，根据电泳条带的大小和分子量的大小综合判定患者是否存在FVIII基因内含子22倒位；若只出现12Kb带，判为野生型即非倒位；若只出现11Kb带，判为倒位患者；若出现12Kb和11Kb两条带，判为倒位的携带者(见图1)；(5)阻断HA致病基因传递对于上述判为倒位的患者或判为倒位的携带者，应终止妊娠，切断HA致病基因的传递；(6)间接基因诊断对上述非倒位的重型HA、中型HA和轻型HA家系，依次采用Bcl-IPCR/RFLP分析技术、基因内含子13(CA)n及内含子22(GT)n(AG)n二核苷酸重复序列多态性分析技术及与FVIII基因紧密连锁的可变串联重复序列多态性分析技术(St14/VNTR)进行间接基因诊断；(7)阻断HA致病基因传递步骤(6)依次进行的各步基因诊断中，当样品判为HA患者或携带者时，终止妊娠，切断HA致病基因的传递；未作的诊断步骤停止。
上述步骤(2)所述的凝血因子VIII活性测定采用Bigg’s一期法检测。
上述步骤(2)所述的血管性血友病因子测定采用ELISA法或免疫比浊法检测。
上述步骤(4)所述的应用长距离PCR技术中，设计合成的三对引物是P5′-GCC CTG CCT GTC CAT TAC ACT GAT GAC ATT ATG CTG AC-3′；Q5′-GGC CCT ACA ACC ATT CTG CCT TTC ACT TTC AGT GCA ATA-3′；B5′-CCC CAA ACT ATA ACC AGC ACC TTG AAC TTA CCC TCT-3′。
上述步骤(6)所述的Bcl-I PCR/RFLP分析技术中，设计合成的Bcl-I RFLP引物是Pl5′-TTC ATT TCA GTG GAC ATG TG-3′，P25′-CCT ATG GGA TTT GAG ATG GT-3′。
上述步骤(6)所述的基因内含子13(CA)n及内含子22(GT)n(AG)n二核苷酸重复序列多态性分析技术中，基因内含子13(CA)n二核苷酸重复序列多态性引物是P15′-TGC ATC ACT GTA CAT ATG TAT CTT-3′，P25′-CCA AAT TAC ATA TGA ATA AGC C-3′；内含子22(GT)n(AG)n二核苷酸重复序列多态性引物是P35′-TTC TAA GAA TGT AGT GTG TG-3′，P45′-TAA TGC CCA CAT TAT AGA-3′。
上述步骤(6)所述的FVIII基因紧密连锁的可变串联重复序列多态性分析技术(St14/VNTR)中，设计合成的引物是
P15′-GGC ATG TCA TCA CTT CTC TCA TGT T-3′，P25′-CAC CAC TGC CCT CAC GTC ACT T-3′。
上述步骤(4)所述的长距离PCR技术中，PCR反应条件是94℃预变性1-2分钟，进入下列循环；94℃-98℃变性10-12秒，65-68℃复性和延伸10-15分钟，共30个循环，在后20个循环中，每一个循环在65-68℃的保温时间延长20秒。
上述步骤(6)所述的Bcl-I PCR/RFLP分析技术中，扩增条件是94℃预变性2-5分钟，58-60℃，40-90秒，70-72℃，30-40秒，30周期循环后，72℃延伸5分钟。
上述步骤(6)所述的基因内含子13(CA)n及内含子22(GT)n(AG)n二核苷酸重复序列多态性分析技术中，扩增条件是94℃预变性3-10分钟，94℃变性30秒，50℃复性30-50秒，72℃延伸40-60秒，35-40周期循环后，72℃延伸5-10分钟。
上述步骤(6)所述的与FVIII基因紧密连锁的可变串联重复序列多态性分析技术中，扩增条件是94℃1分钟，60℃30秒，72℃2分钟，30周期循环后，72℃延伸7分钟。
