专利名称：一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系及其建立方法
技术领域：
本发明涉及生物转基因技术，特别涉及一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系及其建立方法。
背景技术：
超甜玉米属甜质玉米(Zea mays L.Sacchara sturt)，享有蔬菜、水果玉米之称，已经成为当今世界重要的栽培作物，全世界甜玉米年种植面积达120多万公顷，鲜苞及其制品是美、日、西欧以及东南亚一些国家和地区的重要消费食品之一。华南地区是我国超甜玉米主产区，超甜玉米已成为广东的特色和优势作物。但玉米螟对超甜玉米危害极为严重，导致产量和品质下降，施用农药会造成环境污染、生态平衡破坏、种植成本增加。目前生产上利用的超甜玉米品种均表现抗性不强，特别是甜度高、食味好的优质品种抗虫能力更差。因此，培育抗虫的超甜玉米自交系或品种是当前育种的重要方向，对推动超甜玉米研究和发展具有积极的作用。超甜玉米抗虫种质资源相对贫乏，本身缺少有效的抗虫基因资源，难以通过常规育种方法在短期内获得抗性品种。植物转基因技术可以利用包括微生物、动物和植物等生物的所有基因资源，实现将多个基因同时转入一种作物中，育种周期短、效率高，是农作物高效抗虫育种的崭新途径。
近年来，玉米(Zea mays L.)作为转基因技术主要的研究对象一直受到人们的广泛关注。早期应用PEG和电击法，以原生质体细胞作为转化受体，没有获得可育的转基因植株，原生质体分化再生植株既费时又很大程度上依赖于基因型，直到1990年才获得可育的转基因玉米。目前利用多种转化方法已将30多种基因导入玉米。基因枪在玉米遗传转化中得到了广泛的应用，已经成为玉米基因转化的主要方法之一。Ishida等利用农杆菌介导法获得了转基因玉米植株，转化效率高达30％，成为玉米遗传转化研究的一个里程碑。子房注射法也成功地将B.T.基因转入玉米。目前主要涉及的性状有抗玉米螟、抗除草剂、改良玉米蛋白质、雄性不育、耐盐性、抗寒性、抗病、抗玉米粗缩病毒以及利用转基因玉米生产抗生物素蛋白和以玉米为载体生产动物和人类用的疫苗。全世界已经有17种转基因玉米被正式批准投入商品化。但目前玉米转基因表现出转化频率低，重复性差，随机性大，品种基因型依赖性强等问题。虽然玉米组织培养技术已取得了很好的突破，幼胚、幼胚诱导的愈伤组织、分生组织等受体材料被作为基因瞬时表达和稳定转化的外植体。但不同的基因型在离体培养时再生能力差异很大始终制约着转基因研究。目前，选取材料都集中在少数几个基因型上，如A188、B73及其衍生系，而这些基因型在生产上应用很有限，基因型是玉米转化频率低的最大限制因素。我国玉米转基因研究与国际先进水平存在明显差距，处于实验室阶段，还没有商品化的品种，而其他类型玉米基因转化至今研究还很少。超甜玉米胚乳糖分含量高，胚生活力弱，其组织培养和转基因研究难度较大，柯遐义等曾用电激法将B.t.基因转化超甜玉米幼胚，但未见详细检测和深入研究。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系的建立方法，该方法提高超甜玉米细胞转化再生率，并可获得转基因高效的再生体系。
本发明的另一目的在于提供由上述方法所建立的抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系。
本发明的首要目的通过下述技术方案实现一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系的建立方法，其步骤如下(1)超甜玉米愈伤组织的诱导取授粉生长9～11天的超甜玉米果穗，未成熟种子的幼胚长度为1.0～2.0mm，剥除果穗外苞叶，幼穗用70～75％酒精表面消毒，无菌水漂洗1～2次，再用15～20％(v/v)次氯酸钠溶液或10～15g/L次氯酸钙溶液浸泡20～25分钟后，无菌水冲洗3～4次；无菌条件下挑出幼胚，接种于诱导培养基，25～27℃暗培养诱导愈伤组织。
(2)胚性愈伤组织的建立上述幼胚在诱导培养基上生长3～4周，挑取胚性愈伤组织作转化受体或转接于继代培养基上继代培养，每3～4周转移1次。
(3)胚性愈伤组织细胞的基因枪转化用基因枪轰击胚性愈伤组织细胞前4～6小时，选取胚性愈伤组织转移到含高渗培养基的培养皿中；将DNA微弹(包裹质粒DNA的金粉微粒)装载到载片上就绪，将胚性愈伤组织置于基因枪的样品室进行基因枪转化。
(4)转化后愈伤组织的培养与筛选轰击后的胚性愈伤组织继续在原高渗培养基上培养16～18小时，然后转移到继代培养基上在25～27℃黑暗条件下恢复培养；将恢复培养后的胚性愈伤组织转移到选择培养基上进行筛选，每2～3周转移1次，挑选生长良好的抗性愈伤组织进行下一轮筛选。
