一种抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制性单克隆抗体及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制性单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体属于IgG1亚类抗体，由杂交瘤细胞株SZ?169产生；其中，杂交瘤细胞株SZ?169的保藏编号为CCTCC NO:C2016134。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述单克隆抗体能够特异性的结合人全长ADAMTS13和截短型的ADAMTS13?T7蛋白，且与截短型ADAMTS13?T7蛋白结合能力明显高于全长ADAMTS13蛋白；(2)本发明的单克隆抗体在变性条件下，能够明显抑制ADAMTS13水解VWF，并随着单克隆抗体浓度的增加而抑制作用增强；(3)本发明所述单克隆抗体能够有效应用于药物制备中，增加了药物的靶向性和特异性。CCTCC NO：C201613420160628
【专利说明】
一种抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制性单克隆抗体及其 应用
技术领域
[0001 ]本发明属于免疫学领域，涉及一种单克隆抗体，尤其涉及一种抗人血管性血友病 因子裂解酶的抑制性单克隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] 血管性血友病因子裂解蛋白酶（a disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type lmotif 13，ADAMTS13)是从血衆中纯化出来的一个金属蛋白 酶，隶属于金属蛋白酶超家族（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif s，ADAMTSs) QADAMTS13通过裂解VWF的Tyrl605-Metl606肽键，降低 其底物血管性血友病因子(von Willebrand factor，VWF)分子量，从而抑制血小板聚集和 微血管血栓形成。研究表明，ADAMTS13先天性或获得性缺陷，导致弥散性微血管性血栓，与 血检性血小板减少性紫療（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)的发病密切相 关。血检性血小板减少性紫療（thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)是一种急性 有潜在致死性的疾病，临床上以发热、血小板减少、溶血性贫血、神经系统症状和肾脏损害 五联征为主要表现。相反，VWF对ADAMTS13敏感性增加会导致血管性血友病(VWD)2A型的一 个亚型的发生，这与VWF不能与血小板膜糖蛋白lb结合相关。
[0003] ADAMTS13蛋白主要由9个结构功能域组成，从氨基端到羧基端依次为：信号肽、前 导肽、金属蛋白酶结构域、去整合素结构域、凝血酶敏感蛋白1(TSP1)第1基序、富半胱氨酸 区域、间隔区、凝血酶敏感蛋白1(TSP1)第2-8重复基序、补体结合区域(CUB)，其中末端两个 CUB结构域为ADAMTS13所特有。
[0004] ADAMTS13各结构的具体功能目前尚未完全阐明，因此，针对ADAMTS13的单克隆抗 体的研制将为ADAMTS13功能、血栓形成的机制研究以及TTP和2A型VWD新的治疗方法的研究 提供有力的研究工具。
【发明内容】
[0005] 解决的技术问题:为了弥补现有技术的不足，获得一种能够特异性抑制抗人血管 性血友病因子裂解酶功能的抗体，本发明提供了一种抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制 性单克隆抗体及其应用。
[0006] 技术方案:一种抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制性单克隆抗体，所述单克隆 抗体属于IgGl亚类抗体，由杂交瘤细胞株SZ-169产生;其中，杂交瘤细胞株SZ-169的保藏编 号为CCTCC N0:C2016134。
[0007] 所述杂交瘤细胞株SZ-169的制备方法如下：
[0008] (1)使用重组的截短型的人血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13)蛋白作为免疫 原，以常规方法免疫Balb/C小鼠；
