专利名称：用于鉴定临床菌血症28种常见致病菌的方法
技术领域：
本发明属于生物技术的分子生物学和生物化学领域，涉及鉴定临床菌血症常见致病菌的悬浮芯片技术，适用于临床分离菌株的菌种鉴定，为临床菌血症患者准确合理地进行抗菌药物治疗提供指导。
背景技术：
从血培养中分离得到细菌表示感染严重需要立即进行抗菌治疗。不同致病菌对药物种类和浓度的敏感性不同，治疗成功的关键在于早期应用合适足量的药物。血培养分离鉴定细菌通常需要1～3d，这期间用药不当往往使得患者病情加重或增加菌株耐药性。特别是在多种细菌联合感染的情况下，更增加了菌种鉴定和用药的复杂性。因此，建立一种快速且特异性强的微生物检测方法是十分必要的。PCR方法是近年来发展起来的诊断技术，这种技术快速、灵敏，在临床微生物检测方面获得了极为广泛的应用；但是PCR检测方法也存在一些不足，如检测每一种病原菌都需要特异性引物，因而每次反应只能确定一种病原菌的有无，这种“一对一”的模式不适合检测混合感染的复杂标本。临床微生物的检测急需建立一种“一对多”的检测系统，可以通过一次反应检测多种目标病原体。而通过生物芯片——一种新兴的高通量检测技术，使得在面积较小的载体(如玻片)上对多个目标基因或多种病原体的同时检测成为可能。
高通量的基因芯片技术的出现，给临床检测带来了很大的便利。但是传统的固相生物芯片在长期使用过程中也逐渐暴露出其存在的不足(1)灵活性较差生物芯片都是按照一定的模式预制好的，不能适应病人千变万化的需要；(2)检测所需的时间较长因为反应是在玻璃或膜基质上进行，因此必须反复多次洗涤，以除去过量的反应起始物、中间产物及杂交缓冲液等；(3)可重复性不够理想在玻璃或膜基质上进行杂交，影响因素较多，实验条件难以严格控制。(4)价格昂贵目前临床在用的生物芯片，价格均较高，病人难以承受。因此，迫切需要开发一种高通量、快速、灵敏度高、重复性好、应用灵活、经济的检测技术平台。
与固相生物芯片相比较，QIAGEN公司推出的LiquiChip Workstaion检测分析过程是在悬浮状态下进行的。LiquiChip技术是以具有xMAPTM特异性革新技术的荧光流式细胞仪为基础的，用来检测LiquiChip微球(LiquiChip beads)表面发生的生物分子反应。
LiquiChip微球是物理特性稳定的聚苯乙烯小球。每个LiquiChip微球均包被有两种红色分类染料，且这两种染料的特定比例使得其所包被的微球具有独特的荧光信号谱，从而使得该种微球被LiquiChip检测器(LiquiChip Reader)特异性地识别。一组具有同样染料比例(相同荧光信号谱)的微球称为一个微球集(a bead set)。具有不同荧光信号谱的100种微球集组成一个微阵列，每种微球集表面可连接有不同的反应物，因此，使得单次检测通量可以高达100。在快速液体流中微球逐一通过Luminex100分析仪中两个不同的激光器，高速数字信号处理器依据其荧光信号谱来识别不同的微球，并以同报告分子偶联的第三种荧光染料来定量微球表面发生的生物分子反应。微球通过速度可达每秒数千个，使得对多达100个通量的分析在几秒钟内完成。
LiquiChip Workstaion的高通量检测方法的优点在于(1)通量高有100种荧光信号谱不同的微球集，这样就可以同时连接100种探针，同时进行100种杂交反应。(2)快速传统的固相芯片杂交需要多次洗涤的步骤，而该技术是对单个微球进行检测，不存在本底影响的问题，基本上不需洗涤，因此所需的实验时间短；并且，配上自动加样器和蠕动泵，微球通过荧光检测仪的速度可以达到每秒10000个。仅200个结合相同探针微球的检测就具有统计学意义，因此，100种微球集通过流式细胞仪的检测只需2秒，可以连续高效地进行多样本分析。(3)灵敏度高该技术是对单个微球荧光信号进行检测，将其作为离散量累加得到总信号强度，使检测更加精确、可靠，用极少量的样本就可进行检测。(4)重复性好不同微球集分别标记后混合，再分装成小份，用于分别检测各标本，各小份的性质完全一致。(5)灵活性强与传统的固相芯片相比，不同微球集是分别标记后再混合的，所以在临床使用时，可以根据不同病人、不同疾病或其他不同需求，从中选择特殊组合的探针，临时搭配所需要的微球，从而避免人力物力的无谓浪费，使个体化，低成本的检测成为可能。
发明内容
本发明选用了luminex公司可提供100种微球中的30种微球体。