(5)植株分化再生与移栽在26℃，每日至少16小时光照条件下，将生长良好的抗性愈伤组织转入分化培养基诱导胚状体，当出现绿芽后转入不含激素的分化培养基上生长，诱导出小苗后再转入生根壮苗培养基产生根系，当发育成5～8cm高的完整小苗后经练苗，选择生长健壮的植株移栽到基质为栽培花卉的有机土中，保湿；2周左右后将植株移栽到田间。
所述超甜玉米包括超甜玉米自交系1132或单交种粤甜3号(均来自广东省农科院作物研究所)。
步骤(2)中挑取的胚性愈伤组织为色泽淡黄、致密、颗粒状、干燥的胚性愈伤组织。步骤(3)中选取的胚性愈伤组织为生长发育旺盛、色泽良好并已夹碎至2～3mm的胚性愈伤组织。
步骤(3)中DNA微弹按下述方法制备取4℃保存的60mg/ml金粉悬浮液100μl，依次加入1μg/μl质粒DNA 20μl，2.5mol/L的CaCl2100μl，0.1mol/L的亚精胺(spermidine)40μl，振荡5分钟，室温(25℃～28℃)静置10分钟，使质粒DNA沉淀到金粉微粒载体上，12000rpm离心5秒，弃上清，加260μl 70％乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5秒，弃上清，加260μl无水乙醇悬浮沉淀，12000rpm离心5秒，弃上清，加120μl无水乙醇重悬沉淀，每枪取10μl制备好的DNA金粉悬浮液至微弹载片上，晾干。
其中上述质粒DNA包括携带苏云金杆菌杀虫蛋白的质粒表达载体、携带马铃薯蛋白酶抑制剂基因的质粒表达载体、携带核糖体失活蛋白的质粒表达载体或携带雪花莲凝集素基因的质粒表达载体中的一种或一种以上的质粒表达载体。
步骤(3)中基因枪转化过程样品室真空度为20mMPa以上，可裂膜压力1100psi或900psi，胚性愈伤组织细胞与DNA微弹载体距离一般为9cm，每皿轰击1～2次。
所述诱导培养基(IM)组成为N6大量元素，N6微量元素，B5维生素，谷氨酰胺300mg/L，水解酪蛋白500mg/L，脯氨酸700mg/L，AgNO39mg/L，蔗糖20g/L，2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)2.0mg/L，植物凝胶2.7g/L，pH 5.8，高压灭菌后倒平板；所述继代培养基组成为IM，ABA(脱落酸)2.0mg/L，植物凝胶2.7g/L，pH5.8，高压灭菌后倒平板。
所述高渗培养基组成为IM，ABA 2.0mg/L，0.2mol/L甘露醇，0.2mol/L山梨醇，植物凝胶2.7g/L，pH 5.8，高压灭菌后倒平板。
所述选择培养基组成为IM，ABA2.0mg/L，植物凝胶2.7g/L，pH5.8，高压灭菌后加入5.0mg/L Basta(草丁膦)倒平板。
所述分化培养基组成为MS大量元素，MS微量元素，B5维生素，谷氨酰胺300mg/L，水解酪蛋白500mg/L，脯氨酸700mg/L，蔗糖20g/L，6-BA(6-苄氨基嘌呤)2.0mg/L，NAA(a-萘乙酸)0.1mg/L，植物凝胶2.7g/L，pH 5.8，高压灭菌后倒平板。
所述生根壮苗培养基组成为1/2MS基本培养基，NAA 0.1mg/L，植物凝胶2.7g/L，pH5.8，高压灭菌后倒瓶，对生根不好的小苗在生根壮苗培养基中再加入IBA(3-吲哚丁酸)2.0mg/L促进生根。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和效果本发明针对基因枪介导的超甜玉米转基因再生方面的问题，不仅提供了一种超甜玉米细胞转化再生体系，而且能够高效稳定地获得基因转化再生植株。
图1为携带苏云金杆菌杀虫蛋白(Bacillus thuring＝icnsis，B.t.)的质粒表达载体图。
图2为携带马铃薯蛋白酶抑制剂基因(Patato proteinase inhibitors，PinII)的质粒表达载体图。
图3为携带核糖体失活蛋白(Ribosome-inactivating protein，RIP)的质粒表达载体图。
图4为携带雪花莲凝集素基因(Galanthus nivalis，GNA)的质粒表达载体图。
图5为超甜玉米T0代植株PCR(35S的引物)扩增图。
Mλ/HindIII；p质粒pFWZ16；0H2O；N未转化植株；1～10转化植株图6为T0代植株PCR(GNA引物)扩增图。
Mλ/HindIII；p质粒860；N未转化植株；1～10、31为转化植株图7为一T0代植株southern blot分析图。
B质粒pFWZ16/EcoR I+XhoI；N未转化植株；1，4，5，6，9，10为转化植株图8为另一T0代植株southern blot分析图。
G质粒860/HindIII；N未转化植株；1，3，5，6，9，10为转化植株图9为再一T0代植株southern blot分析图。
P质粒TW a/BamH I；N未转化植株；8～29为转化植株具体实施方式
