包含他汀的组合物的制作方法

专利名称：包含他汀的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含他汀的组合物。本发明还涉及所述组合物在制备食品方面的用途和所述组合物的制备方法。
背景技术：
心血管疾病是发病率和死亡率的首要原因，尤其是在美国和西欧国家，并且正在发展中国家中显现出来。根据美国心脏学会，心脏病的主要危险因素是年龄(65岁及以上)、男性、遗传、吸烟、高血胆固醇水平(高胆固醇血症)、高血压、缺乏运动、糖尿病和肥胖。
显然，这些危险因素中的某些，如年龄、性别、遗传或糖尿病无法改变。但是，改变那些可能增加危险因素的生活方式是可能的，如吸烟、增高的血胆固醇、增高的血压、缺乏运动或肥胖。
增高的低密度脂蛋白胆固醇(下文称为“LDL-胆固醇”)与冠心病的风险增加直接相关。
他汀是已知具有降低人血中LDL-胆固醇水平作用的化合物。他汀抑制羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-COA)还原酶，胆固醇生物合成中的速率控制步骤。
科学研究已经证实了他汀对动物和人的健康特性，特别是关于降低LDL血胆固醇和甘油三酯水平的活性(Li等，Nutrition Research 18，71-81(1998)；Heber等，Am.J.Clin.Nutr.69,231-236(1999))。
人食用的食物中他汀的存在与较低的LDL胆固醇水平和较低的冠心病风险相关。
当其BMI超过30，人们被认为是超重。用人的身高除以人的体重来计算BMI数。具有两种或更多心脏病危险因素的人，当其兼有高BMI时，则有更高的心脏病风险。另外，肥胖使冠心病的死亡率增加2-4倍。
因此具有健康的体重是必要的。长期限制饮食以达到并保持体重降低是重要的。面包、土豆、意大利面、大米、水果和蔬菜被认为是健康饮食的基础。普遍公认饮食中的脂肪应保持最低。
控制一种以上危险因素的产品是有益的。
用于生产食品的包含他汀的组合物是已知的。WO02/64809描述了通过发酵制备他汀的方法及包含一种或更多他汀的食品。其描述了用有机溶剂(乙醇和乙腈)从发酵的大豆中提取他汀和所述提取物在制备人造乳玛琳和酱中的用途。此方法的缺点是他汀的收率相当低(0.0545g他汀/kg(乙醇提取物)和0.0978g他汀/kg(乙腈提取物))。
在WO02/063976中，包含他汀的发酵的大豆原料用于制备食品。这种发酵的大豆原料包含约20wt.％的油。高脂肪含量使这些含有他汀的原料不适合用于低脂饮食。