采用本发明的应用胎儿脐血阻断血友病A(HA)致病基因传递的方法，具有采集标本方便，所需样品量少(仅仅0.9ml或1.8ml血即可)，能客观而真实地反映胎儿的血浆FVIIIC和vWF浓度，结合PCR基因诊断方法几乎100％对胎儿作出产前诊断，防止了误诊和漏诊，有效地降低了HA的发病率。
本发明的应用胎儿脐血阻断血友病A(HA)致病基因传递的方法，适用于凡生过HA患儿的夫妇，或经检查为HA携带者或HA患者夫妇，如果怀孕，须作其胎儿的HA产前诊断者。
本发明的应用胎儿脐血阻断血友病A(HA)致病基因传递的方法，无论从设计的思路、研究对象、还是方法的运用，均体现出“新颖性、实用性和创造性”；特别是标本的采集和不同实验方法的结合(血清学和PCR方法联合应用)，大大提高了HA诊断水平和准确率，处于领先水平，且简便易行，便于推广应用。
下面结合本发明的方法与国内同类技术的比较，对本发明应用胎儿脐血阻断血友病A(HA)致病基因传递方法的创造性作进一步阐述国内外学者曾用Southern印迹杂交技术发现约39.4％-52.2％重型HA患者存在FVIII基因倒位，该方法可直接用于HA的基因诊断，但该方法需要酶切、电泳、转膜，转膜后的尼龙膜于68℃真空干燥炉中烘干4小时，需要F8A基因探针，该探针用缺口翻译试剂盒以[α-32P]dCTP标记，Sephadex G-50柱层析纯化，Southern印迹预杂交和杂交后常规放射自显影。因存在操作费时费力，周期长，放射性同位素污染环境等缺点而逐渐被简便而灵敏的LD-PCR方法所取代。
安徽吴竟生教授等利用PCR技术对9例携带者进行了研究，设计合成针对FVIII基因22内含子中Xba I多态位点的引物和FVIII基因18外显子3′侧Bcl-I多态位点的引物，结果只有6例携带者作出诊断，其余3例不能作出基因诊断。
金春莲等利用PCR技术以St14位点多态性(St14/VNTR)为遗传标记，对3个HA家系进行连锁分析，对3例携带者进行了产前诊断，妊娠18-20周穿刺抽取羊水，用煮沸法提取羊水脱落细胞DNA，结果1例胎儿正常，另2例为HA男性胎儿。家系中HA胎儿经中期引产检测脐带血血清学，其结果符合基因诊断。
上海第二医科大学瑞金医院王学锋教授等利用羊水对5名血友病A携带者进行了产前诊断，在孕妇16-22周时在B超指引下抽取羊水20ml，提取脱落细胞DNA进行产前诊断。但该方法存在着所需样品量大(20ml羊水)、易受母亲DNA污染的缺点。
曾有学者利用胎儿镜采胎血进行产前诊断，胎儿镜又叫羊膜腔镜或宫腔镜。从宫口插入妊娠14～18周的子宫腔内及羊膜腔内观察胎儿胎盘及脐带情况。但胎儿镜操作过程可以引起羊水感染、脐带创伤、胎盘早期剥离、流产等并发症，文献报告因此而失去胎儿的发生率达5％，器械的选择常常是成功与否的关键，如应用的镜子直径较大，则穿刺时费力，易伤胎儿。子宫壁创伤面大，可引起肌层出血，流入羊膜腔，羊水被血染红后影响视力。如出血量多，可有血块淤集，造成胎儿死亡、流产。
本研究仅仅需要在超声引导下经孕妇腹壁行胎儿脐带穿刺术取胎儿静脉血0.9ml或1.8ml即可，操作简单，风险小，所需样品量小，不需作胎儿镜，简便易行，经济实惠。首先应用血清学方法检测脐血FVIIIC和vWF浓度，再进一步进行采用4种PCR技术进行联合基因诊断，对患者和携带者全部作出诊断。我们建立的这种产前方法简单而敏感，可在妊娠20周以后应用，既能解决某些用羊水细胞培养不能表达出来的基因病，又能避免羊水细胞培养中母体细胞污染；且避免了羊水细胞培养和羊水脱落细胞DNA提取所带来的经济上和时间上消耗。