下面通过实施例及附图对本发明作进一步具体的说明，但本发明的实施方式不限于此。
本发明在建立方法过程中所用的培养基分别为诱导培养基(IM)N6大量元素，N6微量元素，B5维生素，谷氨酰胺300mg/L，水解酪蛋白500mg/L，脯氨酸700mg/L，AgNO39mg/L，蔗糖20g/L，2，4-D 2.0mg/L，植物凝胶2.7g/L，pH 5.8，高压灭菌后倒平板。
继代培养基IM，ABA(脱落酸)2.0mg/L，植物凝胶2.7g/L，pH5.8，高压灭菌后倒平板。
高渗培养基IM，ABA 2.0mg/L，0.2mol/L甘露醇，0.2mol/L山梨醇，植物凝胶2.7g/L，pH5.8，高压灭菌后倒平板。
选择培养基IM，ABA2.0mg/L，植物凝胶2.7g/L，pH5.8，高压灭菌后加入5.0mg/L Basta倒平板。
分化培养基MS大量元素，MS微量元素，B5维生素，谷氨酰胺300mg/L，水解酪蛋白500mg/L，脯氨酸700mg/L，蔗糖20g/L，6-BA 2.0mg/L，NAA(a-萘乙酸)0.1mg/L，植物凝胶2.7g/L，pH5.8，高压灭菌后倒平板。
生根壮苗培养基1/2MS基本培养基，NAA 0.1mg/L，植物凝胶2.7g/L，pH5.8高压灭菌后倒瓶，对生根不好的小苗在培养基中加入IBA(3-吲哚丁酸)2.0mg/L以促进生根。
在诱导培养基中加入2mg/L的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)时，超甜玉米自交系1132和单交种粤甜3号出愈率和胚性愈伤率达到最高，胚性愈伤率分别达到45.88％和35.00％，达到非常好的诱导效果。在诱导培养基中添加9mg/L的AgNO3，出愈率不受影响，而胚性愈伤率得到极显著提高，达31.25％，产生的胚性愈伤呈黄色、颗粒状、生长快，而不加AgNO3的处理没有产生胚性愈伤，其形成的非胚愈伤粘而软，透明，呈水浸状。AgNO3对胚性愈伤组织的诱导及改善愈伤组织的质量方面有着显著的作用。诱导培养基中添加700mg/L的脯氨酸比不加脯氨酸胚性愈伤率提高了12.41％，效果显著。高渗透压的培养基有利于胚状体的发生，脯氨酸同时具有调节渗透压和促进愈伤胚性化的作用。
实施例1本发明方法用于超甜玉米转基因植株的研制，能够获得高效稳定的再生植株。本发明包括超甜玉米愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的建立和以其为受体的抗玉米螟转基因超甜玉米的研制技术。
抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系详细建立过程如下(1)超甜玉米愈伤组织的诱导取授粉生长10天的超甜玉米自交系1132果穗，此时未成熟种子的幼胚长度为1.0～2.0mm，小心剥除果穗外苞叶，幼穗用70％酒精表面消毒，无菌水漂洗1～2次，再用15～20％(v/v)次氯酸钠溶液浸泡25分钟后，无菌水冲洗3～4次。在超净工作台上用解剖镊子小心挑出幼胚，接种于诱导培养基，25～27℃暗培养诱导愈伤组织。
(2)胚性愈伤组织的建立上述幼胚在诱导培养基上生长3～4周，挑取色泽淡黄、致密、颗粒状、干燥的胚性愈伤组织转接于继代培养基上继代培养，每3～4周转移1次。
超甜玉米自交系1132诱导愈伤组织率都比较高，是高诱导力的材料。在10天胚龄时诱导的胚性愈伤率最高，为37.78％；超甜玉米自交系1132诱导的胚性愈伤组织多为II型，具有黄绿色、颗粒状、松脆、生长旺盛、易发生胚状体、继代效果好等特点。
(3)胚性愈伤组织细胞的基因枪转化用基因枪(美国Bio-Rad公司，PDS-1000/He型基因枪)轰击前4～6小时，选生长发育旺盛、色泽良好并已夹碎至2～3mm的胚性愈伤组织转移到含高渗培养基的6cm培养皿中。DNA微弹的制备取4℃保存60mg/ml的金粉悬浮液100μl，依次加入1μg/μl质粒DNA(携带苏云金杆菌杀虫蛋白、马铃薯蛋白酶抑制剂基因、核糖体失活蛋白和雪花莲凝集素基因的基因表达载体)20μ1，2.5mol/L的CaCl2100μl，0.1mol/L的亚精胺(spermidine)40μl，振荡5分钟，室温(25～28℃)静置10分钟，使DNA沉淀到金粉微粒载体上，12000rpm离心5秒，弃上清，加260μl 70％乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5秒，弃上清，加260μl无水乙醇悬浮沉淀，12000rpm离心5秒，弃上清，加120μl无水乙醇重悬沉淀，每枪取10μl制备好的DNA金粉悬浮液至微弹载片上，晾干备用。将DNA微弹(包裹质粒DNA的金粉微粒)装载就绪，把有胚性愈伤组织的培养皿置于基因枪的样品室，样品真空度20mMPa，可裂膜压力1100psi，胚性愈伤组织细胞与DNA微弹载体距离为9cm，轰击，每皿轰击1～2次。
