一种美容去皱注射剂及其制备方法

专利名称：一种美容去皱注射剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种美容去皱注射剂及其制备方法，属于组织工程领域。
背景技术：
多年以来，在美容外科领域出现了许多软组织充填材料，目前国内外比较 常用的充填物有以下几类20年前被批准用在人体去皱和瘢痕治疗上的第一个 充填品就是牛胶原蛋白。1977年进行临床试用，1981年获FDA批准。这些牛胶 原在组织内存留期一般为6~9个月，所以维持时间较短，加之由于是异种蛋白， 常呈现局部过敏反应和并发症，如一过性反应有青肿、反应性疱疹、无菌性脓 肿等，严重的可能引起皮肤坏死和瘢痕增生。第二种比较常用的是取自病人自 体的皮肤经制备后获得的胶原制品，性能稳定，可阻抗酶的消化，常用于除去 精细的铍纹、皮面凹陷和隆唇术。注入后可维持18个月左右。其优点是不需要 作皮试，无过敏反应。缺点是要取自体组织、制备需要较长时间、价格较贵、 注射时疼痛明显、维持时间不长。第三种是成人真皮成纤维细胞，是取自患者 皮肤培养的成纤维细胞制成的， 一般是从耳后用3咖活检针取皮肤进行培养6 周后制成的注射剂，1 mL 1.5mL的患者自体的成纤维细胞供注射用。间隔2~3 周可重复注射3~4次甚至更多才能达到一定的效果。这是一种利用成人自体的 成纤维细胞进行治疗的方法，用以充填真皮、皮下缺损，也可对光化性、老化 性瘢痕造成的缺损进行充填。但其作用要在注射后3~4个月才能显效，可维持 2 3年。其缺点在于要取自体的皮肤组织细胞，患者有痛苦，有新的瘢痕产生, 由于是成体成纤维细胞，所以分裂次数少，繁殖速度慢，扩增时间长，需要多 次反复注射，注射后反应明显，常出现红肿、水肿、青紫、局部炎症、疼痛明 显、显效慢、效果不稳定，且对55岁以上的老人无法使用。第四种常用的是肉 毒毒素注射，其致命缺点是导致肌肉麻痹，从而使人的面部表情很不自然。其 他还有甲基丙烯酸多甲酯、透明质酸制剂和膨体聚四氟乙烯等注射剂用于去皱, 但因容易出现诸多反应且效果不理想而难以推广使用。

发明内容
为了克服以上所述各种产品的诸多缺陷与不足之处，本发明的目的是提供 一种新的无创、无痛、高效、快速、持久、无副作用、效果自然的美容去皱注 射产品。
本注射剂采用了新生儿脐带的真皮成纤维细胞与成纤维前体细胞或间充质 细胞经体外培养、纯化、扩增，然后制成一定浓度的注射剂，日后再注射到成 体自身的皱纹或瘢痕部位，这些新生儿脐带的真皮成纤维细胞与成纤维前体细 胞或间充质细胞在注射部位进行分裂、繁殖和分化，并产生大量新生的胶原蛋 白，祛除皱纹和填平瘢痕。还可以产生大量的细胞分化因子，可加速皮肤细胞 的生长、发育、修复和更新，真正达到美容养颜的目的。
本发明的另一个目的是提供这种注射剂的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用下技术方案
一种新型美容去皱注射剂，由1X105个 1X1()8个新生儿脐带真皮成纤维细
胞与成纤维前体细胞或间充质细胞和lml 8ml浓度0. 3%的利多卡因和浓度5% 的葡萄糖注射液组成。
所述的新生儿脐带真皮成纤维细胞与成纤维前体细胞或间充质细胞是由来 源于新生儿脐带的真皮成纤维细胞、来源于新生儿脐带的成纤维前体细胞、来 源于新生儿脐带的间充质细胞经体外培养、纯化、扩增得到的。
一种新型美容去皱注射剂的制备方法，是将来源于新生儿脐带的真皮成纤 维细胞与成纤维前体细胞或间充质细胞在体外培养、纯化、扩增，然后在液氮 中保存，用时再行大量扩增，并按照每lxl()S个 lxl08个新生儿脐带真皮成纤 维细胞与成纤维前体细胞或间充质细胞，加入lml 8mi浓度0.3%的利多卡因和 5%的葡萄糖注射液，制成混悬液。
本发明是一种利用新生儿脐带的真皮成纤维细胞与成纤维前体细胞或间充 质细胞经体外培养、纯化、扩增后，液氮保存，需要时再进行体外大量扩增后， 再注射到自体皱纹、瘢痕部位进行修复的美容去皱产品，该产品在这些注射部 位由成纤维前体细胞或间充质细胞分化为成熟的成纤维细胞，这些新生儿成纤 维细胞和新分化的新生儿成纤维细胞大量繁殖、分裂，并产生大量胶原蛋白， 起到平复皱纹和消除瘢痕的目的。同时这些新生儿成纤维细胞与成纤维前体细
胞或间充质细胞还可以产生许多细胞分化因子，可以促进皮肤细胞的生长、发 育、修复和更新，真正达到美容养颜的效果。
本发明的优点由于是自体新生儿脐带真皮成纤维细胞与成纤维前体细胞 或间充质细胞，所以，用于自身它不存在免疫排斥反应，能比较长期地存留于 体内，注射容易，不出现皮肤青肿、剌激性、炎症、迁移等。更为重要的是不 必取用成体皮肤，身体不产生痛苦和新的瘢痕，由于是新生儿脐带的真皮成纤 维细胞和成纤维前体细胞或间充质细胞，所以成活率高，增殖活性强，扩增时 间短，分裂次数多，还可以产生大量的胶原蛋白和许多细胞分化因子，可加速 皮肤细胞的生长、发育、修复和更新，而且无副作用。由于该注射剂含有浓度 0，3%的利多卡因，所以注射时无痛苦，美容去皱去瘢效果快速、显著、持久、 自然，维持时间很长，可真正达到美容养颜的目的。具有目前所有去皱方法不 可比拟的优势。