[0009] (2)获取融合细胞生长克隆:从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细 胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方 法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆；
[0010] (3)应用ELISA法和Western免疫印迹法等生化和免疫学技术筛选和鉴定后，挑选 出具有高抗体分泌水平的杂交瘤细胞株SZ-169(1G11);
[0011] 上述杂交瘤细胞株SZ-169的制备方法中，使用截短型的人ADAMTS13蛋白作为免疫 原，常规三次免疫接种8周龄雌性Balb/c小鼠，每次间隔4周；用ELISA法检测被免疫动物血 清中单克隆抗体的存在和浓度;免疫完成后，选择产生足够高浓度抗血清的小鼠，分离动物 脾脏并制备脾细胞悬液；按照已知的杂交瘤技术（参见:K0hler and Milstein，Nature， 215:495-497，1975;K0hler et al，Immunology Today，4:72-76，1983)将所得到的小鼠脾 细胞与骨髓瘤细胞融合，制备可持续传代并分泌抗血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13单克 隆抗体的杂交瘤细胞系。
[0012] 所述杂交瘤细胞系的保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC);地址:湖北省武汉市武昌区武汉大学 保藏中心（武汉大学第一附属小学对面）；保藏日期2016年6月28日；保藏编号CCTCC N0: C2016134;分类命名：杂交瘤细胞株SZ-169( 1G11)。
[0013]采用上述杂交瘤细胞株SZ-169生产单克隆抗体的方法如下：
[0014] 方法一:在杂交瘤培养液中接种上述杂交瘤细胞，培养后培养液中分离纯化得所 需的特异性抗血管性血友病因子裂解酶的单克隆抗体；
[0015] 方法二:在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，动物腹水液中分离和纯化得所需的 特异性抗血管性血友病因子裂解酶的单克隆抗体。
[0016] 优选的，所述单克隆抗体能够与全长的重组人ADAMTS13和截短型的人ADAMTS13-T7特异性结合。
[0017] 本发明的单克隆抗体属于IgGl亚类抗体。ELISA检测结果显示，本发明的单克隆抗 体可与全长的重组人ADAMTS13和截短型的人ADAMTS13-T7特异性结合。另外，免疫印迹分析 显示，本发明的单克隆抗体能够与还原性的全长的重组人ADAMTS13特异性结合，且与还原 性的ADAMTS13在分子量为190KDa的蛋白结合。
[0018] 所述的单克隆抗体在抑制人血管性血友病因子裂解酶功能中的应用。
[0019] 所述的单克隆抗体在抑制人血管性血友病因子裂解酶水解特异性底物血管性血 友病因子中的应用。
[0020] 所述的单克隆抗体在制备血栓性血小板减少性紫癜药物中的应用。
[0021] 所述的单克隆抗体在制备血管性血友病药物中的应用。
[0022]优选的，所述单克隆抗体的应用浓度为0~200yg/mL时，随着浓度的增大，单克隆 抗体对ADAMTS13的抑制作用增强。
[0023]有益效果：（1)本发明所述单克隆抗体能够特异性的结合人全长ADAMTS13和截短 型的ADAMTS13-T7蛋白，且与截短型ADAMTS13-T7蛋白结合能力明显高于全长ADAMTS13蛋 白；（2)本发明的单克隆抗体在变性条件下，能够明显抑制ADAMTS13水解VWF，并随着单克隆 抗体浓度的增加而抑制作用增强；（3)本发明所述单克隆抗体能够有效应用于药物制备中， 增加了药物的靶向性和特异性。
【附图说明】
[0024] 图1是Western Blot鉴定分析纯化的重组的全长ADAMTS13和截短型ADAMTS13-T7 蛋白；
[0025] 图2是10%SDS-PAGE鉴定分析纯化的重组截短型ADAMTS13-T7蛋白的电泳图；
[0026] 图3是ELISA法检测单克隆抗体SZ-169与重组的全长ADAMTS13和截短型ADAMTS13- T7蛋白特异性结合反应图；
[0027] 图4是Western Blot免疫印迹法测定单克隆抗体SZ-169与重组的全长ADAMTS13特 异性结合图；
