专利名称：一种预示和鉴定鸡跖骨性状的分子标记方法
(一)、所属领域本发明属于动物分子遗传学领域，特别是涉及一种用分子标记检测鸡跖骨性状的方法。
(二)、背景技术背景技术 家禽育种工作在过去的几十年中依赖于表型的选择已经取得了令人瞩目的成绩，肉鸡的生长速度和肉产量得以明显提高。肉鸡业在世界范围内，尤其在中国等发展中国家具有良好的发展前景。然而，伴随着肉鸡的快速生长，其生理性不适症及相关疾病明显增加，如腿部疾病，腹水综合症，猝死症，鸡体免疫功能下降等，这些问题给肉鸡生产者造成的经济损失是显而易见的。因此，通过增强骨的强壮性、保持骨骼的恰当比例来解决鸡的腿部疾病已成为当前快大型肉鸡生产的一个重要目标。
骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因属于转化生长因子-beta(TGF-beta)超家族成员，该家族中的各个成员对机体的各器官、组织的生长和分化具有重要的调节作用。1965年，Urist首次将0.6M盐酸制备的脱钙骨基质植入鼠骨肌内，成功诱导异位骨形成，从而提出了骨诱导理论。1971年，Urist将这类诱导成骨物质定义为骨形态发生蛋白。迄今为止，已经报道了15种BMPs，而且数目仍在增加。
BMP-2是目前研究最广泛、诱导成骨活性最强的BMPs之一。1988年，人们首次分离纯化出天然BMP-2，这是一种分子量约为30KDs的碱性降解糖蛋白质，其降解产物的分子量分别为30、18、16KDs。其中30KDs的分子以二聚体形式存在，是天然BMP-2的主要形式。有研究认为，BMP-2主要对未分化间充质细胞和骨系细胞起到募集和分化作用。在骨形成早期，BMP-2不仅可使未分化间充质细胞向骨形成中心募集，并分化为骨系细胞，而且可使成纤维细胞、成肌细胞及骨髓的基细胞逆转分化为骨系细胞。对于成骨细胞，BMP-2可使之维持其特有细胞表型，并诱导成骨细胞标志物的增高，促进细胞外基质的钙化。在骨形成后期，BMP-2还作为一种破骨细胞分化因子与其它支持破骨细胞分化因子直接或间接刺激破骨细胞分化，参与骨的重建。
人的在体及离体实验均表明BMP-2具有诱导异位新骨形成的作用。BMP-2不仅可刺激骨组织来源的细胞株向成骨细胞系方向分化，还可以改变非骨组织来源的细胞株的分化方向，使其向成骨细胞系方向分化。此外，BMP-2在骨细胞分化过程中，具有增加其它BMPs基因表达的作用，在骨改建和塑形时期，BMP-2和其它BMPs一样，通过自分泌或旁分泌的方式刺激定向性和非定向性骨祖细胞的分化和新骨形成。
鸡的BMP-2基因CDS全长1179bp，与鸡的基因组比对结果显示该基因位于鸡的14号染色体上。H.Zhou等对鸡BMP-2基因的1000bp进行了多态性检测，但未发现多态。
(三)、发明内容本发明的主要目的是提供一种分子生物学技术，即采用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测鸡跖骨长度，从而预示和鉴定鸡跖骨性状的分子标记方法。
本发明的目的是这样实现的1、根据鸡BMP-2基因序列设计一对引物BMP2F25’-AGTCTTTCAGGTCTTGTTTGTC-3’BMP2R25’-CACTTGTTTCTGGCAGTTCTT-3’2、利用该引物对鸡的基因组DNA进行PCR扩增；3、使用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分离，检测出BMP-2基因内含子II中的12bp插入/缺失的变异位点；4、当鸡BMP-2基因内含子II缺失12bp时，PCR扩增片段长度为162bp，将其命名为EE基因型；当鸡BMP-2基因内含子II含有12bp插入时，PCR扩增片段长度为174bp，将其命名为FF基因型；该位点杂合的个体PCR扩增产物为两条带162bp和174bp，将其命名为EF基因型。
本发明还可以包括1、其中分析基因多态性的方法是通过检测碱基的插入/缺失而分类的基因型。
2、其中用于分析基因多态性的部位是内含子。
3、其中用于分析基因多态性的部位是由BMP2F2和BMP2R2表示的引物扩增的内含子及部分外显子区。
4、其中用于分析多态性的位点选自鸡BMP-2基因如下序列中第98位至第109位的12个碱基的插入/缺失。
1 AGTCTTTCAG GTCTTGTTTG TCGCATGCCA GCAGCACGTATCTGAGGGGT TTGGTTGCTT61 GTCTCAGTTC CTAACTITIT TTTCTCTCTC CCTCTGCTCCCTGCCCCCTT CCCTGCCCCC121 TTCCCTCCTG TTTAATCAAA TTAGAAGTTT TGGAAGAACTGCCAGAAACA AGTG5、其中鸡跖骨性状是鸡的跖骨长。