发明内容
本发明的一个目的是提供可以用于生产食品的包含他汀的组合物。本发明的另一个目的是提供可以用于生产低脂食品的包含他汀的组合物。此外，本发明的另一个目的是提供包含他汀的低脂食品。本发明的再一个目的是提供包含他汀的组合物的制备方法。
令人惊奇地，一或多个上述目的通过包含他汀的组合物而实现，其中所述组合物是包含低于10wt％的脂肪的面粉。
具体实施例方式
本发明涉及包含他汀的组合物，其特征在于所述组合物是包含低于10wt％的脂肪的面粉。优选所述面粉包含低于5wt％的脂肪，优选低于1wt％的脂肪或更优选基本无脂肪。
为了本发明的目的，面粉被定义为通过研磨含淀粉植物原料得到的细粉。面粉可以由包括大麦、荞麦、鹰嘴豆、菜豆、燕麦、花生、马铃薯、大豆、大米和黑麦在内的含淀粉植物原料制得。
根据本发明的组合物包含他汀。他汀被定义为具有图1中给出的结构式的物质。在这个结构式中，R1和R2可以是任何基团。优选的他汀是图1中给出的那些。
除非另有说明，给出的他汀的量用相对于食品总重量的wt.％或每百万份的重量份(ppm)、mg/kg或mg/g表示。
除非另有说明，本文中给出的他汀的量是各种他汀的量的总和，例如通过高效液相色谱(HPLC)或LC-MS测定。
优选根据本发明的组合物包含至少0.01mg/g他汀，更优选0.1mg/g他汀。尤其优选本发明的面粉包含至少1mg/g他汀。
本发明的一个具体实施方案涉及本发明组合物在食品制备中的用途。
可以根据本发明制备多种食品，例如，酱、汤、意大利面、面条、冰淇淋、沙司、浇汁、点心、加工的谷物食品、饮料、面包、饼干、松饼、其他焙烘食品、糖果、食品条、巧克力、奶制品、特定食品例如减肥食品或替代食品等。尤其可以根据本发明制备焙烘食品，例如薄烤饼、松饼和面包。
根据本发明的食品，尤其是焙烘食品，具有低脂肪含量。优选所述食品具有低于10wt.％的脂肪，更优选低于5wt.％。
如果根据消费者的一般需要使用根据本发明的食品，那么所述食品优选包含足以得到降低血LDL胆固醇效果的他汀量。
在这里优选的他汀每日摄取量为5-40mg/天，更优选5-20mg/天，尤其优选8-15mg/天。此外，他汀的每日摄取量优选为1-5mg/天，更优选1-2.5mg/天。
本领域技术人员能够调整他汀在食品中的百分比以得到理想的降低血胆固醇的效果。由于所用的食品每份大小不同，所以百分比将依据食品的种类而定。此外，食品的消费模式(每日一份和于数日中分用)也依据食品而定。
优选食品包含0.1-10mg他汀/份，更优选1-5mg他汀/份，尤其优选1-2.5mg他汀/份。
本发明的另一实施方案涉及包含他汀的组合物的制备方法，其中所述组合物是包含低于10wt.％的脂肪的面粉并且所述方法包括用产生他汀的真菌发酵底物、研磨底物、提取底物并回收已提取的底物的步骤，由此，已提取的底物使得包含他汀的面粉含有低于10wt.％的脂肪。可在发酵之前或之后研磨底物。优选在发酵后进行研磨。
发酵的底物可以用任何提取剂提取，只要所述提取剂从底物中提取脂肪。对于用在食品应用中，可以用许多有机溶剂从发酵的大豆中进行脂肪提取己烷、丙酮、乙酸乙酯和乙醇或其混合物。优选提取剂从底物中提取脂肪，使得已提取的底物包含低于10wt.％的脂肪，更优选低于5wt.％的脂肪，并尤其更优选低于1wt.％的脂肪。另外，优选的提取剂在底物中保留有效量的他汀。有效量的他汀意指足以有效降低胆固醇的量。优选已提取的底物包含至少每克提取的底物0.01mg他汀，更优选至少每克提取的底物0.1mg他汀，尤其优选至少每克提取的底物1mg他汀。优选提取剂是食品级。己烷和超临界CO2是优选的提取剂。
底物可以根据其是否可以被产生他汀的真菌发酵而不同。另外，底物优选具有高含量的含淀粉物质。可用的合适的底物是大豆、大麦、荞麦、鹰嘴豆、菜豆、燕麦、花生、马铃薯、大米和黑麦。
尤其合适的底物是大豆。大豆粉可以用于多种产品如曲奇、酥皮糕点、甜食、咸味点心例如玉米片(nacho chips)、预制食品、人造肉(meat replacer)、意大利面、薄烤饼、松饼、面包和面包类产品。此外，大豆粉包含蛋白质、纤维和植物铁蛋白、皂角苷、多酚例如异黄酮，优选非糖基化形式。所有这些均显示出对血胆固醇水平和血液中甘油三酯水平具有有益效果。
食品中的大豆蛋白含量可以根据Agater等人的J.Sci.Food Agric.(1986)，37(3)，317-31中描述的方法测量。
多酚包括类黄酮，其包括异黄酮。多酚包括异黄酮、茋、木酚素、配糖(coumestans)和二羟基苯甲酸内酯。异黄酮的例子有染料木黄酮、大豆黄素、雌马酚、黄豆黄素、鹰嘴豆芽素A、香豆雌酚、maitaresinol、芒柄花素、O-desmethylengolesin、肠内酯和肠二醇。优选的根据本发明的异黄酮是染料木黄酮和大豆黄素和黄豆黄素，其存在于大豆。