本发明应用胎儿脐血阻断HA致病基因传递方法的建立，对HA的研究及HA产前诊断方法的创新带来重要意义(1)国内外首次利用胎儿脐血，对PCR阳性携带者进行产前诊断。通过检测血浆FVIIIC、vWF浓度结合4种PCR技术，大大提高了产前诊断的准确性，对HA胎儿，建议放弃妊娠，对非HA患儿建议继续妊娠，阻断致病基因的传递，防止新的HA患者出生，降低HA发病率，减轻家庭和社会负担，具有重大的社会效益和经济效益。(2)PCR结果的判定 结合应用凝胶成像系统的分析软件，根据不同的片段其分子量大小不同而使PCR扩增后的电泳结果判定更为准确。PCR技术使HA的诊断水平得到提高，结合血浆FVIIIC测定及vWF检测，使HA患者的诊断更准确、可靠，为以后开展HA基因治疗奠定了基础。(3)DNA测序验证PCR结果 为进一步确保PCR技术基因诊断HA患者及其携带者的可靠性，本研究首次选择DNA测序技术验证PCR结果，研究发现DNA测序结果同Gene Bank序列吻合，表明本研究建立的简便而灵敏的LD-PCR技术可用于临床基因诊断重型血友病A患者、携带者及其产前诊断。
图1重型血友病患者和携带者DNA标本LD-PCR电泳结果其中MDNA分子量标准(λDNA/Hind III)；标本1只出现11Kb带，提示患者FVIII基因内含子22倒位；标本2出现11Kb、12Kb两条带，提示此例为FVIII基因内含子22倒位的女性携带者；标本3和4只出现12Kb带，为野生型，即非基因倒位。
具体实施方式
实施例11.选择有血友病A(HA)家族史的女性于妊娠20周后，在超声引导下经皮(腹壁)抽取胎儿脐带静脉血0.9ml或1.8ml，立即与0.1ml或0.2ml3.8％枸橼酸钠抗凝剂混匀。同时抽取携带者及其丈夫和正常人外周静脉血0.9ml或1.8ml作对照，也与0.1ml或0.2ml3.8％枸橼酸钠抗凝剂混匀，将所有样品于4℃2400转/分钟离心20分钟。取上层2/3血浆供血生化FVIIIC和vWF测定；取白细胞层抽取DNA供PCR联合基因诊断。
2.检测胎儿脐血血浆FVIIIC和vWF浓度，并与携带者及其丈夫和正常人外周静脉血血浆FVIIIC和vWF浓度相比较。
应用德国产兰波4通道半自动血凝仪，Bigg’s一期法检测血浆FVIIIC。
FVIIIC测定具体操作如下(1)标准血浆的对倍稀释取标准血浆100μl加入900μl咪唑缓冲液(pH7.35)中稀释(1∶10稀释，FVIIIC定为100％)，充分混匀置冰水中；从1∶10标准血浆稀释液取500μl加入500μl咪唑缓冲液(pH7.35)中(1∶20稀释，FVIIIC为50％)，充分混匀置冰水中；从1∶20标准血浆稀释液取500μl加入500μl咪唑缓冲液中(1∶40稀释，FVIIIC为25％)，依次将标准血浆稀释至1∶80即FVIIIC为12.5％，将标准血浆稀释至1∶160即FVIIIC为6.25％。
(2)待测标本的稀释同样取待测血浆100μl加入900μl咪唑缓冲液(pH7.35)中，充分混匀置冰水中。
(3)主要试剂的准备将APTT试剂先在37℃活化至少3分钟后置于冰水中。将35mmol/L氯化钙置37℃水浴箱中孵育。
(4)标准曲线的制作取50μl稀释的标准血浆加入一次性测试杯中，加入50μl已活化的APTT试剂，孵育10分钟；加入50μl 35mmol/L氯化钙，立即记录凝固时间。根据上述5个不同稀释度(不同FVIIIC浓度)的标准血浆所得的凝固时间不同而绘制双对数曲线，横坐标为FVIIIC浓度，纵坐标为凝固时间，计算相关系数r值，要求r大于0.95。
(5)待测样品的FVIIIC测定取50μl待测稀释样品加入一次性测试杯中，加入50μl已活化的APTT试剂，孵育10分钟。加入50μl 35mmol/L氯化钙，立即记录凝固时间。根据待测稀释样品的凝固时间从双对数曲线上查找FVIIIC浓度。正常值范围为50％-150％。
应用瑞士产FAME全自动生化分析仪ELISA法或免疫比浊法检测vWF浓度。vWF浓度测定具体操作如下取8μl标准血浆(参比血浆)加入U型板孔内，注意加到孔底，加入300μlvWF抗血清，反应300秒，在全自动生化分析仪上读取A值。用同样的方法读取待测样品的A值，vWF含量＝待测样品的A值除以参比血浆的A值乘以100％。正常值范围为60-150％。