上述质粒DNA(基因表达载体)如图1～4所示，4个质粒表达载体由美国康乃尔大学构建，广东省农科院作物研究所胡建广博士提供，分别携带苏云金杆菌杀虫蛋白(Bacillus thuringicnsis，B.t.)、马铃薯蛋白酶抑制剂基因(Patato proteinase inhibitors，Pin II)、核糖体失活蛋白(Ribosome-inactivatingprotein，RIP)和雪花莲凝集素基因(Galanthus nivalis，GNA)，其中B.t.和Pin II基因含有一个选择标记基因bar。
(4)转化后愈伤组织的培养与筛选轰击后的胚性愈伤组织继续在原高渗培养基上培养16～18小时，然后转移到继代培养基上25～27℃黑暗条件下恢复培养3天。将恢复培养后的胚性愈伤组织转移到选择培养基上进行筛选。除草剂Basta(草丁膦)作为选择剂，当Basta浓度在5mg/L时，愈伤组织存活率较低，生长停止，色泽变褐，分化再生明显受到影响，确定为转化体的适宜筛选浓度。以后每2～3周转移1次，每次均挑选生长良好的抗性愈伤组织进行下一轮筛选。
(5)植株分化再生与移栽将抗性愈伤组织转入分化培养基诱导胚状体(26℃，每日16小时光照)，当出现绿芽后转入不含激素的再生培养基上生长(26℃，每日16小时光照)，诱导出小苗后再转入生根培养基产生根系，当发育成5～8cm高的完整小苗后经练苗选生长健壮的植株移栽到花盆中(基质为栽培花卉的有机土)，用大烧杯倒扣保湿。2周左右后将植株移栽到田间。即可获得基因转化植株。
再生植株生根、壮苗及移栽将分化再生长到2～3cm的小苗转入去有机的半量MS固体培养基中，小植株在营养相对不足的半量MS固体培养基上生长有利于生根壮苗，同时降低再生植株对MS固体培养基的依赖，提高移栽成活率。在壮苗培养基中加入激素能够促进再生苗产生根系。用低浓度的NAA(0.1mg/L)就能使再生苗的生根率达到57.72％。对生根不好的小苗将其转移至添加有2mg/L IBA的培养基中，可显著提高再生苗生根率，生根率提高到93.96％，而且长出的根又多又粗；对依然没有生根的小苗转移至较高浓度的NAA(0.2mg/L)和IBA(3mg/L)的生根壮苗培养基中，使生根率达到98.66％。经过生根壮苗后将培养瓶盖去掉让小植株过渡到有菌的环境中，经历一周后用清水小心洗掉粘附在根系上培养基，将5～8cm的小植株移栽到花盆中生长，土质为高温灭菌栽种花卉的营养土，用烧杯倒扣保湿，在生长期间补充水分及1/10的MS液体培养基，散射光下练苗2周左右，在外界环境适宜时(主要指外界温度适合超甜玉米生长，有效积温稳定＞＝10时，或者没有灾害性的天气)阴天将小植株移栽至大田，最好带土移栽，不能伤根，此时植株完全在自然环境中生长，可适当补充稀释的MS液体培养基促进生长缩短缓苗期。通过这些方法可显著提高转化植株成活率，稳定获得基因转化植株。
实施例2抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系详细建立过程如下(1)超甜玉米愈伤组织的诱导取授粉生长9天的超甜玉米单交种粤甜3号果穗，此时未成熟种子的幼胚长度为1.0～2.0mm，小心剥除果穗外苞叶，幼穗用75％酒精表面消毒，无菌水漂洗1～2次，再用或10～15g/L次氯酸钙溶液浸泡20分钟后，无菌水冲洗3～4次。在超净工作台上用解剖镊子小心挑出幼胚，接种于诱导培养基，25～27℃暗培养诱导愈伤组织。
(2)胚性愈伤组织的建立上述幼胚在诱导培养基上生长3～4周，挑取色泽淡黄、致密、颗粒状、干燥的胚性愈伤组织作转化受体或转接于继代培养基上继代培养，每3～4周转移1次。
单交种粤甜3号诱导愈伤组织率都比较高，为高诱导力的材料。在10天胚龄时诱导的胚性愈伤率最高，为33.33％；单交种粤甜3号虽诱导出的胚性愈伤率较高，但大多数为I型胚，此类胚性愈伤组织为白色、结构致密、坚硬、生长速度慢，在培养中容易发生器官分化，如特化长出肉质幼根，继代效果差，胚性逐渐丧失，难以分化再生而逐渐趋于死亡。
(3)胚性愈伤组织细胞的基因枪转化用基因枪(美国Bio-Rad公司，PDS-1000/He型基因枪)轰击前4～6小时，选生长发育旺盛、色泽良好并已夹碎至2～3mm的胚性愈伤组织转移到含高渗培养基的6cm培养皿中。DNA微弹的制备取4℃保存，60mg/ml的金粉悬浮液100μl，依次加入1μg/μl质粒DNA(携带雪花莲凝集素基因的基因表达载体，由美国康乃尔大学构建，广东省农科院作物研究所胡建广博士提供)20μl，2.5mol/L的CaCl2100μl，0.1mol/L的亚精胺(spermidine)40μl，振荡5分钟，室温(25～28℃)静置10分钟，使DNA沉淀到金粉微粒载体上，12000rpm离心5秒，弃上清，加260μl 70％乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5秒，弃上清，加260μl无水乙醇悬浮沉淀，12000rpm离心5秒，弃上清，加120μl无水乙醇重悬沉淀，每枪取10μl制备好的DNA金粉悬浮液至微弹载片上，晾干备用。将DNA微弹(包裹质粒DNA的金粉微粒)装载就绪，把有胚性愈伤组织的培养皿置于基因枪的样品室，样品真空度20mMPa，可裂膜压力1100psi，胚性愈伤组织细胞与DNA微弹载体距离为9cm，轰击，每皿轰击1～2次。