在本文中皂角苷衍生为β-D-吡喃葡糖苷酸衍生物。皂角苷的例子是大豆甾醇A、B、C、D和E，大豆皂苷I、II和III，如在Le bensinittelLexikon，B.Behr’s Verlag GmbH & Co.Hamburg，Bd.2，L-Z-3，1993，550-552页中所描述的。
优选根据本发明的食品包含他汀和非糖基化的异黄酮。在大豆和衍生自大豆的大豆原料中，异黄酮基本上是以糖基化的形式存在的。典型地，约5wt.％的异黄酮以非糖基化的形式存在。最重要的糖基化的异黄酮是染料木苷、大豆苷和异黄酮苷(glycetin)。非糖基化的形式分别是染料木黄酮、大豆黄素和黄豆黄素。已有报道染料木黄酮、大豆黄素和黄豆黄素具有有利健康的作用，包括雌激素和抗氧化特性。
由于根据本发明的发酵，糖基化的异黄酮转化为相应的非糖基化异黄酮，其更为有益。例如，与未发酵的大豆相比，在发酵的大豆中染料木黄酮和大豆黄素的量增加。
可以按照在Franke A.A.等(1998)HPLC analysis of isoflavonoidsand other phenolic agents from foods and human fluids；Proceed.Soc.Exp.Biol.Med；217(3)，274-280中描述的HPLC法测量异黄酮的含量。
已显示可通过多种丝状真菌产生他汀，包括红曲霉属(Monascus)、曲霉属(Aspergillus)、青霉菌属(Penicillium)、侧耳属(Pleurotus)、腐菌属(Pythium)、菌寄生属(Hypomyces)、Paelicilomyces、正青菌属(Eupenicillium)和矛束孢(Doratomyces)。
优选真菌选自红曲霉菌(Monaseus fungi)并更优选选自红色红曲霉菌(Monascus ruber fungi)。
作为食品，用红色红曲霉菌(red Monascus fungus)发酵的大米(红米)在中国已公知并使用了上百年。作为食用色素和传统中医中的药物，红米曾用于并仍然用于葡萄酒的酿制。大多数可商购的红米不含他汀或他汀含量很低。(美国)食品药品管理局已经作出结论可商购的红曲米(red yeast rice)不含显著量的洛伐他汀(FDA，DocketNo.97-0441，Final Decision)。
WO 99/23996描述了用于治疗血清胆固醇和/或甘油三酯升高的组合物，其包括含有至少0.05wt％洛伐他汀的红米产品。
红米粉胶囊作为食品增补剂(dietary supplements)由Phannanex公司以Cholestin的品名出售。Phannanex还出售含有红曲米(Monascuspurperus went)的Cholestin条。
红米具有浓烈的红色。但是红米的浓烈的红色，当其用作色素时是优点，当其用于食品中时就是缺点。由于红米产品的浓烈的红色，由红米制备的食品随食品中添加的红米产品的量而被染成黄色、橙色或红色。食品中添加的红米的量越大，食品的红色越浓烈。
在某些食品中红色是不需要的。尤其是在西方国家，消费者不愿意使用那些与其通常的颜色不同的产品。例如当面包，薄烤饼，松饼，包括人造黄油、黄油、低脂酱在内的酱或色拉油是橙色或红色时，认为这些产品是不被消费者接受的。然而，同时我们发现这些种类的产品对于日常摄入足以取得降低血LDL-胆固醇效果的他汀量是极好的载体。
当把色彩分类时，其可分解成三个基本要素。一个是色调(颜色)，另一个是色值(亮度)及第三个是色度(饱和度，如鲜艳的颜色或暗淡的颜色)。为使任何一个人都能够精确地告诉其他的任何一个人他们所谈论的颜色，人们使用了通用代码。所使用的这种代码是L*a*b*。当在这个系统中表示颜色时，色值为L*，而色调和色度分别表示为a*和b*。L*a*b*可用Shimatzu的UV 1601分光光度计来测量。
优选食品具有小于20的色调a*值，优选小于10，最优选小于0。
优选的红曲霉他汀是红色红曲霉F125 M1-4(Monaseus ruber F125M1-4)。当这种他汀在大豆上生长时，其不具有红色。
他汀F125 M1-4于2001年1月23日保藏在Centraal Bureau voorSchimmelculturen(CBS)，保藏号为CBS 109269。
这些保藏物是根据布达佩斯条约中关于用于专利程序目的的微生物保藏的国际认可的规定及其条例(布达佩斯条约)制备的。
可以用这样的方式进行发酵，其可被本领域技术人员以WO02/064809和WO02/063976中描述的方法为基础来确认。
发酵温度可能很重要。温度优选在10至37℃的范围，更优选20至30℃。
优选在发酵期间，例如通过搅拌、摇动等使介质通风。可通过向发酵介质通入空气进行通风。如果使用固态发酵，优选用水蒸汽全部或部分饱和所述空气。这样避免了发酵介质干燥。
他汀的水平取决于发酵时间。发酵时间因此取决于所需要的他汀的量。优选发酵时间是1-50天，更优选15-40天，最优选20-30天(参见WO02/064809和WO02/063976)。