3.依据上述测定的血浆凝血因子VIII活性和血管性血友病因子浓度，确诊血友病A患者及其携带者，并根据血浆FVIIIC浓度将血友病A患者分为重型HA(FVIIIC＜1％)、中型HA(FVIIIC1％-5％)、轻型HA(FVIIIC5％-25％)和亚临床型HA(FVIIIC25％-45％)。
4.进一步应用联合基因诊断技术进行产前诊断，诊断出血友病胎儿或作出排除诊断。
样品DNA抽取，应用G&T公司提供的基因组DNA提取药盒抽提DNA。采用四种PCR扩增技术联合基因诊断。
(1)首先应用长距离PCR(LD-PCR)技术进行产前基因诊断，直接基因诊断携带者是否存在FVIII基因内含子22倒位并检测出基因倒位的胎儿。设计合成以下三对引物，P5′-GCC CTG CCT GTC CAT TAC ACT GAT GAC ATT ATG CTG AC-3′；Q5′-GGC CCT ACA ACC ATT CTG CCT TTC ACT TTC AGT GCA ATA-3′；B5′-CCC CAA ACTATA ACC AGC ACC TTG AAC TTA CCC TCT-3′。反应体系为25μl，在0.2ml薄壁反应管中加入以下PCR混合物1×缓冲液，400μmol/L dNTP(含dGTP及deaza-dGTP各200μmol/L)，2.5U ExpandTM混合酶，7.5％的DMSO，引物P、Q和B浓度分别为0.2、0.2、0.15μmol/L，模板DNA1μl(约0.5μg)，混匀后加石蜡油20μl。PCR反应在PE2400扩增仪上进行，条件如下94℃预变性2分钟，进入下列循环94℃变性12秒，65℃复性和延伸15分钟，共30个循环，在后20个循环中，每一个循环在65℃的保温时间延长20秒。电泳扩增后，用1×TBE缓冲液配制0.6％琼脂糖凝胶，取10μl PCR产物加3μl 6×上样缓冲液和7μl 1×TBE缓冲液，混匀后于37℃水浴10分钟，加样品。水平式电泳仪，电压55伏(2～4v/cm)，稳流，电泳16h。EB染色1小时以上，在凝胶成像仪上观察电泳结果，借助于凝胶成像仪上的软件，根据电泳条带的大小和分子量的大小综合判定患者是否存在FVIII基因内含子22倒位。若只出现12Kb带，判为野生型(非倒位)；若只出现11Kb带，判为倒位患者；若出现12Kb和11Kb两条带，判为倒位的携带者(见图1)。对于上述判为倒位的患者或判为倒位的携带者，应终止妊娠，切断HA致病基因的传递。
为确保LD-PCR技术基因诊断重型HA患者及其携带者的可靠性，本发明在国内外首次选择DNA测序技术验证LD-PCR结果，研究发现DNA测序结果同Gene Bank序列吻合，表明本研究建立的简便而灵敏的LD-PCR技术可用于临床基因诊断重型HA患者、携带者及其产前诊断，对LD-PCR基因诊断阳性的胎儿，终止妊娠，阻断HA致病基因的传递。
应用LD-PCR技术对山东省108例重型HA患者及其携带者进行了FVIII基因IVS22的研究，发现约39.8％重型HA患者存在FVIII基因IVS22，22例携带者中7例存在FVIII基因IVS22，其中对3例LD-PCR阳性携带者于妊娠20-24周在超声引导下抽取胎儿脐血，应用血清学和LD-PCR技术联合进行产前诊断，防止重型HA患儿或携带者的出生，阻断致病基因的传递，降低重型HA发病率。
由于导致HA的FVIII基因突变主要为内含子22倒位(重型患者中约50％患者发病与此有关)，因此携带者或产前诊断应首先进行内含子22的倒位检测，若家系成员检测结果阳性即可诊断为HA患者或致病基因的携带者。内含子22倒位检测属直接检测HA的基因缺陷，所以对一些家系成员不全或由于新生突变所致HA的家系尤其重要。因此开展重型HA的产前诊断，降低HA发病率，具有重大的社会效益和经济效益。