(4)转化后愈伤组织的培养与筛选轰击后的胚性愈伤组织继续在原高渗培养基上培养16～18小时，然后转移到继代培养基上25～27℃黑暗条件下恢复培养3天。将恢复培养后的胚性愈伤组织转移到选择培养基上进行筛选。5mg/L Basta(草丁膦)为选择剂，以后每2～3周转移1次，每次均挑选生长良好的抗性愈伤组织进行下一轮筛选。
(5)植株分化再生与移栽将抗性愈伤组织转入分化培养基诱导胚状体(26℃，每日16小时光照)，当出现绿芽后转入不含激素的再生培养基上生长(26℃，每日16小时光照)，诱导出小苗后再转入生根培养基产生根系，当发育成5～8cm高的完整小苗后经练苗选生长健壮的植株移栽到花盆中(基质为栽培花卉的有机土)，用大烧杯倒扣保湿。2周左右后将植株移栽到田间。即可获得基因转化植株。
再生植株生根、壮苗及移栽将分化再生长到2～3cm的小苗转入去有机的半量MS固体培养基中，小植株在营养相对不足的半量MS固体培养基上生长有利于生根壮苗，同时降低再生植株对MS固体培养基的依赖，提高移栽成活率。在壮苗培养基中加入激素能够促进再生苗产生根系。用低浓度的NAA(0.1mg/L)就能使再生苗的生根率达到57.72％。对生根不好的小苗将其转移至添加有2mg/L IBA的培养基中，可显著提高再生苗生根率，生根率提高到93.96％，而且长出的根又多又粗；对依然没有生根的小苗转移至较高浓度的NAA(0.2mg/L)和IBA(3mg/L)的生根壮苗培养基中，使生根率达到98.66％。经过生根壮苗后将培养瓶盖去掉让小植株过渡到有菌的环境中，经历一周后用清水小心洗掉粘附在根系上培养基，将5～8cm的小植株移栽到花盆中生长，土质为高温灭菌栽种花卉的营养土，用烧杯倒扣保湿，在生长期间补充水分及1/10的MS液体培养基，散射光下练苗2周左右，在外界环境适宜时阴天将小植株移栽至大田，最好带土移栽，不能伤根，此时植株完全在自然环境中生长，可适当补充稀释的MS液体培养基促进生长缩短缓苗期。通过这些方法可显著提高转化植株成活率，稳定获得基因转化植株。
实施例3抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系详细建立过程如下(1)超甜玉米愈伤组织的诱导取授粉生长11天的超甜玉米自交系1132果穗，此时未成熟种子的幼胚长度为1.0～2.0mm，小心剥除果穗外苞叶，幼穗用72％酒精表面消毒，无菌水漂洗1～2次，再用15～20％(v/v)次氯酸钠溶液浸泡21分钟后，无菌水冲洗3～4次。在超净工作台上用解剖镊子小心挑出幼胚，接种于诱导培养基，25～27℃暗培养诱导愈伤组织。
(2)胚性愈伤组织的建立上述幼胚在诱导培养基上生长3～4周，挑取色泽淡黄、致密、颗粒状、干燥的胚性愈伤组织转接于继代培养基上继代培养，每3～4周转移1次。
(3)胚性愈伤组织细胞的基因枪转化用基因枪(美国Bio-Rad公司，PDS-1000/He型基因枪)轰击前4～6小时，选生长发育旺盛、色泽良好并已夹碎至2～3mm的胚性愈伤组织转移到含高渗培养基的6cm培养皿中。DNA微弹的制备取4℃保存的60mg/ml的金粉悬浮液100μl，依次加入1μg/μl质粒DNA(携带苏云金杆菌杀虫蛋白的基因表达载体和雪花莲凝集素基因的基因表达载体，其中B.t.基因含有一个选择标记基因bar，由美国康乃尔大学构建，广东省农科院作物研究所胡建广博士提供)20μl，2.5mol/L的CaCl2100μl，0.1mol/L的亚精胺(spermidine)40μl，振荡5分钟，室温(25～28℃)静置10分钟，使DNA沉淀到金粉微粒载体上，12000rpm离心5秒，弃上清，加260μl 70％乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5秒，弃上清，加260μl无水乙醇悬浮沉淀，12000rpm离心5秒，弃上清，加120μl无水乙醇重悬沉淀，每枪取10μl制备好的DNA金粉悬浮液至微弹载片上，晾干备用。将DNA微弹(包裹质粒DNA的金粉微粒)装载就绪，把有胚性愈伤组织的培养皿置于基因枪的样品室，样品真空度20mMPa以上，可裂膜压力900psi，胚性愈伤组织细胞与DNA微弹载体距离为9cm，轰击，每皿轰击1～2次。