图1显示了不同他汀的结构示意图。
图2显示了用于超临界二氧化碳提取的实验装置的示意图。
实施例使用HPLC测定洛伐他汀通过以5∶1的比例将提取混合物加入到原料中来制备样品，所述提取混合物含有乙腈、水和磷酸(1∶1∶0.05，v/v/v)。通常用25ml提取混合物提取5g原料。样品在室温下培养1小时然后用Ulta-Turrax均质。均质后，样品在滚瓶机(roller bench)上在室温下培养过夜。样品以11000rpm离心分离10分钟并收集上清液用于HPLC分析。按照Morovjan等J.chromatogr.A 763(1997)165-172的方法用HPLC分离测定样品中洛伐他汀的量。
系统由Shimadzu SCL-10A系统控制器、CTO-10AS柱式加热炉、LC-10AT vp泵系统、RID-10A折射率检测器、SPD-M10A二极管阵列检测器和SIL-10AD自动注射器组成。为色谱法测定洛伐他汀，使用了Waters NovaPak C18(150×3.9mm I.D.，4μm)柱，在25℃下操作。洗脱液是乙腈、水和磷酸(1∶1∶0.05，v/v/v)溶液，以1.5ml/min流动。运行15分钟。使用二极管阵列检测器从190nm直至800nm进行检测。测量光谱中属于洛伐他汀的所有峰面积的和。对照标准品(Mevinolin，Sigma)计算洛伐他汀含量(用mg/g分析产物表示)。
实施例1-8制备发酵底物制备接种体将红色红曲霉F125 M1-4(Monascus ruber F125 M1-4)(CBS109269)涂于VMA-琼脂平板上并在30℃培养3天。用无菌手术刀把VMA-琼脂切成小正方形用于制备接种物。用无菌刮铲把琼脂块转移到液体介质中。麦芽水用于预培养。300ml介质装入500ml无菌烧瓶中。烧瓶在Innova 400摇瓶机中在25℃下培养2天。
发酵方法像大豆、四季豆、绿豆、羽扇豆种子、胡桃、玉米、燕麦和花生这样的底物在自来水(50℃)中浸泡60分钟。浸泡后，用冷自来水冲洗底物。然后在环境温度下将底物风干180分钟。浸泡并风干过的底物转移至摇瓶，每瓶大约50g。摇瓶通过高压釜灭菌(在120℃下10分钟)，用1ml充分生长的红曲霉培养菌接种并在25℃下培养适当长的时间(2-6周)。监控洛伐他汀的生成并且在达到足够的水平时，通过把烧瓶放置在培养器中在80℃下过夜使烧瓶巴氏法灭菌，其后可以获得最终产物。表1给出了对发酵3周后最终产物中他汀的含量的总结。
表1发酵3周后最终产物中他汀的含量