[0028]图5是静止条件(变性)单克隆抗体SZ-169对ADAMTS13水解VWF的影响的多聚体分 析图。
【具体实施方式】
[0029] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明 的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0030] 实施例1制备免疫原一重组人血管性血友病因子裂解酶截短型蛋白ADAMTS13-T7
[0031 ] (1.1)真核表达载体的转化扩增和定量
[0032] 将pSecTag-ADAMTS13-T7质粒转化入大肠杆菌Escherchia coli DH5a感受态中， 涂板后37°C过夜培养。挑取阳性克隆，37°C细菌摇床过夜扩增培养，4°C离心收集细菌后，用 质粒抽提试剂盒进行质粒抽提(按试剂盒说明书操作）。质粒经Hind III和Xho I双酶切进 行鉴定。
[0033] (1.2)pSecTag-ADAMTS13-T7 质粒转染 HeLa 细胞
[0034] HeLa细胞培养：HeLa细胞用含 10%小牛血清的DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium)培养。转染前24小时，将细胞接种于24细胞培养孔板中（1.0 X 105/mL)，至 60~80%融合。
[0035] 转染液制备:将pSecTag-ADAMTS13-T7质粒lyg稀释至100yL无血清DMEM培养基中， 加入3yL X-tremeGENE HP DNA转染试剂，混匀后室温放置20分钟。
[0036] 转染前准备:无血清DMEM漂洗细胞1次，每孔加入900yL无血清DMEM培养基。
[0037]转染:将待转染混合物缓缓加入待转染细胞中，混匀后37°C、5^^02温箱培养6h， 弃去无血清上清，换入含血清细胞培养基继续培养。
[0038]稳定转染细胞株筛选:转染细胞培养48h后消化分离，重新接种至35mm细胞培养皿 中（2X 103/mL)，换入细胞筛选液（含10%小牛血清01^1细胞培养基，加入40(^8/11^ Hygromycine B)进行阳性细胞克隆的筛选;待细胞大部分死亡脱落后（约7至10日后），重新 换入细胞筛选维持液(含10 %小牛血清DMEM细胞培养基，加入200yg/mL Hygromycine B)进 行维持筛选；筛选后待阳性细胞克隆长出，挑选单克隆扩大培养，即获得稳定表达重组 rADAMTSl3-T7蛋白的细胞株，并通过Western Blot方法筛选高表达细胞株保种冻存。
[0039] (1.3)HeLa稳转细胞株上清的收集、浓缩
[0040] 稳定表达重组截短型ADAMTS13-T7蛋白的细胞株用无血清DMEM细胞培养基驯化 后，再行大量扩增培养，收集无血清培养上清。所收集的上清立即经Amicon Ultra-15离心 超滤管100倍离心浓缩，分装后冻存于_80°C冰箱备用。
[0041 ] (1.4)重组 ADAMTS13-T7 蛋白 WesternBlot 鉴定
[0042]将浓缩后的培养上清进行5%SDS-PAGE电泳后，转膜，并行Western Blot鉴定。以 兔抗人ADAMTS13多抗及鼠抗His单抗作为一抗，HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠 IgG为二抗，ECL 显影剂化学发光法显影，胶片经清洗风干后，于凝胶成像仪下拍照，以Image J软件分析，结 果如图1所示。
[0043] (1.5)重组截短型ADAMTS13-T7蛋白纯化
[0044] 蛋白纯化缓冲液配制:按照说明书配制如下蛋白纯化缓冲液，
[0045]
[0046]
[0047]
[0048] 平衡Ni-NTA Agarose:将保存液中的Ni-NTA Agarose与保存液混勾，吸取4mL Ni_ NTA Agarose至15mL离心管中。500 Xg离心5min，小心弃上清。加入10倍体积NPI-10缓冲液 平衡Ni-NTA AgarosejOC) X g离心5min，小心弃上清。
[0049] 蛋白与Ni-NTA Agarose结合:将浓缩后培养上清与Ni-NTA Agarose混匀，4°C摇床 结合过夜。500 X g离心5min，小心收集上清待电泳。
[0050] Ni-NTA Agarose洗涤：加入10倍体积NPI-20缓冲液洗涤Ni-NTA Agarose，充分混 匀。500 X g离心5min，小心收集上清待电泳。重复洗涤一次。