(4)转化后愈伤组织的培养与筛选轰击后的胚性愈伤组织继续在原高渗培养基上培养16～18小时，然后转移到继代培养基上25～27℃黑暗条件下恢复培养3天。将恢复培养后的胚性愈伤组织转移到选择培养基上进行筛选。5mg/L Basta(草丁膦)为选择剂，以后每2～3周转移1次，每次均挑选生长良好的抗性愈伤组织进行下一轮筛选。
(5)植株分化再生与移栽将抗性愈伤组织转入分化培养基诱导胚状体(26℃，每日至少16小时光照)；当出现绿芽后转入不含激素的再生培养基上生长(26℃，每日至少16小时光照)，诱导出小苗后再转入生根培养基产生根系；当发育成5～8cm高的完整小苗后经练苗选生长健壮的植株移栽到花盆中(基质为栽培花卉的有机土)，用大烧杯倒扣保湿，2周左右后将植株移栽到田间。即可获得基因转化植株。
试验1不同基因型胚龄与愈伤组织诱导情况表1不同基因型胚龄与愈伤组织诱导率的关系
超甜玉米自交系1132和单交种粤甜3号都可以诱导出愈伤组织，出愈率都比较高，两者都是高诱导力的材料。超甜玉米自交系1132在授粉后10～11天(d)胚龄时出愈率高达97.8％以上，而随着胚的增大，至12天时，出愈率明显下降仅为63.3％；而单交种粤甜3号至12天时，出愈率仍高达75.0％，但随着胚的增大也明显降低。说明从诱导愈伤率来看，不管超甜玉米自交系1132还是单交种粤甜3号均以9～11天胚龄的幼胚比较适宜，随着胚的增大，诱导也相应困难。两种基因型在10天胚龄时诱导的胚性愈伤率最高，分别为37.78％和33.33％，此时胚性愈伤组织状态也比较好；超甜玉米自交系1132诱导的胚性愈伤组织多为II型，具有黄绿色、颗粒状、松脆、生长旺盛、易发生胚状体、继代效果好等特点；单交种粤甜3号虽诱导出的胚性愈伤率较高，但大多数为I型胚，此类胚性愈伤组织为白色、结构致密、坚硬、生长速度慢，在培养中容易发生器官分化，如特化长出肉质幼根，继代效果差，胚性逐渐丧失，难以分化再生而逐渐趋于死亡(表1)。可见不同基因型胚龄产生的胚性愈伤组织及其状态存在差异，超甜玉米自交系1132和单交种粤甜3号10～11天胚龄的幼胚做为外植体诱导愈伤组织最适宜，而超甜玉米自交系1132能够诱导出高质量的胚性愈伤组织，是理想的基因转化材料。
对超甜玉米自交系1132和单交种粤甜3号诱导的愈伤组织缩短继代时间，长期继代不利于再生。为了使抗性克隆保持良好的胚性状态并且提高分化再生率，提高渗透压和ABA浓度有利于愈伤组织保持良好的胚性状态。蔗糖、甘露醇、ABA浓度分别为40g/L、20g/L、5.0mg/L时愈伤组织状态好，疏松呈颗粒状，胚性保持率达100％。培养基中蔗糖水平和激素种类及配比影响愈伤组织分化再生。分化培养基成份为MS大量元素，MS微量元素，B5维生素，谷氨酰胺300mg/L，水解酪蛋白500mg/L，脯氨酸700mg/L，蔗糖20g/L，6-BA2.0mg/L，NAA 0.1mg/L时显著地促进愈伤组织分化，获得稳定再生植株，分化率和再生率最高分别为81.13％和35.85％。
试验2基因枪转化超甜玉米自交系1132愈伤组织和单交种粤甜3号愈伤组织情况对上述超甜玉米自交系1132和单交种粤甜3号共进行了6批次的转化，最后均获得了再生植株，抗性愈伤率在22.64％～52.70％，平均33.75％；转化率差异很大在0.63％～7.62％，平均转化率为3.37％，第2次和第6次转化率高，分别为5.13％和7.62％。在所有的基因转化中，共获得再生植株128株，转化植株移栽到田间后经历缓苗、生长，最终成活31株，获得T1代种子的有26株。
试验3超甜玉米自交系1132和单交种粤甜3号转基因植株的PCR和Southern杂交分析为了检测再生植株是否整合有目的基因，提取基因组DNA进行PCR和Southern杂交分析。PCR扩增引物依据质粒表达载体中CaMv35S启动子序列设计。
引物序列为P-35s 5’GCAATGGAATCCGAGGAG 3’P-35AS5’CACATGAGCGAAAACCTATAGG 3’。
依据抗虫基因GNA序列设计1对扩增引物，序列为G15’GCTAAGGCAAGTCTCCTCATTT 3’；G25’TCACAAGCTTTATCTTTCCAGC 3’。
以CaMv35S启动子序列设计的引物结果扩增到了426bp的片段。以GNA基因序列设计的引物结果扩增到了460bp的基因片段。用目的基因的酶切片段制备探针进行southern杂交，结果证明目的基因整合在这些植株中。
(a)转基因T0代植株PCR(35S的引物)检测如图5所示(其中Mλ/HindIII；p质粒pFWZ16；0H2O；N未转化植株；1～10转化植株)，利用CaMv35S启动子序列设计的引物进行PCR扩增。能够扩增出和阳性对照大小相同的目的片段，扩增片段为426bp，而在未转化植株中没有扩增出相应片段，初步证明B.t.基因已经导入到植株中。