(2)对非倒位的HA家系(非倒位的重型HA、中型HA和轻型HA家系)依次采用BclI PCR/RFLP分析技术、基因内含子13(CA)n及内含子22(GT)n(AG)n二核苷酸重复序列多态性分析技术及与FVIII基因紧密连锁的可变串联重复序列多态性分析技术(St14/VNTR)进行间接基因诊断。在上述依次进行的各步基因诊断中，当样品判为HA患者或携带者时，终止妊娠，切断HA致病基因的传递；未作的诊断步骤停止。
对基因诊断阳性者随机取样进行DNA测序以验证PCR结果的可靠性。目的是通过联合应用4种PCR方法，对HA患者及其家系进行联合基因诊断，最大限度地提高HA患者及其家系成员的基因诊断、携带者检出及产前诊断的水平，为血友病A的遗传咨询提供科学依据。
①Bcl-I PCR/RFLP分析技术具体步骤如下设计合成Bcl-I RFLP引物P15′-TTC ATT TCA GTG GAC ATG TG-3′，P25′-CCTATG GGA TTT GAG ATG GT-3′。反应体系为总体积为25μl，含基因组DNA 0.1μg，引物P1和P2各0.4μmol/L，dNTP 100μmol/L，1×缓冲液，Tag DNA聚合酶0.5U。按以下条件进行扩增预变性94℃2分钟，60℃40秒，72℃40秒，30周期循环后，72℃延伸5分钟。PCR产物5μl进行2％琼脂糖凝胶电泳(电压110V)，观察到DNA扩增的特异性片段后，取PCR产物5μl，用Bcl-I酶10U，50℃保温4h，酶解产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察结果。扩增片段长度为374bp，含有Bcl-I酶切位点的片段经Bcl-I酶切后长度为211bp和163bp，不含Bcl-I酶切位点的片段经Bcl-I酶切后长度仍为374bp。根据不同的扩增片段长度进行连锁分析，判定携带者和患者。
②基因内含子13(CA)n及内含子22(GT)n(AG)n二核苷酸重复序列多态性分析技术具体步骤如下基因内含子13(CA)n二核苷酸重复序列多态性引物P1 5′-TGC ATC ACT GTA CATATG TAT CTT-3′，P2 5′-CCA AAT TAC ATA TGA ATA AGC C-3′；内含子22(GT)n(AG)n二核苷酸重复序列多态性引物P3 5′-TTC TAA GAA TGT AGT GTG TG-3′，P4 5′-TAATGC CCA CAT TAT AGA-3′。反应体系10×缓冲液2.5μl，4×dNTP(2.5mmol/L)2μl，引物P1和P2(50ng/μl)均为3μl，引物P3和P4(50ng/μl)均为4μl，Tag DNA聚合酶(1U/μl)1μl，样品DNA 1μl，ddH204.51μl补足总体积至25μl。使用PE2400DNA扩增仪，扩增条件如下94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃复性30秒，72℃延伸1分钟，40周期循环后，72℃延伸5分钟。
聚丙烯凝胶电泳配制含7mol/L尿素的120g/L聚丙烯凝胶，1×TBE电泳缓冲液，取8μl PCR产物，加入8μl变性缓冲液(950g/L去离子甲酰胺，0.1g/L溴酚蓝，0.1g/L二甲苯蓝，1mmol/LEDTA)，混匀，95℃变性5分钟，加样后400V稳压电泳2.5h。银染将凝胶置固定液(含体积分数为10％的乙醇、体积分数为0.5％的乙酸)中于摇床上固定15分钟，回收固定液，倒入银染液(0.012mol/L硝酸银)，于摇床上染色10分钟。弃去银染液，适量高纯水漂洗1分钟，弃去高纯水，再重复1次。加入显影液(0.0375mol/L，体积分数为0.4％的甲醛)显影至各条带清晰，弃去显影液。倒入终止液(即回收的固定液)终止反应。结果分析以pBR322/Msp I作为DNA标志，确定各产物的相对位置，其中13(CA)n位点的产物命名为An，22(GT)n(AG)n位点的产物命名为Bn，n与n+1之间相差2bp。采用Pems软件包处理数据，基因频率以直接法统计。HA家系通过对FVIII基因内这两个位点多态性的连锁分析而作出产前诊断。