6、其中聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶浓度为12％或14％。
实验证明具有FF基因型鸡只的4、6、8、10周龄跖骨长均显著高于具有EE基因型鸡只的跖骨长(P＜0.05)，具有FF基因型鸡只的12周龄跖骨长显著高于具有EF基因型鸡只的跖骨长(P＜0.05)。
本发明巧妙地采用PCR扩增和凝胶分离的方法检测鸡BMP-2基因内含子中的12bp插入/缺失的变异位点。由于EE基因型和FF基因型的BMP-2基因片段长度仅差12个碱基，使用琼脂糖凝胶电泳很难将两种基因型分离，因此本发明采用12％或14％的聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离两种基因型。
本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。。使用本发明的标记基因型对鸡的跖骨长进行选择时，将使4、6、8、10和12周龄的跖骨长分别取得15.5％、10.8％、4.5％、10.4％和2.0％的遗传进展。利用本发明的分子标记方法对跖骨长进行选择，不仅为鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为鸡的跖骨性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段，可以加速鸡的育种进程。
附图是BMP-2基因12bp插入/缺失多态位点分析。
(五)、具体实施方案下面举例对本发明做更详细地描述一、实验材料1.实验动物和性状测定东北农业大学建立的以高脂肉鸡和白耳鸡为亲本杂交产生的F2资源群体(NEAUF2)，本研究选取5个家系，共计447只鸡。
F2代群体于4周龄开始至12周每隔2周测量其跖骨长、跖骨围；12周龄时翅静脉采血，草酸盐抗凝；称量活重之后屠宰，然后称量胫骨重、股骨重和跖爪重，测量胫骨长、股骨长等性状。。
2.药品和酶三羟甲基氨基甲烷(Tris)，Sigma Chemicals Co；Tris饱和酚，北京鼎国生物技术发展中心；蛋白酶K(Proteinase K)，MMERCK Co；DL 2000、dNTP(dATP；dTTP；dCTP；dGTP)、Taq酶，大连宝生物公司；琼脂糖(Agarose)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺，原平皓公司。
3.主要仪器PTC-200PCR仪(PERKIN ELMER)、Biometra梯度PCR仪、UVP多功能成像系统、Ultrospec 1000紫外分光光度计、BECKMAN冷冻离心机、Milli-Q超纯水仪、DYY-III2稳压电泳仪及配套电泳槽。
二、实验方法1.缓冲液与常用试剂的配制1M Tris Cl121.14g Tris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。
TE缓冲液10mM Tris·Cl，1mM EDTA，pH8.0，高压灭菌。
20×SET缓冲液3MNaCl，1M Tris Cl(pH8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，高压灭菌。
5×TBE缓冲液54g Tris碱，27.5g硼酸，20ml 0.5M EDTA(pH8.0)，加水至1L。
50×TAE缓冲液242g Tris碱，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5MEDTA(pH8.0)，加水至1L。
1M Tris Cl121.14g Tris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。
0.5M EDTA186.1g EDTA溶于800ml双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。
3M NaAc(pH5.2)408.1g NaAe 3H2O溶于800ml双蒸水中，用冰乙酸调pH至7.0，定容至1000ml。
200ml银染液NH3·H2O 2ml；3.6％NaOH 4.2ml；20％AgNO33.6ml，加去离子水至200ml。