[0051 ] 重组ADAMTS13-T7蛋白洗脱：加入1倍体积NPI-250缓冲液重悬洗涤后Ni-NTA Agarose，室温下充分混勾2min，使重组蛋白与Ni-NTA Agarose分离。500 X g离心5min，将上 清收集至编号的离心管中，置于冰上。重复洗脱6次。
[0052]纯化后蛋白定量:使用分光光度计对纯化后蛋白定量，用NPI-250缓冲液调零，测 定蛋白样品在280nm处的吸光度，推算纯化后蛋白浓度。
[0053] (1.6)透析去除咪唑：高浓度咪唑可能造成蛋白沉淀，因此，使用消毒后的PBS缓冲 液去除纯化蛋白中高浓度的咪唑，_80°C冻存蛋白备用。
[0054] (1.7)纯化后蛋白鉴定
[0055] 将结合后培养上清、洗涤后上清及洗脱液进行10%SDS-PAGE电泳，电泳后进行考 马斯亮蓝染色及Western Blot鉴定。以兔抗人ADAMTS13多抗及鼠抗His单抗作为一抗，HRP 标记的羊抗兔或羊抗鼠 IgG为二抗，ECL显影剂化学发光法显影，胶片经清洗风干后，于凝胶 成像仪下拍照，以ImageJ软件分析，结果如图2所示。
[0056]实施例2特异性抗血管性血友病因子裂解酶的单克隆抗体的制备
[0057] 应用常规免疫学方法和杂交瘤技术(K0hler and Milstein，Nature，215:495- 497,1975)制备本发明的单克隆抗体。
[0058]首先，以纯化的ADAMTS13-T7蛋白质免疫8周龄雌性Balb/c小鼠（上海科学院实验 动物中心），共免疫三次，每次间隔四周。前两次为背部皮下多点注射加腹腔注射，第三次为 经小鼠尾静脉注射加腹腔注射。
[0059] 待被免疫小鼠的血清抗体滴度达到足够高后，处死动物并分离脾脏细胞。应用标 准的单克隆抗体细胞融合技术，将被免疫Balb/c小鼠的脾脏细胞与小鼠的SP2/0骨髓瘤细 胞(法国巴黎输血中心杂交瘤实验室引进)进行细胞融合。在HAT培养基中选择培养融合细 胞，培养后取上清以ELISA法筛选出高水平分泌抗体的细胞株。用于进一步的扩大培养或冻 存。
[0060] 应用ELISA法和Western印迹法等生化和免疫学技术筛选和鉴定后，获得特异性抗 血管性血友病因子裂解酶的单克隆抗体，命名为SZ-169。
[0061] 为了大量制备单克隆抗体，选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷行小鼠腹 腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中（5X10 5/小鼠）。大约在接种一周后即有明 显的腹水产生，每只小鼠可收集5~10mL腹水。
[0062] 实施例3检测单克隆抗体的化学性质
[0063] (1)应用免疫双扩散方法测定证实，本发明的单抗SZ-169属于IgGl亚类。
[0064] (2)将单克隆抗体SZ-169接种于Balb/c小鼠腹腔产生腹水，经过BeaverBeadsTM Protein A/G Matrix抗体纯化磁珠纯化，经PBS透析，用紫外分光光度仪测定IgG含量，测知 每lmL腹水可纯化得到IgG 3-6mg。
[0065] (3)ELISA实验测定SZ-169的特异性:纯化后抗体利用ELISA方法检测效价。纯化的 ADAMTS13-T7蛋白和ADAMTS13全长蛋白用碳酸盐缓冲液配置成lyg/mL，100yl/孔包板，4°C 过夜；0.05 % Tween-roS洗涤2次后，2 % BSA-roST封闭过夜，同上洗涤后，每孔加100μ1纯化 的抗体（1:100，1:1000，1:5000，1:10000)，PBS为空白对照，以同期未免疫小鼠血清为阴性 对照，以免疫小鼠血清为阳性对照，37 °C孵育2h。同上洗涤4次，加 HRP-GAM-IgG(1: 5000稀 释）100μ1/孔，37°C孵育lh。同上洗涤6次，TMB显色100μ1/孔，室温8-10π?η，50μ1/孔3M硫酸 终止反应。酶标检测仪上读取0D450值（图3)。结果显示，纯化后的单克隆抗体SZ-169与截断 型ADAMTS13-T7蛋白结合能力明显高于全长ADAMTS13蛋白。
