专利名称：身高相关基因的制作方法
人类性别间的身高差异主要是有两个因素引起的第一，由生物活性的生殖腺类固醇的性别二态性决定的激素因素；第二，Y特异性生长基因引起的基因因素，称为GCY(Tanner，et al.，1966；Smith，et al.，1985；Ogata & Matsuo，1992)。尽管广泛的基因作图在人的Y染色体上寻找这一基因(Ogata，et al.1995，Salo，et al.1995，Rousseaux-Prevoet，et al.1996，De Rosa，et al.1997)，它的精确定位依然未知。新的证据显示Y-染色体末端缺失的鉴定中使用不恰当的细胞遗传方法为阐明GCY-临界区带来了困难。为克服这些难题，发明人仅对de novo中间缺失的患者的Y染色体进行了GCY分析(Kirsch，et al.2000)。对末端缺失的病人，这一方法可以将GCY定位到特定的染色体区间，而无需排除X0-镶嵌现象和/或i(Yp)和idic(Yq11)染色体。
7个正常身高的成年男性，一个临界身高的男性，以及一个身材矮小的有大片段中间缺失的病人，对他们进行重叠中间缺失直接比对，确证GCY临界区在标记物DYZ3和DYS11之间。此区域约有1.6-1.7Mb的基因组DNA。为提高靠近着丝粒的所需区域的分辨率，发明人用我们的细菌人工染色体(BAC)/p1-衍生人工染色体(PAC)重叠群建立了另外的新的对染色体上此部分有特异性的STS标记物。用这些新的Y-染色体STSs的分子缺失分析可以将临界区限制在700kb的基因组区内。
较佳地，这些区域接近染色体上已鉴定区域的两旁被排除的区域。
较佳地，这些区域在SKY1和sK83间。它可以含有SKY1和sK83中的一个或两个区。较佳地，这些区域在Sky8和sK83间(最好包括Sky8和sK83中的一个或两个区)，或SKY1和SKY4间。
本发明提供Y染色体上DYZ3和DYS11间的一个分离出的区域，它含有GCY。较佳地，Y染色体是人的Y染色体。
较佳的区域在sY79和sY81间，最好接近Y染色体上被排除的区域但在此区域的外面较佳。
也提供GCY研究所用的引物。
本发明进一步提供分离的基因/假基因序列，它们影响了人类性别相关的身高差异。它们可以是一个或多个图中鉴定的一个或多个基因或假基因序列。
本发明进一步包括与GCY蛋白有相同功能的蛋白质，与GCY蛋白有大于65％的同源性，大于70％的同源性，大于75％的同源性，大于80％的同源性，大于85％的同源性，大于90％的同源性较佳，大于95％的同源性最佳。有GCY基因活性较佳，例如，当它在哺乳动物体内表达时，对雄性哺乳动物的身高有影响。
也提供了探测或扩增GCY区所用的引物。它们可以用本技术领域熟知的放射性或非放射性标记物及其应用方法标记和应用。这些方法包括PCR，Southern或Northern blotting。
实验证据将被详细描述并参考图例，其中表1是病人和他们的兄弟姐妹的成年身高的比较。
表2是新的Y染色体STSs的表。
表3是AZFc区家族变体的序列的PCR/限制性消化分析。
表4是物理图谱建立时鉴定的BAC和PAC克隆的汇总。
表5是对先天身材矮小的成年男性进行染色体微小缺失筛选所用的基因组引物的汇总。
表6是分离的外显子诱捕克隆的序列的汇总。
表7A是预测基因的引物对的汇总，7B是Adlican Y-拷贝(ADLY)特异性引物对的汇总，7C是ADLY RT-PCR引物序列的汇总。
表8是外显子诱捕克隆的RT-PCR引物序列。
表9a & b显示ADLX和ADLY间的外显子的同源性。
表10是GCY区的基因/假基因的序列差异性和同源性的汇总。
图1.人Y染色体长臂缺失作图上图是人Y染色体的图谱，其左边是Yp端粒，右边是Yq端粒。下面显示的是对身高正常或身材矮小的成年男性的Y-染色体的低分辨率的分析结果。沿着上图列出了95个Y-染色体STSs。除SKY3和SKY8(详细见表2)，所有其它STSs已有报道(Vollrath et al.，1992，Jones et al.，1994，Reijo et al.，1995)。空白区或灰色框表示标记物缺失或存在，未进行相关检测。星号表示各自断点区中不能被检测的标记物。所有以前公布的病人的资料被重新调查，用于初步分析的相同的DNA样品2被研究。(请注意，#293病人的中间缺失的最近端的和末梢的断点在随体II类序列内。)图2.人末梢Yq11.23的DAZ基因座内序列家族变体(SFV)分类A.人DAZ基因簇附近Y-染色体的概观和扩增子结构。每一扩增子均用特定的条带(A，B，D，E，X)表示。上面的箭头表示一个扩增子家族每一成员相对于其它成员的取向。条带X表示的扩增子来自1号染色体的一部分，它被转座到DAZ基因簇的末端并部分复制。
B.根据人Y染色体物理图谱选择的Y-特异性STSs和SFVs的精确定位。标记物sY157比较明显，经多重PCR分析，它可能只存在一个拷贝(详细见正文)。
C.对人DAZ基因簇序列内发生Y-染色体重排的患者进行的STS和SFV分析的汇总。灰色框表示标记物缺失或存在。
D.#1972病人基因组DNA中的SKY10和SKY12序列家族变体分类。检测在表3中有描述。沿着右侧列出了片段大小(bp表示)。产物通过3％NuSieve琼脂糖(3∶1)凝胶电泳分离，溴乙锭染色观察。
图3.人Y染色体长臂近着丝粒区的结构示意图A.图显示主要的前后串联重复区段的分布和序列同源性的大概结构。这些区域基本可以分成3种不同的区以5bp随体序列为标志的最近端区(G)，和1号染色体有高度同源性的中心区(O)，含X/Y同源序列的末稍区(B)。在此区域内的新确立和已确立的STS标记物的精确定位在下面阐明。底部边沿显示了用新的STS标记物构建的PAC/BAC重叠群。词头RP1，5各表示PAC克隆和RP11BAC克隆。
B.对身材矮小和身高正常的病人进行高分辨率STS作图鉴定得到的GCY临界区的定位。黑色框和白色框分别表示STS存在或缺失。条纹框显示断点所在的剂量未知的区域。