200ml显色液1％柠檬酸钠1ml；甲醛100ul；加去离子水至200ml。
禽血裂解液10mM Tris·Cl(pH8.0)，0.1M EDTA(pH8.0)，0.5％SDS。
2.引物的设计与合成以下引物由上海博亚生物公司合成BMP2F25’-AGTCTTTCAGGTCTTGTTTGTC-3’BMP2R25’-CACTTGTTTCTGGCAGTTCTT-3’3.鸡基因组DNA的小量提取方法一(1)取20μl抗凝血液，加入500μl禽裂解液，加入蛋白酶K至终浓度为100-200μg/ml，混匀55℃消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的团块。
(2)将溶液冷却至室温，加入5M NaCl至终浓度1.5M，混匀10min。加入等体积酚/氯仿，反复颠倒离心管混匀10min。□(3)12,000rpm，室温离心10min。取上清，加等体积氯仿混匀10min。□(4)12,000rpm，室温离心10min。取上清2倍体积无水乙醇沉淀DNA。□(5)将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。□(6)7,500rpm，室温离心5min，弃上清。
(7)将DNA干燥后(注意不能太干)溶于200μl TE中。
方法二(1)将20μl全血加入装有700μl 1×SET的1.5ml离心管中，轻轻混匀。
(2)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度100-200μg/μl和10％的SDS至终浓度0.5％，55℃消化12h。
(3)待消化完全后，加入等体积的Tris饱和酚，来回颠倒，使其混匀(4)12,000rpm离心10min，用剪去尖端的吸头将上层水相小心移入另一个离心管中，弃去有机相。重复第三和第四步骤一次。
(5)向水相中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液(体积比为24∶23∶1)，混合10min。12,000rpm.，离心10min，移出水相到另一个离心管。
(6)向水相中加入等体积的氯仿、异戊醇混合液(23∶1)，来回颠倒混合10min，12,000rpm，离心10min，移出水相到另一个离心管。
(7)向水相中加入1/10体积NaAc(3M，pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，来回颠倒，沉淀DNA。
(8)将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。
(9)7,500rpm离心5min。小心倒掉管中乙醇，将倒置在滤纸上，让乙醇流尽，置于空气中干燥。
(10)加入200μl的TE，置50℃水浴中过夜溶解DNA。溶解后贮存于-20℃备用。
4.PCR反应(1)以鸡DNA为模板进行PCR扩增，25ul反应体系中包含以下溶液或试剂10×PCR reaction buffer2.5μldNTP Mixture(各2.5mM) 2.0μl引物1(10μM) 0.5μl引物2(10μM) 0.5μlEX-Taq(5U/μl) 0.25μl去离子水 18.25μl基因组DNA(50ng/μl)1.0μl(2)将上述溶液混合并按以下条件进行PCR反应。
94℃变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，32个循环；72℃延伸10min。
(3)反应结束后，取PCR反应液(5～10μl)进行琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物。
5.非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳以浓度为14％、体积为25ml，厚度为0.1cm的胶为例。
(1)清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用0.8％琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙。
(2)在100ml烧杯内加入30％丙烯酰胺11.7ml，50％甘油2.5ml，5×TBE 5ml，10％过硫酸铵0.175ml，TEMED8μl，去离子水5.617ml，混匀后迅速灌胶。