[0066] (4)Western blot免疫印迹法检测单克隆抗体识别的抗原蛋白：纯化的重组 ADAMTS13蛋白行8% SDS-PAGE电泳，在Bio-Rad系统转移至硝酸纤维酸上，用2 %BSA-roS封 闭过夜，次日用含0.05%Tween-roS洗涤后，加入纯化后的抗体（1:300稀释），室温孵育2h， 洗涤半小时后，加入二抗HRP-GAM-IgG(l:5000)，室温孵育lh，再次洗涤后ECL显色，压片观 察。阳性对照中加入免疫小鼠血清（1: 2000 )，阴性对照加入未免疫小鼠血清（1: 2000)(图 4)。结果表明，单克隆抗体SZ-169能与ADAMTS13结合，在190kDa处显带，同时阳性对照免疫 小鼠的血清也在该处显带，而阴性对照未免疫小鼠血清跟蛋白无反应，说明抗体与 ADAMTS13是特异性结合的。
[0067] 实施例4单克隆抗体对ADAMTS13水解VWF的影响：
[0068] rADAMTS13的预处理：5mM CaCl2,20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl和5mg/mL (w/v)BSA条件同时加入纯化的抗体(0，12 · 5，25，50，100，200yg/mL)37°C孵育lh，小鼠 IgG (mlg)作为阴性对照。
[0069] pVWF(血浆来源的纯化的VWF)的预变性：pVWF(终浓度为37.5U/mL)在1.5M尿素， 20mM Tris-HCl(pH 8.0)条件下37°C孵育2h。
[0070] 变性条件下ADAMTS13水解pVWF:将预变性的rVWF以1 : 10稀释与预处理的 rADAMTS13(终浓度为25nM)在20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl和5mg/mL(w/v)BSA条件 下37°C孵育1.5h，用EDTA(终浓度为20mM)终止反应。
[0071] 以SDS-琼脂糖电泳分析。取适量的反应混合物分别加入2 X多聚体电泳上样缓冲 液（10mM Tris，lmM EDTA，8M尿素，5%SDS，0.02%溴酚蓝，pH 8.0)，60°C加热30min，上样后 于4°C经1.3%SDS-琼脂糖凝胶垂直电泳3h(恒压90V)，电泳结束后直接将凝胶贴附于琼脂 糖凝胶支撑介质一GelBond Film上，风干后用5%脱脂奶粉室温封闭lh，然后加入HRP-VWF 兔抗人多抗(1:1000)孵育2h，经TBS-0.05 % Tween洗膜5次后，用ECL进行化学发光法显影。 [0072] 结果显示，单克隆抗体SZ-169,与ADAMTS13作用之后，与pVWF混合后37°C孵育2h 后，混合物处理后经琼脂糖多聚体分析显示，能随着抗体浓度的增加抑制ADAMTS13对VWF的 水解，同时小鼠 IgG(mlgG)对水解也无影响。
【主权项】
1. 一种抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制性单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆 抗体属于IgGl亚类抗体，由杂交瘤细胞株SZ-169产生;其中，杂交瘤细胞株SZ-169的保藏编 号为CCTCC N0:C2016134。2. 根据权利要求1所述的一种抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制性单克隆抗体，其 特征在于，所述单克隆抗体能够与全长的重组人ADAMTS13和截短型的人ADAMTS13-T7特异 性结合。3. 根据权利要求1所述的一种抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制性单克隆抗体，其 特征在于，所述单克隆抗体能够与还原性的全长的重组人ADAMTS13特异性结合。4. 权利要求1所述的单克隆抗体在抑制人血管性血友病因子裂解酶功能中的应用。5. 权利要求1所述的单克隆抗体在抑制人血管性血友病因子裂解酶水解特异性底物血 管性血友病因子中的应用。6. 权利要求1所述的单克隆抗体在制备血栓性血小板减少性紫癜药物中的应用。7. 权利要求1所述的单克隆抗体在制备血管性血友病药物中的应用。8. 根据权利要求4~7任一所述的应用，其特征在于，所述单克隆抗体的应用浓度为0~ 200yg/mL时，随着浓度的增大，单克隆抗体对ADAMTS13的抑制作用增强。
【文档编号】C07K16/40GK106008715SQ201610564881
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月18日
【发明人】马珍妮, 凌婧, 沈飞, 冯宇锋, 苏健, 阮长耿
【申请人】苏州大学附属第医院, 苏州大学附属第一医院