图4.GCY临界区的分子特征鉴定a.两个最严重的病人的缺失示意图。SKY1和sY83划定了它的界限，因为在Y0308克隆中发现一个不同的缺失(见图3)标志了SKY1是它的一个界限。也标出了AZFa区临近GCY区末端。b.有不同同源性的三个片段的结构划分。绿色表示含5bp重复序列的片段，橙色表示和染色体亚间隔1q43同源的片段，蓝色表示和Xp22同源的。c.来自GCY区基因组序列的已测序的BAC克隆的详细描述。d.作为外显子扩增基质的PAC克隆的精确定位。e.所有外显子诱捕克隆的定位。由于它很小且为单拷贝，外显子诱捕克隆etal内容物不能进行进一步的实验分析。f.所有计算机得到的数据的文件编制设为以下几个层次基因模型(取向；外显子/内含子结构)-明显的假基因(外显子/内含子结构；取向)-启动子。基因模型的取向可用颜色表示(红取向向着着丝粒；蓝取向向着端粒)。请注意被CITB-144J01，CITB-298B15和CITB-203M13覆盖的染色体区已在Sargent et al.1990中被透彻地研究。
图5.GCY区的基因/假基因和它们的功能祖先之间的同源性比较。标明Y-染色体拷贝的精确定位。实际结构基因的基因对特异同源性和亚染色体定位用蓝色表示。
图6.KIAA1470进化史。左边显示染色体运动。右上图竖的小条带显示1p36功能祖先的外显子/内含子结构。连续的退化事件使KIAA1470在1q43和Yq11上形成两个假基因。1q43和Yq11上的两个拷贝相互间有98％的核苷酸序列同源性，在KIAA1470基因家族的12个反转录子中是最高的。它们与主基因分别有77％和79％的同源性。
图7.X-和Y-特异的adlican基因/假基因结构特征比较。ADLX的编码基因用框表示。ADLY相应的假定外显子(也用框表示)经同源性探查确定。ADLY假定反转录单元的主要重排用黑色三角形显示。ADLX和ADLY的mRNA和ORF的大小也标明了。RT-PCR检测所用引物在它们各自的定位上显示。分隔线上下方相同的颜色表示对两个转录物均无选择性。仅在线的下方标出的RT-PCR引物是ADLY特异性的。
材料和方法GCY临界区的确定患者的筛选患者#293，JOLAR，#28，#63和#95的临床症状已有详细描述(Skare et al.1990.，Ma et al.1993.，Foresta et al.1998.，Kleiman et al.1999)。患者Y0308与Pryor et al.1997研究中的病例1符合。患者T.M.，#1947和#1972是患有先天不育的表型正常的男性。基因组样品从外周血白细胞中抽提(#28，#63，#95，Y0308，T.M.，#1947，#1972)或来自类淋巴母细胞(#293，JOLAR)。从正常男性和女性外周血白细胞中分离的DNA作为内部对照。
身高评估由于所有个体都有不同的人种起源，身高和各自的国家身高标准比较(表1)。患者的年龄范围较小。如果可能，应注意父母和兄弟姐妹间的成年身高比较。数据和身高标准偏差分数(SDS)在表1中汇总。为计算SDS，从相应国家身体生长调查中取平均成年身高和标准偏差。
PCR分析反应体系总体积50微升(75mM Tris/HCl pH9.0，20mM(NH4)2SO4，0.1％(w/v)Tween20，1.5mM MgCl2)含每种寡核苷酸引物1.0mM，100ng基因组DNA模板，5单位Taq DNA聚合酶(Eurogentec)，以及每种dNTP 1mM(MJ Research，Inc.)热循环如下95℃预变性5分钟后，样品进行30个循环，其中94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，最后72℃5分钟延伸。多重PCR操作见Henegaiu et al.1994，有微小改动。Alu-Alu PCR操作见Nelson et al.1991。小于1kb的扩增产物溶于3％NuSieve琼脂糖/1％SeaKem GTG琼脂糖(FMC)溶于1xTBE(0.089M Tris-borate/0.089M硼酸/20mM EDTA，pH8.0)。大于1kb的扩增产物及Alu-Alu-PCR产物的分离用溶于1xTBE的1.5％SeaKem GTG琼脂糖凝胶。
PCR引物Y-特异STSs，基因座和PCR条件之前已有描述(Vollrath et al.1992；Jones et al.1994；Reijo et al.1995)。新的Y-染色体STSs序列在表2中列出。Y-特异STSs称为SKY，它们或者衍生自YAC，BAC和PAC末端序列或来自用Alu引物的多种组合扩增的克隆内部序列。设计标记物SKY10，11，12和13的引物扩增基因组DAZ基因座中跨特殊限制性位点的片段(SKY10来自RP11-487K20(AC024067)，RP11-70G12(AC006983)，RP11-141N04(AC008272)，RP11-366C06(AC015973)，RP11-560I18(AC053522)，RP11-175B09(AL359453)，SKY11和SKY12来自RP11-245K04(AC007965)，RP11-100J21(AC017005)，RP11-506M09(AC016752)，RP11-589P14(AC025246)和SKY13来自RP11-100J21(AC017005)，RP11-589P14(AC025246)，RP11-823D08(AC073649)，RP11-251M08(AC010682)，RP11-978G18(AC073893))以探测“序列家族变体”(SFVs)。
PCR产物的限制性分析PCR产物溶解在琼脂糖凝胶上，切下适当的凝胶带，用GFXTMPCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Inc)根据操作步骤分离DNA。SKY5和SKY6的扩增片段分别用TaqI和BsmI消化。为探测SKY10，SKY11，SKY12和SKY13的SFVs，PCR产物用表3列出的限制性酶消化。
BAC/PAC/YAC末端片段测序进行末端测序的BAC/PAC克隆的DNA用Nucleobond PC100 Kit(Macherey-Nagel)纯化。末端片段用热测序酶荧光标记的引物循环测序试剂盒(Pharmacia)直接测序，并用Pharmacia A.L.F.express(Amersham Pharmacia Biotech)分析。YAC末端片段用Alu/载体-PCR合成，用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen)亚克隆到pCR2.1中。根据描述进行测序。