下面具体实施方式
对本发明作进一步说明
具体实施例方式
实施例1、 一种新型美容去皱注射剂的制备
一、 新生儿脐带皮肤组织的处理
取长度lcm~10Cm新生儿脐带，注射用生理盐水清洗3次，70%酒精进行表 面消毒，放入组织保存液(DMEM含10X胎牛血清，美国Hyclone公司)中。
二、 新生儿脐带皮肤组织真皮层的提取和处理
用5倍量无菌PBS (加入200U/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素)漂洗3 次，剪开脐带，去除脂肪，加入Dispase酶2ml，放置4。C过夜，将脐带皮肤和 血管表皮层剥离，留下脐带皮肤真皮层待用。
三、 新生儿脐带真皮成纤维细胞、成纤维前体细胞或间充质细胞悬液的制
备
1、 组织处理用上述5倍量无菌PBS冲洗脐带皮肤真皮层，将新生儿脐 带真皮组织放入35,10cm培养皿中，剪成lmii^左右的小块。
2、 组织消化加入200U/mi的胶原酶I lml 10ml， TTC放置10分钟~60
分钟，加入10%胎牛血清DMEM 1ml 10ml终止消化。
3、 细胞离心IOO目筛网过滤，收集细胞悬液放入离心管，Backman台式 温控离心机25。C， 1000rpm离心5min 10min,弃去上清液，收集细胞。
4、 原代细胞培养在离心管中加入低血清DMEM清洗1次，在离心管中加 入低血清真皮细胞培养液(美国Sigma公司)1ml 10ml吹悬，接种入1 X 35mm 培养皿或25ml细胞培养瓶中，5XC02培养箱，37"C培养。
5、 传代细胞培养每隔2天 3天换液1次，当细胞达到60%~80%时，用 无钙镁离子的PBS漂洗2次，加入含有0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液 消化lmin-3min，加入10%胎牛血清的DMEM培养基吹打终止消化，收集细 胞以l: 2的比例进行传代。
6、 细胞液氮冻存当传代细胞达到lxl06个 lxl()7个时，选择处于对数 生长期的细胞，在冻存前一天换液，将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0. 25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反 复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。然后将细胞收集于离心 管中离心(1000r/min， 10分钟)。去上清液加入含20%胎牛血清的完全培养基， 于4'C预冷15分钟后逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均 匀，细胞浓度为3Xl()6个 lX107个/mL之间。将上述细胞分装于专用冷冻塑料 管中，盖紧冷冻管盖子，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记(日期、 细胞种类及代次、冻存支数等，同时在电脑进行备份)。将装好细胞的冻存管 装入沙布袋内，置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。细胞冻存在 液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年或一年后，最好取出一只冻存 管进行细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。
7、 注射剂的配制需要时，从液氮罐中取出冷冻管，迅速放入38i:水浴中， 并不时摇动，在l分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。在1000r/min 速度下离心5 10分钟，弃去上清液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接 种浓度1X1()9个/L，置37。C C02温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培 养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入 瓶中，并加入培养基贴壁培养12小时 24小时后，充去上清，换入新鲜培养基
继续培养。在培养2周 6周后按照每1><1()5个 ^108个新生儿脐带真皮成纤维 细胞、成纤维前体细胞和成纤维干细胞，加入lml 8ml浓度03X的利多卡因和 5%的葡萄糖注射液，制成悬浊液。