(3)当浇灌至离玻璃板上沿0.1cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚和半小时，多余的丙烯酰胺4℃保存。随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺。
(4)凝胶聚合好后，向电泳槽加入1×TBE，用注射器冲洗加样孔。
(5)预电泳10min，同时准备点样。
(6)取2μl PCR产物置于PCR管中，加2μl上样Buffer混匀，用微量注射器点样。
(7)120伏，电泳8-10h。
6.硝酸银染色方法(1)电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于70％乙醇中，水浴震荡器缓慢摇匀固定10-15min。(乙醇用完可以回收)。
(2)双蒸水洗胶2遍，每次2min，去除残留乙醇。
(3)用200ml染色液染色30min。
(4)双蒸水洗胶3遍，每次2min。
(5)用200ml显色液显色，约10-30min，当DNA带的强度合适时，倒掉显色液。
(6)去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存。
7.统计模型建立根据NEAUF2资源群体的特点，构建统计模型如下Y＝μ+G+S+H+F+D(F)+G*S+G*H+S*H+G*S*H+BW+e①Y＝μ+a+G+S+H+BW+e□Y为性状观察值，μ为群体均值，a为剩余多基因效应，G为基因型固定效应，S为性别固定效应，H为孵化批次固定效应，F为家系随机效应，D(F)为母鸡与家系嵌套的随机效应，G*S为基因型与性别的互作效应，G*H为基因型与孵化批次的互作效应，S*H为性别与孵化批次的互作效应，G*S*H为基因型、性别、孵化批次的互作效应，BW为周龄体重，e为剩余值。对于模型①使用统计软件JMP4(SAS Institute Inc.，Cary，NC)检验基因型与性状间的相关程度，并估计性状的最小二乘均值。对于模型②使用统计软件MTDFREML估计基因型对性状的遗传和表型贡献率。
实施例、鸡BMP2基因的多态性与NEAUF2资源群体周龄跖骨长的相关利用本发明的引物(BMP2F2和BMP2R2)对NEAUF2资源群体447个个体的基因组DNA进行PCR扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。在NEAUF2资源群体中共检测到3种基因型，对于PCR扩增片段长度为162bp的个体，将其命名为EE基因型；对于PCR扩增片段长度为174bp的个体，将其命名为FF基因型；对于PCR扩增产物为两条带(162bp和174bp)的个体，将其命名为EF基因型(附图)。
对BMP2基因12bp插入/缺失的变异位点的3种基因型与NEAUF2资源群体447个个体的周龄跖骨长进行最小二乘分析，结果表明基因型对F2资源群体的周龄跖骨长有显著影响(P＜0.05)(表1)。
表1 NEAUF2资源群体周龄跖骨长的最小二乘分析结果(P值)性状P值4周龄跖骨长0.00276周龄跖骨长0.02058周龄跖骨长0.042110周龄跖骨长 0.014412周龄跖骨长 0.0866对3种基因型间NEAUF2资源群体周龄跖骨长的最小二乘均值进行多重比较，结果表明具有FF基因型鸡只的4、6、8、10周龄跖骨长均显著高于具有EE基因型鸡只的跖骨长(P＜0.05)，具有FF基因型鸡只的12周龄跖骨长显著高于具有EF基因型鸡只的跖骨长(P＜0.05)。(表2)；表2 BMP2基因不同基因型对NEAUF2资源群体鸡只周龄跖骨长的影响性状 EE EF FF4周跖骨长最小二乘均值(厘米)5.654±0.039b5.736±0.031a5.778±0.034a6周跖骨长最小二乘均值(厘米)7.014±0.045b7.051±0.035b7.127±0.039a8周跖骨长最小二乘均值(厘米)8.204±0.054b8.320±0.041a8.311±0.046a10周跖骨长最小二乘均值(厘米) 9.189±0.053b9.299±0.037a9.358±0.044a12周跖骨长最小二乘均值(厘米) 9.809±0.057ab9.820±0.039b9.913±0.046a均值比较时同一行无相同字母者差异显著(a-bp＜0.05)表3列出基因型对NEAUF2资源群体鸡只跖骨长的遗传贡献率和表型贡献率。BMP-2基因的变异位点对NEAUF2群体各周龄跖骨长的遗传贡献率都较大，尤其是对4周龄跖骨长的遗传贡献率达到15.5％。因此推测用该基因对跖骨长进行标记辅助选择，会获得较大的遗传进展。