荧光原位杂交从初级血样或无限增殖细胞系中获得分裂中期分布。根据标准操作制备(Lichter & Cremer 1992)。粘粒DNA和质粒DNA经缺口平移法用生物素-16-dUTP(La Roche)标记。有中期分布的载玻片在70％乙醇中于4℃放置一周。将200-300纳克标记了的质粒或粘粒DNA，20-30微克人Cot-1 DNA(GIBCO BRL)和杂交缓冲液(50％甲醛，10％硫酸葡聚糖，2xSSC，pH7.0)混合，70℃变性5分钟，37℃预退火30分钟。载玻片在70％甲醛，2xSSC，pH7.0中于72℃变性2分钟(Ried etal.1992)。预退火的探针在增湿器内于37°杂交过夜。洗涤载玻片，用抗生素蛋白-连接的荧光素异硫氰酸盐(FITC)染色。信号用生物素标记的抗-抗生素蛋白后用抗生素蛋白-FITC染色放大。制造商在说明书中提供的所有的人的端粒(Oncor)应和探针相符。染色体用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚二氢氯化物(DAPI)复染。使用一个冷的带电核装置照相系统(Photometrics，Tucson AZ，USA)分别摄影。用Macintosh Quadra 900控制相机，用软件包Nu200 2.0(Photometrics)将图像合成为TIF格式。每一种荧光染料记录单独的灰色比例荧光图像。图像经扫描后，用Adobe Photoshop软件进一步处理。
寻找身高基因微小缺失筛选外显子扩增PAC克隆鸟枪法亚克隆到pSPL3B中。Y-染色体特异性PAC克隆的基因组DNA用Sau3AI部分消化。100纳克分离出的4-10Kb范围内的片段和100纳克经BamHI消化并脱去磷酸的pSPL3B连接。连接反应转化到大大过量的E.coli XI-1蓝色细胞(Stratagene)，每一份转化细胞在选择性培养基(青霉素)上倒平板。形成的菌落收集分离质粒DNA。
细胞培养和电穿孔。COS7细胞在加了10％灭活的小牛血清的DME培养基中增殖。用于转染的COS7细胞在第5和15代间，长到75％连生后胰蛋白酶消化，离心收集，用冰冷的Dulbecco氏PBS洗涤。4×109细胞在冷的0.7毫升Dulbecco氏PBS中重悬，在预冷的电穿孔小管中和15微升溶于0.1毫升Dulbecco氏PBS的DNA结合。冰上放置10分钟后，细胞轻轻重悬，在BioRad Gene Pulser2中电穿孔(1.2kV，25μf)，再放到冰上。10分钟后细胞转到含10毫升预温的，CO2预平衡的培养基的组织培养皿中(100毫米)。
RNA分离，RT-PCR和克隆。转染72小时后分离细胞质粒DNA(QIAGEN RNeasyKit)，第一链的合成操作根据制造商推荐的步骤，有小的改动5微克RNA加到含每种dNTP 10mM和2μM寡核苷酸SA2的溶液中。混合物于65℃加热5分钟后冰浴至少多一分钟。加入含10xPCR缓冲液(Perkin-Elmer Cetus)，25mM MgCl2，0.1M DTT和RNAsin(35单位/微升)的反应混合物后，逆转录反应在42℃进行2分钟。然后加入1微升SuperScript II RT(200单位/微升；Gibco BRL)，反应在42℃温育90分钟，50℃温育30分钟。完整cDNA合成反应及转换为双链DNA，用有限次的PCR扩增循环，100微升反应混合物体系如下1xPCR缓冲液(Perkin-ElmerCetus)，1.5mM MgCl2，200μM dNTPs，1μM SA2，1μM SD6和2.5单位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)。进行6次扩增循环，包括94℃1分钟，60℃1分钟和72℃5分钟。为消除空载和假阳性产物，反应中直接加入50单位BstXI(New EnglandBiolabs)，于55℃温育过夜。
用内部引物进行第二次PCR扩增时用上述10微升的消化物，100微升反应体系如下1xPCR缓冲液(Perkin-Elmer Cetus)，1.5mM MgCl2，200μM dNTPs，1μM(CAU)4-SD2，1μM(CUA)4-SA4和2.5单位Taq聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)。进行25次扩增循环，包括94℃1分钟，60℃1分钟和72℃3分钟。产物电泳分离，大于纯SD2/SA4 RT-PCR产物的片段根据制造商的操作步骤剪切并亚克隆到pAMP1中(CloneAmp pAMP1 System；Gibco BRL)。在大大过量的E.coli XL-2蓝色细胞(Stratagene)中进行连接反应，细胞倒在含X-Gal/IPTG的选择性培养基上培养。
候选外显子的鉴定。挑出所有白色菌落，转到有选择性培养基的384孔板，在37℃温育过夜。上面覆盖或没有覆盖带阳性电荷尼龙膜(Amersham)的24.5×24.5厘米培养板用一个384定位针转移装置在37℃温育过夜。收集培养板上长出的菌落制备质粒，尼龙膜上的菌落用于colony lifts检测。插入的质粒剪切，纯化，和含有以PAC克隆EcoRI消化物作为原基质的尼龙膜杂交。然后分离出突出的条带和colony lifts杂交以鉴定候选外显子。分离候选外显子用Sequitherm EXCEL II DNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)测序。序列被自动分析在ALFExpress DNA测序仪上读出。表6列出了分离的外显子诱捕克隆的序列。
外显子诱捕。来自Y-染色体特异PAC(P1衍生的人工染色体)克隆RP1-148J07，RP5-1160A12，RP1-301P22，RP4-532I07和RP1-114A11的DNA用Sau3AI部分消化，4-10Kb范围内的片段单独亚克隆到pSPL3B中。转化COS7细胞，72小时后用QIAGEN RNeasy试剂盒收集细胞质粒RNA。根据制造商推荐的操作进行cDNA合成(Gibco-BRL)。克隆位点两侧的引物用于鉴定比纯SD2/SA4 RT-PCR产物大的产物。这些片段被剪切，亚克隆(CloneAmp pAMP1 System；Gibco BRL)到pAMP1中，并测序。外显子诱捕克隆通过随机引发用32P-dCTP标记，作为Southern blots的杂交探针。杂交65℃下在标准杂交缓冲液(Singh & Jones 1984)放置16小时。洗涤65℃下，在0.1xSSC，0.1％SDS中洗三次，每次20分钟。