③St14/VNTR分析技术具体步骤如下设计合成引物P1 5′-GGC ATG TCA TCA CTT CTC TCA TGT T-3′，P2 5′-CAC CAC TGCCCT CAC GTC ACT T-3′。
PCR反应总体积为20μl，含基因组DNA0.1μg，引物至0.5μmol/L，dNTP至100μmol/L，10mmol/L Tris-HCl，50mmol/LKCl，1.5mmol/L MgCl2，0.01％gelatin，Tag DNA聚合酶1U。应用PE公司9600型PCR仪，反应条件为94℃1分钟，60℃30秒，72℃2分钟，30周期循环后，72℃延伸7分钟，1％琼脂糖凝胶电泳(电压110V)1-1.5h后，EB染色，观察结果。根据不同的扩增片段长度进行连锁分析，判定携带者和患者。
说明LD-PCR所需deaza-dGTT购自Pharmacia Biotech公司，Bcl-I酶购自Promega公司，Taq酶为大连宝生物工程有限公司(Takara)产品。
权利要求
1.一种应用胎儿脐血阻断血友病A致病基因传递的方法，由以下步骤组成(1)样品制备选择有血友病A(HA)家族史的女性于妊娠20周后，在超声引导下经皮抽取胎儿脐带静脉血0.9ml或1.8ml，立即与O.1ml或0.2ml3.8％枸橼酸钠抗凝剂混匀，同时以相同方法和用量抽取携带者及其丈夫和正常人外周静脉血作对照；(2)离心将上述样品于4℃条件下，以2400～2500转/分钟离心20～25分钟，取上层1/3～2/3血浆进行凝血因子VIII活性(FVIIIC)和血管性血友病因子(vWF)血清学的生化测定；取白细胞层提取DNA进行PCR联合基因诊断；(3)筛选分型依据上述测定的血浆凝血因子VIII活性和血管性血友病因子浓度，确诊血友病A患者及其携带者，并根据血浆FVIIIC浓度将血友病A患者分为重型HA，其FVIIIC＜1％；中型HA，其FVIIIC1％～5％；轻型HA，其FVIIIC5％～25％、亚临床型HA，其FVIIIC25％～45％；(4)直接基因诊断应用长距离PCR(LD-PCR)技术对上述样品提取的DNA进行产前基因诊断，根据电泳条带的大小和分子量的大小综合判定患者是否存在FVIII基因内含子22倒位；若只出现12Kb带，判为野生型即非倒位；若只出现11Kb带，判为倒位患者；若出现12Kb和11Kb两条带，判为倒位的携带者；(5)阻断HA致病基因传递对于上述判为倒位的患者或判为倒位的携带者，应终止妊娠，切断HA致病基因的传递；(6)间接基因诊断对上述非倒位的重型HA、中型HA和轻型HA家系，依次采用Bcl-I PCR/RFLP分析技术、基因内含子13(CA)n及内含子22(GT)n(AG)n二核苷酸重复序列多态性分析技术及与FVIII基因紧密连锁的可变串联重复序列多态性分析技术(St14/VNTR)进行间接基因诊断；(7)阻断HA致病基因传递步骤(6)依次进行的各步基因诊断中，当样品判为HA患者或携带者时，终止妊娠，切断HA致病基因的传递；未作的诊断步骤停止。
2.如权利要求1所述的应用胎儿脐血阻断血友病A致病基因传递的方法，其特征在于，步骤(2)所述的凝血因子VIII活性测定采用Bigg’s一期法检测；所述的血管性血友病因子测定采用ELISA法或免疫比浊法检测。