(b)转基因T0植株PCR(GNA引物)扩增如图6所示(其中Mλ/HindIII；p质粒860；N未转化植株；1～10、31为转化植株)，以GNA基因序列设计的引物进行PCR扩增，能够扩增出和阳性对照大小相同的目的片段，大小为460bp，而在未转化植株中没有扩增出相应片段。
(c)一转基因T0代植株的Southern blot分析如图7所示(B质粒pFWZ16/EcoR I+XhoI；N未转化植株；1、4、5、6、9、10为转化植株)，B.t.目的基因酶切片段制备探针进行southern杂交。证明B.t.基因整合在植株中。
(d)另一转基因T0代植株southern blot如图8所示(G质粒860/HindIII；N未转化植株；1、3、5、6、9、10为转化植株)，在对转化植株是否整合有GNA基因时，进行Southern杂交，证明目的基因GNA整合在植株基因组中。
(e)再一转基因T0代植株southern blot如图9所示(P质粒TW a/BamH I；N未转化植株；8～29为转化植株)，Southern杂交证明目的基因Pin整合在植株基因组中。
表2转基因植株T1代抗虫性分析
(表1中9-1、9-2等代表转基因T1代单株，即数字9代表转基因当代编号为9的植株，-1，-2等为其后代单株编号，其余类似。)试验4超甜玉米自交系1132和单交种粤甜3号转基因植株抗虫测定在玉米植株生长至8叶期时，取顶上叶片剪成2cm宽、3～4块放在广口玻璃瓶中，每株一瓶，每瓶中接初孵幼虫30头，以未转化植株为对照，3天更换一次新鲜叶片。6天统计活虫头数，测量活虫重、活虫体长，鉴定叶片被害级别，计算饲喂6天平均活虫重和死亡率。部分试验结果见表2。转基因株系可明显抑制玉米螟幼虫的发育，幼虫体重增加缓慢。饲喂6天后5个转基因株系平均死亡率为74.25％，显著高于对照平均死亡率46.67％。
SEQUENCE LISTING<110>广东省农业科学院作物研究所<120>一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系及其建立方法<130>3<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>18<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依据质粒表达载体中CaMv35S启动子序列设计的P-35s<400>1gcaatggaat ccgaggag18<210>2<211>22<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依据质粒表达载体中CaMv35S启动子序列设计的P-35AS
<400>2cacatgagcg aaaacctata gg 22<210>3<211>22<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依据抗虫基因GNA序列设计的扩增引物G1<400>3gctaaggcaa gtctcctcat tt 22<210>4<211>22<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>依据抗虫基因GNA序列设计的扩增引物G2<400>4tcacaagctt tatctttcca gc 2权利要求
1.一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系的建立方法，其特征在于包括下述步骤(1)超甜玉米愈伤组织的诱导取授粉生长9～11天的超甜玉米果穗，未成熟种子的幼胚长度为1.0～2.0mm，剥除果穗外苞叶，幼穗用70～75％酒精表面消毒，无菌水漂洗1～2次，再用15～20％次氯酸钠溶液或10～15g/L次氯酸钙溶液浸泡20～25分钟后，无菌水冲洗3～4次；无菌条件下挑出幼胚，接种于诱导培养基，25～27℃暗培养诱导愈伤组织；(2)胚性愈伤组织的建立上述幼胚在诱导培养基上生长3～4周，挑取胚性愈伤组织作转化受体或转接于继代培养基上继代培养，每3～4周转移1次；(3)胚性愈伤组织细胞的基因枪转化用基因枪轰击胚性愈伤组织细胞前4～6小时，选取胚性愈伤组织转移到含高渗培养基的培养皿中；将DNA微弹装载到载片上就绪，将胚性愈伤组织置于基因枪的样品室进行基因枪转化；(4)转化后愈伤组织的培养与筛选轰击后的胚性愈伤组织继续在原高渗培养基上培养16～18小时，然后转移到继代培养基上在25～27℃黑暗条件下恢复培养；将恢复培养后的胚性愈伤组织转移到选择培养基上进行筛选，每2～3周转移1次，挑选生长良好的抗性愈伤组织进行下一轮筛选；(5)植株分化再生与移栽在26℃，每日至少16小时光照条件下，将生长良好的抗性愈伤组织转入分化培养基诱导胚状体；当出现绿芽后转入不含激素的分化培养基上生长，诱导出小苗后再转入生根壮苗培养基产生根系；当发育成5～8cm高的完整小苗后经练苗，选择生长健壮的植株移栽到基质为栽培花卉的有机土中，保湿，2周后将植株移栽到田间。