计算机基因预测。用NIX(http//menu.hgmp.mrc.ac.uk)和Rummage(http//gen100.imb-jena.de)软件包分析BCA克隆RP11-75F05，RP11-461H06，RP11-333E09，RP11-558M10，CITB-298B15和CITB-144J01的完整基因组序列和已知基因的同源性以及有效基因容量。将BAC序列递交到FirstEF(http//www.cshl.org/mzhanglab)得到计算机鉴定的启动子和第一个外显子。
逆转录的polyA+-RNAs和cDNA文库。向Clontech或Invitrogen购买16种胎儿和成年组织的polyA+-RNA。用QIAGEN Oligotex试剂盒分离来自3种骨肉瘤和1种骨髓成纤维细胞系的人polyA+-RNAs。第一链cDNA的合成根据描述(Rao et al.1997)进行操作。从Clontech或Stratagene获得14个cDNA文库。一个40个cDNA文库的集合由德国人类基因组计划研究中(RZPD)提供。若要求可得到完整的列表。
潜在的转录单元的鉴定。对外显子进行同源性比较和开放阅读框(ORF)分析后，设计RT-PCR扩增的引物。序列在表8中汇总。如果外显子诱捕克隆只有一个外显子，在半巢式PCR时两个外显子特异性引物和cDNA文库特异性引物结合。从预测的基因模型设计引物跨过外显子/内含子边界扩增。为提供转录的证据，用引物筛选一系列cDNA文库和polyA+-RNAs(见上)。若有同源扩增子共扩增的可能，引物应位于Y-特异性限制位点的两侧。
进化层分类。根据Li，1993确定GCY区的基因/假基因和它们的功能/非功能祖先之间的序列差异。从下列基因组序列中抽提所有假基因序列BAC克隆RP11-75F05(AC011293)的KIAA1470PY，BAC克隆RP11-498M14(AL445675)的KIAA1470P1，BAC克隆RP11-333E09(AC011302)的ADLY，BAC克隆CITB-144J01(AC004772)的ARSFP和RPS24P1，BAC克隆RP11-418N20(AC119620)的RPS24PX，BAC克隆RP11-461H06(AC012502)的ASSP6和BAC克隆GS1-536K07(AC004616)的ASSP4。所有其它基因的序列从公开的cDNAs获得，GenBank登录号是ADLX(AF245505)，ARSF(XM_035467)，RPS24(NM_033022)，ASS(X01630)，KIAA1470(AB040903)。THC604695PY未分析，因为只能得到它的一部分最末端外显子(含几乎全部的3’UTR)用于和X-染色体EST基因簇比较(AA662182和AA662138)。
结果中间缺失的作图我们研究了9个成年男性的DNA，他们患有先天不育症但其它都正常。这9个男性中，7个人的身高没有特别。一个患者，#293，身高157厘米，属于身材矮小(SDS-2.9)，另一个Y0308身高165.5厘米为临界身高，在美国正常身高标准(SDS-1.7)的第三个百分点。他的父母及兄弟姐妹的成年身高在正常范围内(表1)，他的兄弟比他高20.5厘米。和他的预计身高(178厘米)和预计身高范围(169-187厘米)相比可以认为他属于身材矮小。所有的男性都已单独被确证发生了Y-染色体大的de novo中间缺失。其中只有两个患者进行过早先的染色体研究。
在我们定位GCY基因座时，我们的注意力集中到Y染色体长臂的一部分，它被身材矮小的患者的中间缺失的区域所限定(图1)。最近，一张结合了758个有序的STSs和199个完整测序的BAC克隆的详细的人Y染色体物理图谱被构建出来(Tilford et al.2001)。我们采用了一个小小改动的PCR多重体系(Henegariu et al.1994)检测Y染色体长臂上是否存在28个DNA基因座。对可获得足够DNA进行进一步PCR分析的患者检测了额外的STSs。结果，9个中间缺失断点中的8个可以定位。由于有正常身高的患者JOLAR，#28，#63，#95，T.M.，#1947的缺失相互重叠，大部分Y染色体的长臂都可以排除是GCY的临界区。
由于患者#1972的缺失的末梢断点不在Y染色体长臂的特异性部分，缺失(末端或中间)的性质仍不明确。他的缺失和患者#1947及T.M.的确实也没有重叠。仅仅依靠基于STS的中间却是作图方法得到的结果，sY158末梢区并不能排除是潜在的GCY临界区。然而，多重PCR分析总显示出STS sY157(一种Y衍生的标记物，十分接近sY158)扩增产物浓度较低。针对这一问题，我们更详细研究了患者#1972的重排Y染色体。
荧光原位杂交和患者#1972的序列家族变体分类患者#1972的Y染色体的总的完整性通过粘粒LLOYNC03”M”34F05(PAR1)和LLOYNC03”M”49B02(PAR2)以及Y着丝粒特异性探针Y-97和端粒特异性探针“所有人的端粒”FISH展示出来(数据未显示)。注意到人DAZ基因座结构排布的复杂性(图2A)，我们特别寻找了序列家族变体(SFVs)。为防止将序列错误误当作单个核苷酸差异，对至少在两个重叠BAC克隆中存在的SFVs进行了PCR/限制性消化检测试验。这些SFVs的定位在图2B中显示。由于这些SFVs可以代表等位基因变体，十个无关的正常德国男性被测定类型。在所有情况下，期望的片段模式都可以在Y染色体衍生的序列中检测到。相反，从1号染色体衍生的BAC克隆RP11-560I18的基因组序列推出的片段模式不能被确证(详细见表3)。每种SFV-特异性PCR/限制性消化都可比作相应BAC克隆中的存在/缺失。