四、产品检测
1、 细菌检测按照《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌 试验规程》A/B项进行，结果应符合无菌要求。
2、 病毒检测取处于对数生长期的细胞悬液lml，'送当地"三级甲等"及以 上医院或传染病院或政府防疫机构进行HIV和肝炎病毒检测，结果应确定为无 病毒细胞。
3、 外观检测本品应为淡白色或淡黄色混悬液。
4、 免疫反应检测取处于对数生长期的细胞悬液0.1ml对受术者进行皮下 试验，具体操作可参照青霉素皮试的方法进行。免疫反应检测应为阴性。
五、产品运输
产品的存储和运输应符合以下条件
1、温度2。C 10。C。 2、湿度10%~90%。 3、压力常压。4、光线避 光。5、气体无污染的常态空气。6、试剂避开有毒、有害、腐蚀性试剂。7、 振动平稳无震动。8、方向向上，不可倒置。
实施例2、临床报告
一、 病例标准
1、 选择标准
1)年龄20岁以上及65岁以下(含65岁)。2)男性和女性均可。3)非 孕正常女性。4)正常男性。5)皱纹额头皱纹、眼角皱纹、口周皱纹、颈部 皱纹、躯体皱纹和四肢皱纹。6)瘢痕粉剌瘢痕、水痘瘢痕、创伤瘢痕。
2、 排除标准
1)年龄65岁以上老人。2)有自身免疫性疾病患者。3)怀孕期妇女。4) 各种皮肤病患者。5)各种传染病患者。6)其他疾病患病期间的患者。
二、 注射剂制备依照实施例1的方法进行。
三、 应用
1、 治疗前检查血常规、尿常规、大便常规检查；肝功和肾功检查；HIV 和乙肝两对半检査。
2、 心理安慰消除患者紧张，积极配合治疗。
3、 皮肤消毒用70%酒精消毒患部皮肤。
4、 皮肤麻醉患部皮肤表面用2. 5%利多卡因和2. 5%的丙氨卡因软膏麻醉。
5、 注射剂准备:将0. lml lmi细胞悬液吸入无菌一次性lml注射器中备用。
6、 取2.2 11长的4.5号针头，采用多点斜面注射的方式，其针头与患部皮 肤的角度为10度 50度之间，将细胞悬液注入到真皮层的上中层，每个注射部 位选取5点 30点，每点注射细胞悬液5ul 150ul。注射完成后用冰袋外敷30 分钟 3小时。
7、 注射后当天，注射局部可能会有轻微肿胀和麻木感，不需特殊处理。无 全身反应。
8、 注射次数 一般皱纹注射1 2次即可，较大皱纹或瘢痕注射2 3次即可。
9、 注射间隔时间每次注射间隔时间为1周 5周。 一般为10天 14天。
四、 注射后护理
1、 注射完成后用冰袋外敷30分钟 3小时。
2、 观察局部情况和全身情况。
3、 避免日光直接照晒。
4、 注射后72小时以内，禁止在注射部位进行各种按摩和使用刺激性化妆
n
叩o
5、 避免面部皮肤干燥。
6、 注射后每天口服维生素C三次，每次500mg (6个月)。也可使用含维 生素C的化妆品(8个月)。
权利要求
1、 一种新型美容去皱注射剂，其特征在于该注射剂由lxl()S个 1xl08个新生儿脐带真皮成纤维细胞与成纤维前体细胞或间充质 细胞和lm! 8ml浓度03%的利多卡因和5%的葡萄糖注射液组 成。
2、 根据权利要求l所述的一种新型美容去皱注射剂，其特征在 于所述的新生儿脐带真皮成纤维细胞和成纤维前体细胞或间充 质细胞是由来源于新生儿脐带的真皮成纤维细胞、新生儿脐带的 成纤维前体细胞或新生儿脐带的间充质细胞经体外培养、纯化、 扩增得到的。
3、 一种新型美容去皱注射剂的制备方法，其特征在于该方法是将来源于新生儿脐带的真皮成纤维细胞和成纤维前体细胞或间充 质细胞在体外培养、纯化、扩增，然后在液氮中保存，用时再行 大量扩增，并按照每^105个~1><108个新生儿脐带真皮成纤维细 胞和成纤维前体细胞或间充质细胞，加入1ml 8ml浓度0.3%的 利多卡因和5%的葡萄糖注射液，制成混悬液。
全文摘要
本发明涉及一种新型美容去皱注射液及其制备方法，属于组织工程领域。该注射剂由1×10⁵个～1×10⁸个新生儿脐带真皮成纤维细胞与成纤维前体细胞或间充质细胞和1ml～8ml浓度0.3％的利多卡因和浓度5％的葡萄糖注射液组成。其制备方法是将来源于新生儿脐带的真皮成纤维细胞和成纤维前体细胞或间充质细胞经体外培养、纯化、扩增，然后在液氮中保存，用时再行大量扩增，并按照每1×10⁵个～1×10⁸个新生儿脐带真皮成纤维细胞与成纤维前体细胞或间充质细胞，加入1ml～8ml浓度0.3％的利多卡因和浓度5％的葡萄糖注射液，制成混悬液。本发明的优点是使用的材料是新生儿脐带，对成体毫无损伤，细胞成活率高，增殖活性强，扩增时间短，无副作用，注射时无疼痛，美容去皱效果快速、显著、持久，自然。
文档编号C12N5/08GK101120909SQ20061004317
公开日2008年2月13日 申请日期2006年7月18日 优先权日2006年7月18日
发明者军 李 申请人:军 李