实施例9超临界提取发酵大豆为超临界提取天然固体基质，使用了Thar Designs，USA的设备和软件。在图2中以示意图的形式描述了实验装置。CO2泵能够以恒定的流速压缩液体二氧化碳至最高达600bars的压力。在静态混合器中，可将极性调节剂与液体二氧化碳混合。在进入提取容器之前，在预加热器(未示出)中加热二氧化碳以达到超临界条件。
在用双壁加热罩加热的提取容器中，超临界二氧化碳经过固体基质，以进行提取。
在提取容器下游，通过自动反压力调节器使超临界二氧化碳膨胀。所述反压力调节器与反馈控制单元相连以控制系统中的压力。在旋风分离系统中将二氧化碳与提取的物质(液体/固体)分离。二氧化碳在顶部离开旋风器，而提取的物质则保留在旋风器中。实验期间通过打开旋风器底部的阀门回收从固体基质中提取的液体。
通过另外的人工操作的反压力调节器使二氧化碳气体进一步膨胀。在二氧化碳以环境压力离开系统之前，反压力调节器下游的气体记录器(gas clock)记录下已有多少气体经过系统。
所述工艺设备设计为在下列条件下运行
表2超临界提取装置的工艺运行条件

提取之前，在水冷通用磨(M20型，IKA，德国)中研磨发酵的大豆，直到得到细粉。
用于提取的样品的量是100克磨碎的发酵的大豆。所述发酵并磨碎的大豆被投入提取容器并且用小玻璃珠(直径2mm)填充剩余体积。液体二氧化碳的流速为20g·min-1。在所附的旋风分离器中，收集提取的油。总提取时间为2小时。
提取后，打开提取容器，得到干燥的自由流动的大豆面粉。过筛除去加入的玻璃珠。分析等分量的大豆粉中的洛伐他汀的量。测定起始物质和提取的物质两者中的蛋白质、水分、脂肪和灰分的量。分析结果的例子示于表3。
表3超临界流体提取之前和之后的磨碎的发酵的大豆组合物

实施例10用己烷索式提取发酵的大豆对比实施例A用乙醇索式提取发酵的大豆将150g磨碎的发酵的大豆投入提取套管。加入800ml有机溶剂并且进行提取6小时。提取后，将提取套管从提取设备取下。倒空提取套管，得到的大豆粉在空气中干燥直至恒重。取等分量用于测定洛伐他汀的含量。测定起始物质和提取的物质两者中的灰分、蛋白质、脂肪和水分的量。分析结果示于表4。
表4红曲霉发酵的大豆的索式提取的结果

用超临界流体提取和用己烷提取，大豆脂肪都被有效去除，得到脱脂大豆粉(脂肪含量＜5wt.％)。另外，在这两种情况下在脱脂大豆粉中都仍然保留足够的洛伐他汀。由于乙醇去除脂肪不像己烷或超临界流体那样有效并且在提取的面粉中保留下来的他汀也较少，所以乙醇比较不合适。
实施例11用香蕉和橙子制备低脂燕麦薄烤饼一份量65g配方