表3 BMP-2基因对NEAUF2群体鸡跖骨长的遗传和表型贡献率性状遗传贡献率(％)表型贡献率(％)4周龄跖骨长15.5 2.96周龄跖骨长10.8 1.98周龄跖骨长4.51.610周龄跖骨长 10.4 2.112周龄跖骨长 2.00.9
权利要求
1.一种预示和鉴定鸡跖骨性状的分子标记方法，其特征是(1)、根据鸡BMP-2基因序列设计一对引物BMP2F25’-AGTCTTTCAGGTCTTGTTTGTC-3’BMP2R25’-CACTTGTTTCTGGCAGTTCTT-3’；(2)、利用该引物对鸡的基因组DNA进行PCR扩增；(3)、使用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分离，检测出BMP-2基因内含子中的12bp插入/缺失的变异位点；(4)、多态性分析当鸡BMP-2基因内含子缺失12bp时，PCR扩增片段长度为162bp，将其命名为EE基因型；当鸡BMP-2基因内含子含有12bp插入时，PCR扩增片段长度为174bp，将其命名为FF基因型；该位点杂合的个体PCR扩增产物为两条带162bp和174bp，将其命名为EF基因型。
2.根据权利要求1所述的预示和鉴定鸡跖骨性状的分子标记方法，其特征是其中分析基因多态性的方法是通过检测碱基的插入/缺失而分类的基因型。
3.根据权利要求2所述的预示和鉴定鸡跖骨性状的分子标记方法，其特征是其中用于分析基因多态性的部位是内含子。
4.根据权利要求3所述的预示和鉴定鸡跖骨性状的分子标记方法，其特征是其中用于分析基因多态性的部位是由BMP2F2和BMP2R2表示的引物扩增的内含子及部分外显子区。
5.根据权利要求4所述的预示和鉴定鸡跖骨性状的分子标记方法，其特征是其中用于分析多态性的位点选自鸡BMP-2基因如下序列中第98位至第109位的12个碱基的插入/缺失。1 AGTCTTTCAG GTCTTGTTTG TCGCATGCCA GCAGCACGTATCTGAGGGGT TTGGTTGCTT61GTCTCAGTTC CTAACTTTTT TTTCTCTCTC CCTCTGCTCCCTGCCCCCTT CCCTGCCCCC121 TTCCCTCCTG TTTAATCAAA TTAGAAGTTT TGGAAGAACTGCCAGAAACA AGTG
6.根据权利要求1-5任何一项所述的预示和鉴定鸡跖骨性状的分子标记方法，其特征是其中鸡跖骨性状是鸡的跖骨长。
7.根据权利要求1-5任何一项所述的预示和鉴定鸡跖骨性状的分子标记方法，其特征是其中用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶浓度为12％或14％。
8.根据权利要求6所述的预示和鉴定鸡跖骨性状的分子标记方法，其特征是其中用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶浓度为12％或14％。
全文摘要
本发明提供的是一种预示和鉴定鸡跖骨性状的分子标记方法。根据鸡BMP－2基因序列设计一对引物BMP2F2和BMP2R2；利用该引物对鸡的基因组DNA进行PCR扩增，然后使用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分离，检测出BMP－2基因内含子中的12bp插入/缺失的变异位点；分别对鸡BMP2基因内含子缺失12bp、含有12bp插入及该位点杂合时进行命名。结果表明具有FF基因型鸡只的4、6、8、10周龄跖骨长均显著高于具有EE基因型鸡只的跖骨长(P＜0.05)，具有FF基因型鸡只的12周龄跖骨长显著高于具有EF基因型鸡只的跖骨长(P＜0.05)。本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。利用本发明的分子标记方法对鸡跖骨性状进行选择，不仅为鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为鸡的跖骨性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段，可以加速鸡的育种进程。
文档编号C12P19/34GK1721551SQ20051001012
公开日2006年1月18日 申请日期2005年6月29日 优先权日2005年6月29日
发明者李辉, 冷丽 申请人:东北农业大学