患者#1972基因组DNA进行全部四种序列家族变体(SKY10/Tsp509I，SKY11/NlaIII，SKY12/MseI和SKY13/Cac8I+TfiI)分类揭示了一个Y衍生的非等位基因序列变体的缺失(表3和图2C，D)。对于SKY10，末梢拷贝被删除。并不奇怪，在所有其它分类实验中，各SFVs较近端的拷贝都显示出被删除。下一步，我们研究了带有最末梢断点的两个患者的SFVs(#95和#1947)。用基因组DNA，我们测定SKY11，SKY12和SKY13的两个非等位基因变体以及SKY10的一个非等位基因变体在患者#1947体内缺失，而对所有被检测的SFVs，一个非等位基因变体在患者#95体内缺失。
综上，这些结果证明患者#1972的Y染色体中间缺失的近端断点在患者#1947的中间缺失中，由此排除了此基因组区是潜在GCY临界区的可能。
GCY临界区的精确定位基于对人Y染色体长臂两侧区的分子分析(Williams和Tyler-Smith 1997)，由标记物sY78(DYZ3)和sY83(DYS11)界定的GCY临界区物理范围估计包括1.6-1.7Mb(图3A)DNA。此区最近端400kb仅含有用Alu序列从Y染色体分离到的5bp随体序列。因此，此Y染色体恒定区不太可能有编码序列。GCY临界区的其余部分由X/Y同源区以及常染色体/Y同源序列区组成。此试验开始时，在YAC克隆中这个区域只能得到有限的覆盖度。为精确GCY临界区并产生基因寻找基质，必须建立此区域的BAC/PAC重叠群。
我们主要通过BAC，PAC和YAC克隆的末端片段以及用Alu-Alu寡核苷酸引物对的不同组合扩增的克隆内部序列测序建立了25个额外的标记物。其中，只有7个是Y特异性的(SKY1，SKY2和SKY4-8)(详细见表2)。在建物理图谱时鉴定的BAC和PAC克隆在表4中汇总。同时，其中的一些克隆被完整测序，因为它们形成了人Y染色体测序的瓦状路线的一部分(Tilford et al.2001)。克隆区标记物sY78和SKY6之间的近端部分尚未测序。覆盖整个GCY临界区的克隆的筛选在图3中描述。
BAC RP11-295P22和BAC RP11-322K23间重叠的确定是重叠群构建过程中最关键的步骤。我们怀疑两个克隆相对的末端片段衍生的Y特异性标记物从相同的5bp随体区内两个不同的基因座扩增了相同大小的片段。通过检测几个已知切割5bp随体中的(TGGAA)n共有序列的限制性酶，我们发展了基因座特异性PCR/限制性消化测试。用适当的PCR/限制向消化测试法将所有的BAC克隆分类到这个序列区可以将它们精确定位从而确定它们的重叠。
为缩小GCY基因的临界区，我们检测了新建立的STSs在患者#293，Y0308和JOLAR体内是否存在。这些结果可以将GCY基因限制在小范围内(图3和图4)。直接序列比较显示被测序的BAC克隆RP11-322K23，RP11-75F05，RP11-461H06，RP11-333E09，RP11-558M10，CITB-298B15和CITB-203M13完全覆盖了Y-STSsSKY8和sY83(DYS11)之间已作图的区域，提示它的大小约为700kb。此区基本可被分为三个明确的区间以5bp重复片段为标志的近端区，和1号染色体高度同源的中心区以及包括X/Y同源序列的末梢区。由于GCY临界区最末梢部分(以BAC克隆CITB-144J01 bp1为开始)在AZFa临界区鉴定过程中已进行过透彻的研究，结果显示其中没有功能基因，我们不再对其进行进一步的详细的基因组DNA分析。GCY临界区的最近端区仅含有随体3型的5bp共有序列(TGGAA)n，因此它也不太可能含有任何基因。排除这两个区域后，我们可以集中研究420kbDNA的小区域。用Advanced PipMaker软件进行的大规模序列比对结果显示没有Y特异性序列整合到1号染色体和/或X染色体同源区。
我们也已经建立了新的Y特异性标记物，能够均一地分散到整个420kb的DNA(表5)。
GCY临界区内外显子诱捕GCY区的边界通过两位患者JOLAR和Y0308得到确定(图3)。PAC克隆，RP1-148J07，延伸到仅包括随体3型的5bp重复序列的基因组片段。末梢PAC克隆，RP1-83D22部包括在试验分析内，因为sY82末梢区在确定AZFa区转录潜能的过程中已经被分析(Sargent et al.1999)。为鉴定可能编码GCY的转录子，我们用来自GCY区的5个PAC克隆作为基质进行外显子诱捕(RP1-148J07上至RP1-114A11，图4)。每一个来自GCY区的PAC克隆分别亚克隆进行外显子诱捕。对诱捕产物进行核苷酸测序鉴定出9个不同的外显子诱捕克隆，其中的两个含有两个外显子(图4，表6)。所有的外显子诱捕克隆分离出几个拷贝。所有11个假定外显子的外显子/内含子边界和结合位点共有序列匹配。定位到GCY区的诱捕产物用PCR检验在男性和女性以及身材矮小GCY缺失的男性体内是否存在。所有外显子诱捕克隆在Southern blots上仅有一个男性特异性片段显示出来。
计算机分析已确定的BAC克隆我们用NIX和Rummage软件包提供的基因预测程序分析了完整的GCY区的基因组序列。同时用BLASTN或FASTA运算法则分析了GenBank的非冗余(nr)数据库中的同源序列。例如，BAC RP11-75F05，包含一个和染色体1p36上的转录单元KIAA1470有77％同源性的1Kb片段(图5)。例如，在BAC RP11-461H06和CITB-144J01上，长2.5和1Kb的序列分别和染色体9q34，10q22上的基因ASS，RPS24有88％和81％同源性。Y染色体拷贝ASSP6和RPS24P1，代表假基因，在Xp22上有一个祖先，但已转座到Y染色体上。RP11-333E09和CITB-144J01上的两个假基因，THC604695PY和ARSFP，代表了Xp22特异性基因被删除的拷贝。
BAC RP11-333E09包括了染色体Xp22(ADLX)上的adlican基因的一个被剔除的复制(ADLY)。ADLX在骨关节炎组织中表现出上调，从而很可能在骨代谢中起重要作用。因此，Y染色体拷贝成为一个与生长有关的重要的候选基因。除了染色体内重组会导致外显子3和4的丢失，它的基本结构排布(图7)及与ADLX的序列同源性仍可以编码一个有小分子性质的功能性蛋白。这个现象由于所有基因寻找程序得到的相同的预测基因模型而变得更加可信(cf1；图4)。考虑到预测的ADLY启动子的功能以及猜测ADLY会在也在X染色体上使用的ATG密码子处起始，阅读框内+359处的终止密码会过早地终止转录。预测在ADLY最后一个内含子的正链上有一个额外的启动子。然而，启动子的位置和潜在ADLY表达的意义之间并没有明显关系。