2.根据权利要求1所述的一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系的建立方法，其特征在于，所述超甜玉米包括超甜玉米自交系1132或单交种粤甜3号。
3.根据权利要求1所述的一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)中挑取的胚性愈伤组织为色泽淡黄、致密、颗粒状、干燥的胚性愈伤组织。
4.根据权利要求1所述的一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)中选取的胚性愈伤组织为生长发育旺盛、色泽良好并已夹碎至2～3mm的胚性愈伤组织。
5.根据权利要求1所述的一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)中DNA微弹按下述方法制备取4℃保存的60mg/ml金粉悬浮液100μl，依次加入1μg/μl质粒DNA 20μl，2.5mol/L的CaCl2100μl，0.1mol/L的亚精胺40μl，振荡5分钟，室温静置10分钟，使质粒DNA沉淀到金粉微粒载体上，12000rpm离心5秒，弃上清，加260μl 70％乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5秒，弃上清，加260μl无水乙醇悬浮沉淀，12000rpm离心5秒，弃上清，加120μl无水乙醇重悬沉淀，每枪取10μl制备好的DNA金粉悬浮液至微弹载片上，晾干。
6.根据权利要求1所述的一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)中基因枪转化过程样品室真空度为20mMPa以上，可裂膜压力1100psi或900psi，胚性愈伤组织细胞与DNA微弹载体距离为9cm，每皿轰击1～2次。
7.根据权利要求1所述的一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系的建立方法，其特征在于，所述诱导培养基组成为N6大量元素，N6微量元素，B5维生素，谷氨酰胺300mg/L，水解酪蛋白500mg/L，脯氨酸700mg/L，AgNO39mg/L，蔗糖20g/L，2，4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L，植物凝胶2.7g/L，pH 5.8，高压灭菌后倒平板；所述继代培养基组成为IM，脱落酸2.0mg/L，植物凝胶2.7g/L，pH 5.8，高压灭菌后倒平板；所述高渗培养基组成为IM，脱落酸2.0mg/L，0.2mol/L甘露醇，0.2mol/L山梨醇，植物凝胶2.7g/L，pH 5.8，高压灭菌后倒平板；所述选择培养基组成为IM，脱落酸2.0mg/L，植物凝胶2.7g/L，pH5.8，高压灭菌后加入5.0mg/L草丁膦倒平板；所述分化培养基组成为MS大量元素，MS微量元素，B5维生素，谷氨酰胺300mg/L，水解酪蛋白500mg/L，脯氨酸700mg/L，蔗糖20g/L，6-苄氨基嘌呤2.0mg/L，a-萘乙酸0.1mg/L，植物凝胶2.7g/L，pH 5.8，高压灭菌后倒平板；所述生根壮苗培养基组成为1/2MS基本培养基，NAA 0.1mg/L，植物凝胶2.7g/L，pH 5.8高压灭菌后倒瓶。
8.根据权利要求5所述的一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系的建立方法，其特征在于，所述质粒DNA包括携带苏云金杆菌杀虫蛋白的质粒表达载体、携带马铃薯蛋白酶抑制剂基因的质粒表达载体、携带核糖体失活蛋白的质粒表达载体或携带雪花莲凝集素基因的质粒表达载体中的一种或一种以上的质粒表达载体。
9.根据权利要求1～8任一项所述的一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系的建立方法建立的抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系。
全文摘要
本发明提供了一种抗玉米螟转基因超甜玉米再生体系及其建立方法，其建立方法包括下述步骤超甜玉米愈伤组织的诱导；胚性愈伤组织的建立；胚性愈伤组织细胞的基因枪转化；转化后愈伤组织的培养与筛选；植株分化再生与移栽。该建立方法的超甜玉米细胞转化再生率较高，不仅提供了一种超甜玉米细胞转化再生体系，而且能够高效稳定地获得基因转化再生植株。
文档编号C12N15/87GK1763207SQ20051003687
公开日2006年4月26日 申请日期2005年8月30日 优先权日2005年8月30日
发明者李余良, 胡建广 申请人:广东省农业科学院作物研究所