制备在大碗中，混和燕麦片、未漂白面粉、大豆粉和发酵粉。加入豆奶，并迅速搅拌几下进行混和。拌入香蕉和橙子片。把0.25杯(65g)黄油倒入热的不粘煎锅或平底锅。烹调约2分钟或直至表面起泡。翻转薄烤饼并再烹调一分钟或直至加热完全。薄烤饼可以与例如枫糖浆、苹果沙司或果酱一起食用。
一份量65g，每份有2.6mg他汀。
实施例12低脂葡萄干面包的制备配方

制备在揉面机中充分混和所述成分。使该生面团醒面。在20℃的温度下使生面团发面30-60分钟。把发起的生面团放入面包烤模中。在190℃下烘焙面包30-60分钟。
一份量40g，每份的他汀量为2.2mg。
实施例13低脂橙子-香蕉松饼的制备配方

制备在碗中混和干成分。在碗中低速混和橙汁、香草、香蕉、蜂蜜和一半蛋清直至融合。加入干成分并混和数秒，恰至润湿并观察不到面粉。
搅打剩余的蛋清并搅进上述混合物。加入葡萄干。把杯形蛋糕纸衬(paper cupcake liners)装入松饼模中，并填充杯子至距顶部0.3英寸以内。在180℃下烘焙10-24分钟直至你可以轻轻触碰松饼顶部而不留下痕迹。
一份量75g，每份的他汀量6.5mg。
可以用全麦粉和/或通用粉部分替代含他汀的粉，这使得他汀的含量很容易变化。
实施例14低脂意大利面的制备配方

混和所述成分以形成意大利面。然后用制造机把意大利面制成长面条——像线。烹调意大利面5分钟。一份量80g，每份的他汀量为1mg。消费80g意大利面会使得血胆固醇预期降低5％。
权利要求
1.包含他汀的组合物，其特征在于所述组合物是包含低于10wt.％脂肪的面粉。
2.根据权利要求1的组合物，其包含低于5wt.％的脂肪。
3.根据权利要求2的组合物，其包含低于1wt.％的脂肪。
4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其包含至少0.01mg/g的他汀。
5.根据权利要求4的组合物，其包含至少0.1mg/g的他汀。
6.根据权利要求5的组合物，其包含至少1mg/g的他汀。
7.根据权利要求1-6中任一项的组合物在制备食品中的用途。
8.根据权利要求7的用途，其中所述食品是烘焙产品。
9.包含他汀的食品，其特征在于其包含低于10wt.％的脂肪。
10.根据权利要求9的食品，其色调a*值小于20，优选小于10，最优选小于0。
11.根据权利要求9或10的食品，其选自松饼、面包、薄烤饼和意大利面。
12.包含他汀的组合物的制备方法，其中所述组合物是包含低于10wt.％脂肪的面粉，并且所述方法包括以下步骤用产生他汀的真菌发酵底物，研磨底物，提取底物，及回收已提取的底物，由此，已提取的底物使得包含他汀的面粉含有的脂肪低于10wt.％。
13.根据权利要求12的方法，其中所述底物用己烷或超临界CO2提取。
14.根据权利要求12或13的方法，其中所述底物是大豆。
15.根据权利要求12-14中任一项的方法，其中所述产生他汀的真菌是红曲霉菌。
全文摘要
本发明公开了包含他汀的组合物和所述包含他汀的组合物在制备食品方面的用途，其中所述组合物是包含低于10wt％的脂肪的面粉。包含他汀的组合物的制备方法包括用产生他汀的真菌发酵底物的步骤和提取底物的步骤。
文档编号A21D2/14GK1946304SQ200580012633
公开日2007年4月11日 申请日期2005年3月23日 优先权日2004年4月28日
发明者C·M·贝恩多夫, W·M·梅杰, H·O·F·莫尔休詹 申请人:荷兰联合利华有限公司