3.如权利要求1所述的应用胎儿脐血阻断血友病A致病基因传递的方法，其特征在于，步骤(4)所述的应用长距离PCR技术中，设计合成的三对引物是P5′-GCC CTG CCT GTC CAT TAC ACT GAT GAC ATT ATG CTG AC-3′；Q5′-GGC CCT ACA ACC ATT CTG CCT TTC ACT TTC AGT GCA ATA-3′；B5′-CCC CAA ACT ATA ACC AGC ACC TTG AAC TTA CCC TCT-3′。
4.如权利要求1所述的应用胎儿脐血阻断血友病A致病基因传递的方法，其特征在于，步骤(6)所述的Bcl-I PCR/RFLP分析技术中，设计合成的Bcl-I RFLP引物是P15′-TTC ATT TCA GTG GAC ATG TG-3′，P25′-CCT ATG GGA TTT GAG ATG GT-3′。
5.如权利要求1所述的应用胎儿脐血阻断血友病A致病基因传递的方法，其特征在于，步骤(6)所述的基因内含子13(CA)n及内含子22(GT)n(AG)n二核苷酸重复序列多态性分析技术中，基因内含子13(CA)n二核苷酸重复序列多态性引物是P15′-TGC ATC ACT GTA CAT ATG TAT CTT-3′，P25′-CCA AAT TAC ATA TGA ATA AGC C-3′；内含子22(GT)n(AG)n二核苷酸重复序列多态性引物是P35′-TTC TAA GAA TGT AGT GTG TG-3′，P45′-TAA TGC CCA CAT TAT AGA-3′。
6.如权利要求1所述的应用胎儿脐血阻断血友病A致病基因传递的方法，其特征在于，步骤(6)所述的FVIII基因紧密连锁的可变串联重复序列多态性分析技术(St14/VNTR)中，设计合成的引物是P15′-GGC ATG TCA TCA CTT CTC TCA TGT T-3′，P25′-CAC CAC TGC CCT CAC GTC ACT T-3′。
7.如权利要求1或3所述的应用胎儿脐血阻断血友病A致病基因传递的方法，其特征在于，步骤(4)所述的长距离PCR技术中，PCR反应条件是94℃预变性1-2分钟，进入下列循环；94℃-98℃变性10-12秒，65-68℃复性和延伸10-15分钟，共30个循环，在后20个循环中，每一个循环在65-68℃的保温时间延长20秒。
8.如权利要求1或4所述的应用胎儿脐血阻断血友病A致病基因传递的方法，其特征在于，步骤(6)所述的Bcl-I PCR/RFLP分析技术中，扩增条件是94℃预变性2-5分钟，58-60℃，40-90秒，70-72℃，30-40秒，30周期循环后，72℃延伸5分钟。
9.如权利要求1或5所述的应用胎儿脐血阻断血友病A致病基因传递的方法，其特征在于，步骤(6)所述的基因内含子13(CA)n及内含子22(GT)n(AG)n二核苷酸重复序列多态性分析技术中，扩增条件是94℃预变性3-10分钟，94℃变性30秒，50℃复性30-50秒，72℃延伸40-60秒，35-40周期循环后，72℃延伸5-10分钟。
10.如权利要求1或6所述的应用胎儿脐血阻断血友病A致病基因传递的方法，其特征在于，步骤(6)所述的与FVIII基因紧密连锁的可变串联重复序列多态性分析技术中，扩增条件是94℃1分钟，60℃30秒，72℃2分钟，30周期循环后，72℃延伸7分钟。
全文摘要
本发明公开了一种应用胎儿脐血阻断血友病A致病基因传递的方法，其方法包括(1)样品制备，(2)离心，(3)筛选分型，(4)直接基因诊断，(5)阻断HA致病基因传递，(6)间接基因诊断，(7)阻断HA致病基因传递等步骤。本发明的方法具有采集标本方便，样品用量少，结果准确可靠，产前诊断率高的特点，能够有效地防止血友病A的误诊和漏诊，降低血友病A的发病率。
文档编号C12Q1/68GK1514024SQ03139010
公开日2004年7月21日 申请日期2003年8月19日 优先权日2003年8月19日
发明者丁培芳, 王勤友, 孙汶生, 申法奎, 王谢桐, 张雪芹, 滕彬 申请人:山东省血液中心