应用不同的基因寻找程序，我们检测到在GCY区中有17个基因模型(Fig.4f)。仅有5个(ar1，cf1，cr1)和同源性查询鉴定出的转录单元有重叠。对14个模型的理论上的翻译没有找到匹配的蛋白质。考虑到定位和取向，RirstEF预测的启动子可能在KIAA1470P，ADLY，RPS24P1和ARSFP内。
总之，没有确定外显子诱捕克隆和基因模型/同源性或假基因KIAA1470PY，ASSP6和THC604695PY。ADLY被认为是最有价值的GCY候选基因座，我们直接比较Y和X衍生的拷贝的外显子/内含子的边界区(表9b)。ADLX的3和4外显子在Y拷贝上被剔除。余下的3个内部外显子仍有正确的5’和3’拼接位点。
寻找转录单元对所有外显子诱捕克隆进行同源搜寻，预测的基因模型违背GenBank的dbEST段且不产生任何Y特异性EST。用所有假定转录单元相应的引物进行PCR和PCR/限制性消化检测。由ADLY，最有可能的GCY候选基因座的所有外显子(表7B，7C)衍生得到的引物(表7B，7C)，用来筛选骨肉瘤和骨髓成纤维细胞系的逆转录polyA+-RNAs。结果显示ADLX在所有检测的细胞系中表达(除了神经元组织)，但没有检测到ADLY特异性转录产物。更大范围内的，对来自多种成年和胎儿组织的polyA+-RNAs进行筛选，得到的结果是相同的。我们也检测了来自21个组织和49个cDNA文库的polyA+-RNAs中GCY区的所有假定转录单元的表达情况。RP-PCR并没有检测到转录的基因。
GCY临界区的进化特性Y染色体和其它染色体区有高度同源性，这与那些区域向着Y染色体进化的近期的转座结果是一致的。更细微的差别是同源基因对的同义核苷酸差异(Ks)使它们能够被归入明确的进化层，1-4组(Lahn和Page 1999)。GCY区所有基因对的Ks值以及不同进化层的参考基因的Ks值在表6中列出。我们注意到，X-Y的分化约在3000-5000万年前开始，所有X-Y基因对的Ks值都可分到最近的进化层中(第4组)。这个分类与X染色体基因的实际功能状态是无关的。比较GCY区的Y拷贝和他们的功能祖先之间的Ks值，结果显示X染色体拷贝的消失发生在X-Y重组之前。更突出的是1号染色体和Y染色体基因对的Ks值之间的差异。KIAA1470P1/KIAA1470PY基因对的低Ks值指出了一次更近的向人Y染色体的转座(图5)。支持的证据来自灵长类动物的荧光原位免疫杂交，显示此事件发生在5-6百万年前(Wimmer et al. 2002)。比较KIAA1470PY和它位于1q36上的功能祖先得到的Ks值可以将根本的染色体内转座发生的时间定在15000-17000万年前。
非同义取代频率(Ka)是进化时间和选择性限制因素对编码的蛋白共同的作用，因此限制度可以用Ks/Ka表示(Li，1993)值大于1表示对两个同源物都存在限制因素，值小于1表示至少一个同源物上没有限制因素。所有测定的Ks/Ka值提示没有对Y拷贝的自然选择，因此突出了它们的假基因的地位。
我们搜寻了GenBank的nr数据库的同源性演变和GCY区的末梢边界来精确测定染色体雅趣1q43和Xp22上的同源区的物理范围。为鉴定高度保守的片段，我们用Advanced PipMaker(Schwartz et al.2000，http//bio.ces.psu.edu)比较相应的DNA。检查复合点阵可以鉴定在同源序列上缺失的GCY区上的那些部分。由于保守区内Y/1和Y/X的总同源性分别在94-97％和96-99％的范围内，假定的编码蛋白的外显子并不需要高于非编码区的平均百分数的同一性。点阵分析显示，所有新的序列在GCY区从它的常染色体及X染色体平衡区上分离出来后会聚集在Y染色体的GCY区上，它们仅属于重复起源。整个LINEs家族成员数量上的明显优势就可以证明这一点。
讨论自从存在Y染色体特异性生长基因这一课题被第一次提出后，人们作了很多努力来确定它的精确定位。尽管最初的研究把目标一致指向了Y染色体长臂上的一个普通的区域(Salo et al.1995)，后来的研究转向了两个非重叠临界区的鉴定(Rousseaux-Prevost et al.1996，Ogata et al.1995，De Rosa et al.1997)。FISH分析提出了最初的研究所用的患者有45，X0细胞和/或i(Yp)或idic(Yq11)染色体这一明确的证据，从而解决了这一明显的矛盾(Kirsch et al.2000)。两个遗传参数均影响一个特定个体的成年身高，由此可能预测此类病人是否丢失GCY。因此，对带有de novo中间缺失的病人的研究对GCY的定位问题更有针对性。
在区分特别是在着丝粒附近带有微小中间缺失的病人的过程中，愈加明确的是de novo中间缺失的病人是很少的。这促使我们扩大寻找带有大de novo中间缺失病人的范围，而不考虑他们的实际成年身高。我们检查了9个成年患者，其中的7个有正常身高。此外，我们能够展示重叠缺失，因此排除了GCY在Y特异性标记物DYS11和假常染色体区2(PAR2)之间。两个患者，#293和Y0308，带有的中间缺失将GCY临界区的大小限制在约700kb的DNA。因此，推测此区域在正常人体生长所需要的一个或多个基因内。
外显子扩增和GCY区的基因建模。
尽管更多的注意力已转移到Yq11上的多个精子缺乏(AZF)关键区域以及Y编码的睾丸特异的或普遍表达的基因，至今还未系统地找到GCY区的转录单元。我们已采用外显子扩增，同源性寻找，计算机基因预测来鉴定此区内的假定基因。这些信息提供了多种手段来检测参与调控人体纵向生长的基因。到现在为止，鉴定GCY基因的主要问题在于缺乏定位到人Y染色体内的这一部分的潜在转录单元。在本研究之前，仅有两个假基因，RPS24P1和ARSFP，在基因图谱上，它们是定位在GCY临界区内的(Sargent et al.1999)。