本发明提供了用于鉴定28种临床菌血症常见致病菌的方法，所述的28种常见致病菌包括产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、弗氏柠檬酸杆菌、粘质沙雷菌、奇异变形菌、普通变形菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌、溶血葡萄球菌、沃氏普通球菌、松鼠葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、绿色链球菌、流感嗜血杆菌、嗜水气单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、铜绿假单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌。本发明方法是将上述28种常见致病菌的30个菌种特异性探针交联在30种不同的荧光微球上，与被测标本反应后，再与荧光素标记的报告分子反应，通过荧光检测仪检测上述28种常见致病菌的种特异性23S核糖体DNA(23S rDNA)。
用于鉴别上述28种常见致病菌的30个菌种特异性探针序列如下表1表1 菌种鉴定特异性探针序列
本发明方法将所述30个菌种特异性探针与30种不同的荧光微球交联方法是每个探针与相应的荧光微球通过化学交联反应连接在一起。
鉴定方法的主要步骤为(1)将标记好探针的微球体与被测标本混合，使之与被测标本中相应的目的分子特异性结合；
(2)在步骤(1)中加入链酶亲和素—藻红蛋白复合物；(3)上述步骤的反应物经过荧光检测仪检测，通过检测到的荧光强度判断不同菌种核酸的种特异性23S核糖体DNA(23S rDNA)。
本鉴定方法用于临床菌血症常见致病菌菌种的鉴定。
以下为本发明方法较详细的步骤1、悬浮芯片的制作每个合成的探针(Invitrogen，Shanghai，China)5’端为一个氨基基团，接着是菌种特异性探针。每个探针与相应的微球通过交联反应而连接在一起。标记后2-8℃避光保存。
本发明所用的探针序列见表1。每条序列的5’端都有氨基修饰，然后是菌种特异性探针。
2、待测样本的准备挑取单个菌落置于50μl抽提裂解液(10mM Tris-HCI pH值7.6，5mMEDTA，0.5％ SDS，0.22μm膜过滤处理)，100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取2μl上清作为PCR模板。
3、待测样品的扩增与标记PCR反应扩增23S rDNA片段，所使用的是P6/P10r引物对，上游引物P6为SEQ NO315’-GCGATTTCYGAAYGGGGRAACCC-3’，下游引物MY09为SEQNO32 5’--TTCGCCTTTCCCTCACGGTACT-3’(R＝A+G；Y＝C+T)，5’端修饰生物素Biotin。50-μl的PCR反应体系含2μl的模板DNA，20pmol的上游引物P6，40pmol的生物素标记的下游引物Biotin-P10r，0.2mM的dNTPs，1.25U的PyrobestTaq DNA聚合酶，10×反应缓冲液。混匀后，5个循环95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸15s，接下去进行21个循环95℃变性15s，65℃退火30s。
4、杂交和上机检测10μlPCR产物或阳性对照或阴性对照，加入40μl的4×SSC杂交液(内含每一种标记有型特异性探针的微球各5000个)。95℃变性5分钟，65℃杂交15分钟。反应结束后，洗涤微球两次。加入25μl藻红蛋白。避光室温反应5分钟。最后，在Luminex100analyzer上进行检测。
本发明首次将基因芯片技术应用于临床菌血症常见致病菌的鉴定，其积极效果在于目前有关临床菌血症常见致病菌鉴定的芯片研究还不多，本发明制备的菌株鉴定基因芯片是采用基于微球为载体的悬浮基因芯片，可以根据实际需要设计芯片探针数量。
本发明的优点在于1、通量高、速度快。能一次鉴别28种常见致病菌，大大提高了菌株鉴定效率，缩短检测时间。
2、敏感性高、特异性强。以单核细胞增生李斯特菌为例所检测的最低浓度是9.3×106cfu/ml。另外，实验设计阳性对照、阴性对照和空白对照，对芯片的质量进行控制，排除假阳性、假阴性，使检测结果更加可靠。
3、检测结果客观性强，可靠性高。本技术是对多个微球体荧光信号进行单独检测后，用配套的软件进行统计分析，使检测结果更加精确、可靠，大大降低了分析结果判断过程中的人为的主观因素。
具体实施例方式