通过外显子扩增，我们分离了9个不同的外显子诱捕克隆，其中的两个有两个外显子组成。人类基因组计划对GCY区平行测序的结果帮助我们完成了GCY区内潜在转录单元的编录。在此区内没有Y特异性ESTs。用Nix和Rummage软件程序分析完整的BACs序列数据以预测序列内的潜在基因。我们已经鉴定了4个新的基因/假基因和17个基因模型。17个基因模型中，仅有5个与鉴定的基因/假基因有同源性。一个和ADLY(cf1)同源的基因模型经所有基因寻找程序一致预测。然而，多种基因寻找程序可能过高的估计了基因模型cf1的可能性。如存在于ADLY中的很大的外显子，被正确预测的可能性较小，但它们也最不可能被完全忽略。结果是，大外显子的存在使将实际的假基因当作功能性基因的可能增大了。尽管有正确的拼接位点，诱捕假定的ADLY转录单元的外显子的失败，可能是Y染色体序列的一个内在的性质。用于外显子诱捕实验(Reijo et al.1995)的Cosmid/P1克隆中AEFc片段的存在使得DAZ成为在这一位点上可能存在的八个基因家族中检测出的唯一基因。
出人意料的是我们没有发现在基因模型和外显子诱捕克隆中存在一致性。可能外显子的扩增依赖于基因组中功能性剪切位点的存在，而基因模型主要基于同步六元实验(一种能检测特定开放阅读框中六核苷酸序列出现几率的实验方法)。另一方面正确的剪切位点的预测就显得没那么重要，因为这样的信号传感器携带信息量较少而且往往被降解。因此外显子诱捕克隆并不是预测基因模型所必需的，尽管诱捕的外显子的一个片段含有75到200个核苷酸，是外显子能精确预测的长度。同样的，与一个明确的基因模型相关联的假定外显子并不一定代表真正的外显子。
由于外显子诱捕克隆和/或基因模型最后被证明是同一转录本的一部分或者并不代表任何基因，因而在GCY区域中最终的基因数可能要小一些。尽管在此区域中可能存在转录单元，但要找到核心区域仍比较复杂，因为GCY位点突变造成的表型很难精确定义。这就使预测基因表达谱变得很困难，特别是在基因功能未知的时候。人类生长是受多因素影响的，因此生长障碍比较常见。虽然至今已确定了至少9个生长控制基因，但是只有很少的导致疾病的突变存在于这些基因中。这些区域中转录单元的确定应采用突变研究方式，特别是在全长基因/假基因已被克隆之后。
虽然我们已广泛筛选了反转录polyA+-RNAs和cDNA文库，但还未检测到任何Y特异性的转录本。这就使我们对于所采用的方法是否合适提出疑问。为验证其可行性我们检验了在GenePage(http；//genome-www5.Stanford.edu)中对于骨骼发育至关重要的20个基因的表达模式。我们的筛选可以确定每个所选基因都有至少两个拷贝。这就验证了一个具有非常确定边界的以及/或表达模式有时间性的特殊基因的存在。
进化特性是否能作为研究GCY基因座的线索？我们采用两种方式进一步研究GCY核心区域的分子起源。首先我们通过与直接和功能祖先的比较确定GCY区域中基因/假基因的功能状态。所有基因对的Ks/Ka都为1到2，说明Y拷贝是假基因。这一结果将X-Y基因对划分为进化第4层，因为此层的基因都具有非常相似的进化历史。这一类中只有一个例外就是AMELX/Y，仍编码有功能的X拷贝和Y拷贝。通过与1p36上有功能的祖先相比较，KIAA1470的Y拷贝应归类于假基因。另外我们采用大范围序列比较来确定GCY区的亚区及其在Xp22和1q43中的同源区之间的潜在差异，但没有检测到保守的亚区或是新近插入GCY核心区域的小染色体片段。而且在同源染色体序列上同步进行的启动子预测也没有显示差别。此结果清楚地说明在GCY核心区域确实存在重排，并且有潜在的雄性特异性调节机制的基因。
表1 患者及其兄弟姐妹的成年身高比较
标准偏差分数(SDS)通过下式计算SDS＝(X-M)/SD，其中X是个体成年身高，M和SD是正常人群平均成年身高及正常人群±1标准偏差(M)母亲，(F))父亲，(S)姐妹，(B)兄弟，(NA)未得到表2 Y-染色体STSs左引物 右引物 产物SKY1 GGACATTTGGCTGCAGAGATTGGCAATGCACTCTCATCAT 255SKY2 TCAGGACAGACAGGCTGCTACCTGCCACTGAGCTCCTTAC ～1700SKY3 TTCTCCCTCATCTTCCAAGCGCTTCCATCCATTAGCAAGG 167SKY4 CCTTTCATTCCATTCTCTTCCA CGCACTTTATGGACTGCAA 111SKY5*CCCTCGTCCATTTCTTTTGACCTCGAATTTAATGGATTGC 202SKY6*TCAATGGATGCACAGTGTGGC TCCACTGAATTCCATTGCAC 328SKY7 GGGAGTGCAAAGGGAAAGATCTTTCCATGGGGTGACATTC 223SKY8 CCATTCATTCGAGTTCATTACG ATTGGAATGGAATCGGACAG 189SKY9 GGCCGATGGTCAAACTGTTAGAAACGGGCTCTGAAATTCT 531SKY10*ATAAGGGGCAGGTTTGTCACGCTACTTATTCAGTGTTAACTGACAC 329SKY11*AAAGTGGGTGAAGGACATGGTTTTTGTTTGTGGCAGGTG 469SKY12*TTGAGTCACTGGGGATAACTG TATGGCCCACAACACTTCA 216SKY13*GGCAGCCTAGAAAGTCTTGTTC CCCTTGGGATTTTGTCTGTT 198有*标记的标记物扩增来自一个以上的基因组基因座的DNA片段(详见PCR产物的限制性分析章节)。
染色体1衍生的BAC克隆RP11-560I18(AC053522)递交的序列经引物对SKY10扩增后在基因组片段中没有Tsp509I限制性位点。片段限制性分析，分别扩增自男性和女性的基因组DNA，含有1号染色体作为唯一人源染色体的体细胞杂交细胞系以及BAC RP11-560I18显示两个约180bp和约155bp的片段，说明在BAC克隆的完整序列中有一个序列错误。
表4 创建物理图谱过程中鉴定的BAC和PAC克隆汇总Y-STSs阳性BACs(RPCI11) 阳性PACs(RPCI1，3-5)sY83 未筛选 83D22sY82 未筛选 83D22，114A11，157G08，966C15GY8 未筛选 114A11，168E21，271D03，635F21，sY81 未筛选 301P22，1079J08，1078C20，1160A1214A3C*未筛选 148J07，1136A14，1160A12，1196I23sY79 75F05，79E14，102G24，322K23， 1149H11417D23，600D11，612E10，725I12，863I08，903M02，1125H21SKY1 376B16，544C11，544M21 56A05，85D24，958M03SKY2 79P12，295P22，376L20，828O24， 829H08886I11，910C06SKY4 75F05，322K23，612E10not screenedSKY5 174I24，271E18，295P22，588E18， not screened620J20，632F11，684H19，705O19SKY6 174I24，271E18，295P22，588E18， not screened620J20，632F11，684H19，705O19*14A3C是一个杂交探针在Tyler-Smith er al.1993中有描述，它检测到了一个3.5kb的Y-特异性HindIII一片段和一个另外的常染色体片段。
表5 对先天身材矮小的成年男性进行微小缺失筛选所用的基因组引物对
表6 分离的外显子诱捕克隆的序列外显子诱捕克隆
表7A 预测的基因的引物对
1预测产物大小(bp)；2潜在Y-衍生的转录拷贝用标出的限制性酶切割，未切割的潜在的X-衍生的转录物；3表示引物在含BAC(a，b，c或d)的预测的基因中的位置(从着丝粒列端粒)。
表7B Adlican Y拷贝的引物对
表7C ADLY的RT-PCR引物序列引物序列(5‘→3‘)在ADLY1中的位置 在ADLX中的位置 ADL外显子2正向引物AdlYEx1 GACTCCTGGCCTTGACTTGA44-63-- 1cf1 TCTCTGTGGTGCTGATCCTG184-203 184-203 2AdlYEx5 CAGCGAAGGAAAGCACATTT2177-2196-- 5C21 CTGTCCAGTCCTCAGGAAGC5089-51085620-56395cf1-4a ACAGCGGGCGCTATGAGT 5971-59886502-65196反向引物AdlYEx2 CAGGATCAGCACCACAGAGA203-184 203-184 2GCAAGAATCTGGGCTCTCAC914-895 1435-14165AdlYEx5 GGGTGTAATTTTCTCCCATTG 3103-3083-- 5cf1-4b CTGACGTCCGTCCTCTGC 6143-61266631-66146cf1-6453ATGGACAGTGATCCGGTTTC7158-71397649-763071ADLY指根据和功能性X-adlican同源性比较而预测的基因。
2外显子的计数是以X-拷贝的外显子/内含子排布为基础的。
请注意用cflfor/rev进行RT-PCR从adlican拷贝生成不同大小的产物cf1-4a/cf1-6453和C21/Cf1-4b扩增产物含有染色体特异性限制性位点(cf1-4a/cf1-6453Y-BamHI，X-PsyI；C21/cf1-4b；Y-NlaIII，X-SacI)。
表8 外显子诱捕克隆RT-PCR引物序列外显子诱捕克隆 正向引物 反向引物eta2 GCACCATTAGTGCGCTTGTGAGCATCAGGGGTGTCTTCTaTTACATAGAATGGTAACTCCTTTTGCeta3 bAACTCCTTTTGCACCTCGTGaGCTGATGCTCAGAGTGTGGAeta4bGATTGCTGGCTGTGTCACCaTTTAAAATTCCTTCTAAACTTTTTCCetc1 bCCCATTTCTGCTCAATTTTCAaGCTGAACATTATTTCTTATTCCAGAetc2 bAGAGGACTAGGATTCATGGGATTaTGAAATGGCAAACCTTTCAGAetc3bGGCAGAGACTCTCCTACATATTCetc4 TGGCCTATAAAGGGATCAATG GGTGCAGGAGGGTGATTAAGaGAAAGCCACCAAGAGTGGACetc5 bACCAATATCCAAGGGACATGAeta2的产物大小175bp，etc4产物大小166bp。
进行单个外显子诱捕克隆的半巢式PCR操作a外面的引物；b里面的引物表9a 外显子同源性比较
表9b 保守外显子的外显子/内含子边界区
表10 GCY区的基因/假基因及其同源物的序列变异
如果GCY区的基因在X染色体或1号染色体的衍生拷贝没有功能，Y-拷贝另外和它们的功能祖先比较。
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权利要求
1.Y染色体上SKY1和sY83之间的一个分离的区域，包含Y特异性生长基因GCY。
2.如权利要求1所述的分离的区域，大小约为700Kb。
3.如权利要求1或2所述的分离的区域，其中的Y染色体是人的染色体。
4.如权利要求1或3所述的分离的区域，在SKY8和sY83之间。
5.如权利要求1或3所述的分离的区域，在sY79和sY81之间。
6.一种分离的GCY蛋白，由Y染色体上SKY1和sY83之间的一个区域编码。
7.如权利要求6所述的分离的GCY蛋白，由SKY8和sY83之间的一个区域编码。
8.如权利要求7所述的分离的GCY蛋白，由sY79和sY81之间的一个区域编码。
9.如权利要求8所述的分离的GCY蛋白，是ADLY或其功能片段。
10.一种核酸引物，它具有选自于表2，5，6，7A，7B，7C或8中所列的核酸序列中的一个核酸序列。
11.一种研究GCY定位或鉴定和身高有关的GCY基因的方法，包括如权利要求10所述的引物的应用，以选择性扩增或检测核酸分子的某个区域。
12.一种和权利要求6-9的GCY蛋白有大于65％的同源性的分离的蛋白，它对人的性别相关身高差异有影响。
13.核酸分子的应用，包括Y染色体上标记物SKY8和sY83之间的分离的区域的至少一个部分，或其中的补充序列以鉴定和身高有关的GCY基因的存在或缺失。
全文摘要
本发明涉及Y染色体上分离的区域和基因，含有Y特异性生长基因GCY。同时提供探针和引物。
文档编号C12N15/09GK1649896SQ03809224
公开日2005年8月3日 申请日期2003年4月25日 优先权日2002年4月26日
发明者古德龙A·拉波尔德, 施特凡·基施 申请人:古德龙A·拉波尔德