一、菌株收集所用的91株纯培养菌株多数为临床分离株于2004年4月至2005年8月从浙江大学附属医院收集而来。其中包括6株标准株，即肺炎克雷伯菌(ATCC700603)，大肠杆菌(ATCC25922)，粪肠球菌(ATCC29212)，铜绿假单胞菌(ATCC27853)，金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，单核细胞增生李斯特氏菌(NICPBP54001)。ATCC指美国菌种保藏中心；NICPBP指中国药品生物制品检定所。
二、获取菌株DNA挑取单个菌落置于50μl抽提裂解液(10mM Tris-HCI pH值7.6，5mM EDTA，0.5％ SDS，0.22μm膜过滤处理)，100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取2μl上清作为PCR模板。
三、待测菌株23S rDNA扩增与标记PCR反应所使用的是P6/P10r引物对，上游引物P6为SEQ NO315’-GCGATTTCYGAAYGGGGRAACCC-3’，下游引物MY09为SEQ NO32 5’--TTCGCCTTTCCCTCACGGTACT-3’(R＝A+G；Y＝C+T)，5’端修饰生物素Biotin。50-μl的PCR反应体系含2μl的模板DNA，20pmol的上游引物P6，40pmol的生物素标记的下游引物Biotin-P10r，0.2mM的dNTPs，1.25U的PyrobestTaq DNA聚合酶，10×反应缓冲液。混匀后，5个循环95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸15s，接下去进行21个循环95℃变性15s，65℃退火30s。5μl的上样量进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳(方法参照《分子克隆实验指南》98版)。
四、菌株鉴定基因芯片的制作本发明包含30个菌种特异性探针。每个合成的探针(Invitrogen，Shanghai，China)5’端为一个氨基基团，然后是菌种特异性探针。探针序列见发明内容表1。每个探针与相应的微球通过交联反应而连接在一起。探针1-30与相应微球交联在一起后依次命名为1a、1b、1c、2a、2b、2c、3a、3b、3c、4a、4b、4c、5a、5b、5c、6a、6b、6c、7a、7b、7c、8a、8b、8c、9a、9b、9c、10a、10b、10c。交联的具体过程如下5×106个羧基化微球悬浮于50μl 100mM2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid(MES)，pH 4.5的反应液中，加入1nmol的氨基化的探针分子，加入25μg的交联剂N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide(EDC)(PierceChemical，Rockford，IL)后，避光反应30分钟，再加入25μg交联剂(EDC)，再避光反应30分钟。反应结束后，用0.02％ Tween-20液洗一次，再用0.1％ SDS液洗涤一次。最后，将标记有探针的微球悬浮于TE，pH 8.0(10mM Tris-HCl，1mM EDTA)，2-8℃避光保存。寡核苷酸探针与微球偶联效率用与18个T间隔臂互补的生物素标记的18个A寡核苷酸来质控。2nmol/L生物素标记的18个A寡核苷酸与30种微球混合物发生杂交反应，具体步骤如下，杂交信号如小于1,000，需要重新标记。
五、杂交(避光操作)和上机检测0.2-ml的薄壁PCR管中，加入40μl的4×SSC杂交液(内含每一种标记有型特异性探针的微球各5000个)，加入10μl阳性对照或阴性对照或PCR产物(总体积50μl)。在PE 9600PCR仪上，95℃变性5分钟，65℃杂交15分钟。反应结束后，在96-well microtiter plates(Millipore Corporation，Bedford，MA 01730 U.S.A)上，100μl 2×SSC/0.02％ Tween-20液洗涤微球两次。最后，将重悬于75μl 2×SSC/0.02％ Tween-20液。加入25μl藻红蛋白(Streptavidin-R-phycoerythrin，10μg/ml溶于2×SSC/0.02％ Tween-20)。避光室温反应5分钟。最后，在Luminex100analyzer上进行检测。
六、敏感性测试将新鲜隔夜生长的单核细胞增生李斯特氏菌(NICPBP54001)用PBS洗涤后放入1ml的dd H2O中，并且用dd H2O以10倍梯度稀释，每个稀释浓度取100μl菌液用来DNA抽提、PCR扩增及杂交检测，以明确检测下限。梯度稀释溶液中的细菌数目通过平板计数获得。
结果分析一、临床菌血症常见致病菌悬浮芯片系统对91株纯培养菌株的检测与鉴定91株纯培养菌株的23S rDNA扩增结果及PCR产物经悬浮芯片分析结果列于表2中。分析中涉及的多数菌株可通过菌种特异性杂交模式获得正确的判断，但是存在4组临床分离株例外。这4组细菌包括6种血浆凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)；大肠杆菌，肺炎克雷伯菌与产气肠杆菌；绿色链球菌与肺炎链球菌；奇异变形菌与普通变形杆菌。
血浆凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)与血浆凝固酶阳性金黄色葡萄球菌可明确区别。肺炎克雷伯菌易与产酸克雷伯菌鉴别，但是其临床分离株不能区别于产气肠杆菌，可能是肺炎克雷伯菌与产气肠杆菌在基因型及生化培养表型特征存在一些相似特性，才使得两者不易区别。绿色链球菌与肺炎链球菌，奇异变形菌与普通变形杆菌的鉴别可达到属水平。
表2.临床分离菌株91株PCR扩增23S rDNA及扩增产物与悬浮芯片杂交后的结果。
(注释表2中第三列为杂交显示阳性信号的探针。*表示针对某一菌种的特异性寡核苷酸探针。)二、临床菌血症常见致病菌基因芯片系统的检测极限为了评估该悬浮芯片系统的检测极限，我们对单核细胞增生李斯特菌NICPBP54001进行梯度稀释，再分别行PCR扩增及与该检测系统进行杂交。结果显示，在我们的实验条件下，该系统最低检测浓度是9.3×106cfu/ml。
权利要求
1.用于鉴定临床菌血症28种常见致病菌的方法，所述28种常见致病菌包括产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、弗氏柠檬酸杆菌、粘质沙雷菌、奇异变形菌、普通变形菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌、溶血葡萄球菌、沃氏普通球菌、松鼠葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、绿色链球菌、流感嗜血杆菌、嗜水气单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、铜绿假单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌，其特征在于针对上述28种常见致病菌的30个菌种特异性探针交联在30种不同的荧光微球上，与被测标本反应后，再与荧光素标记的报告分子反应，通过荧光检测仪检测上述28种常见致病菌的种特异性23S核糖体DNA(23S rDNA)。
2.按权利要求1所述用于鉴定临床菌血症28种常见致病菌的方法，其特征在于针对28种常见致病菌的30个菌种特异性探针序列如下
3.按权利要求1所述用于鉴定临床菌血症28种常见致病菌的方法，其特征在于所述30个菌种特异性探针在30种不同的荧光微球上的交联方法是每个探针与相应的荧光微球通过化学交联反应连接在一起。
4.按权利要求1所述用于鉴定临床菌血症28种常见致病菌的方法，其特征在于鉴定的主要步骤为(1)将标记好探针的微球体与被测标本混合，使之与被测标本中相应的目的分子特异性结合；(2)在步骤(1)中加入链酶亲和素-藻红蛋白复合物；(3)上述步骤的反应物经过荧光检测仪检测，通过检测到的荧光强度判断不同菌种核酸的种特异性23S核糖体DNA(23S rDNA)。
5.按权利要求1所述用于鉴定临床菌血症28种常见致病菌的方法，其特征是该方法用于临床菌血症常见致病菌菌种的鉴定。
全文摘要
本发明为用于鉴定临床菌血症28种常见致病菌的方法，属于生物技术的分子生物学和生物化学领域，涉及鉴定临床菌血症常见致病菌的悬浮芯片技术，适用于临床分离菌株的菌种鉴定，为临床菌血症患者准确合理地进行抗菌药物治疗提供指导。本发明方法是将针对28种常见致病菌的30个菌种特异性探针交联在30种不同的荧光微球上，与被测标本反应后，再与荧光素标记的报告分子反应，通过荧光检测仪检测上述28种常见致病菌的种特异性23S核糖体DNA(23S rDNA)。本方法敏感性高、特异性强，菌株鉴定效率高，检测时间短。
文档编号C12Q1/04GK1814797SQ200510061768
公开日2006年8月9日 申请日期2005年12月2日 优先权日2005年12月2日
发明者陈智, 侯晓丽, 朱海红 申请人:浙江大学