专利名称：猪附红细胞体pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，尤其涉及猪附红细胞体PCR检测方法。
背景技术：
附红细胞体病是附红细胞体寄生在人或多种动物的红细胞表面、血浆和骨髓而引起的一种人畜共患病。过去国际上将附红细胞体列为立克次氏体，但是近年来根据16S rRNA基因序列分析，附红细胞体在分类上更接近于支原体属(Mycoplasma)。猪附红细胞体(Eperythrozoon suis，E.suis)是一种寄生于猪红细胞表面或游离于血浆的病原体，可引起新生仔猪和断奶仔猪虚弱和贫血，肥育猪生长缓慢，母猪繁殖障碍、受胎率低、不发情、流产和死胎等综合性症状，严重威胁着畜牧业的发展和人类健康。目前已经造成了巨大的经济损失，并呈范围扩大趋势，因而引起国内外学者的广泛关注。临床上该病的诊断方法主要以直接镜检为主，其中包括鲜血压片和涂片染色，但是假阳性率高。动物实验方法是确诊的手段，但所费时间太长，费用高。血清学方法包括间接血凝试验(IHA)、补体结合试验(CFT)或酶联免疫吸附试验(ELISA)等，由于附红细胞体病的抗体变化起伏较大，这些方法也不适用于该病诊断。Gwaltney等(1993)根据猪附红细胞体基因文库KSU一2克隆的序列资料，设计合成引物，首次建立了E.suis的PCR诊断方法。Messick等(1999)根据猪附红细胞体Illinois株16S rRNA基因的序列资料，设计合成了猪附红细胞体种特异性引物ES-f1、ES-f2、ES-r1、ES-r2，这些引物可以特异性地扩增出猪附红细胞体16S rRNA的基因片段，但是不能扩增到亲缘较近的几种支原体的基因片段。由此可见基于16S rRNA基因的PCR方法有很强的特异性。
发明内容
本发明提供一种猪附红细胞体的PCR检测方法，通过以下技术方案实现1.设置PCR检测试剂盒，该试剂盒包括(1)PCR试剂管试剂管内含10×缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，引物1，引物2，MgCl2，其中引物1和引物2分别具有SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2所示的核苷酸序列
引物1(SEQ ID NO1)5’＞CGAGCATTATCCGGATTTATTG＜3’引物2(SEQ ID NO2)5’＞ACATGCTCCACCACTTGTTCAG＜3’(2)阳性对照该对照为含有目的基因片段的重组质粒，是将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒，该质粒含猪附红细胞体403bp基因片段，具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列cgagcattat ccggatttat tgggcgtaaa ggaagcgtag gctgaagtgt gtatccattg 60ttaaaagtac ttgcttaaca agtgttcgcg gtggagatta cacttctaga attagttaga120gggcactgga attcaatgtg tagtggtgga atacgtagat atattgagga acaccagagg180ctaaggcgag tgcctgggac ataattgacg ctgaggcttg aaagcgtggg tagcaaatgg240gattagatac cccagtagtc cacgccgtaa acgatgggta ttagtcattt gaatttaagt300tgagtgatgt agctaacgcg ttaaataccc cgcctgggta gtatatatgc aaatatgaaa360ctcaaagaaa ttgacgggga cctgaacaag tggtggagca tgt 403(3)阴性对照，该对照为双重蒸馏水；(4)Taq DNA聚合酶；(5)GoldView DNA染料；(6)溴酚蓝上样缓冲液(常规浓度)。
2.操作程序(1)被检样品DNA提取取200μl无菌抗凝血液，Trizol试剂裂解后常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA TE)溶解，4℃保存备用；(2)PCR扩增在PCR检测试剂管中加入处理后的DNA样品，同时设阴阳性对照，每管加入Taq酶不少于0.2μl，混匀后稍离心，置PCR仪进行扩增，PCR反应循环条件95℃ 5min，94℃ 60s，60℃ 30s，72℃ 60s，共35循环，最后在72℃后延伸7min。
(3)扩增产物分析将PCR产物进行琼脂糖电泳，被检样品孔出现的电泳带与阳性对照和阴性对照比对，以判定样品为猪附红细胞体阳性或阴性。
发明的优点是提供了一种检测猪附红细胞体的标准方法，可快速、准确地检测出被检样品中的附红细胞体，也可用于猪附红细胞体病的分子流行病学调查及疗效监测。本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，常规的方法需经溶菌酶、蛋白酶K、SDS(十二烷基硫酸钠)、CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)等试剂处理，时间长费用高。本方法建立在分子生物学的基础上，可排除镜检时细菌和杂质颗粒的干扰，从而大大提高诊断准确率，降低假阳性率。
图1为本发明方法获得的产物进行琼脂糖电泳结果。
图2为应用本发明进行附红细胞体病的流行病学调查结果。
具体实施例本发明结合实施例作进一步说明。
实施例一1.样品的采集严格无菌采集可疑病猪的血样不少于500μl，4℃或冷冻保存；2.被检样品DNA提取取200μl无菌抗凝血液，加入100μl Trizol试剂，充分混匀后加入等体积的Tris饱和酚/氯仿混合液抽提，上清用2倍体积的无水乙醇沉淀2小时，70％的乙醇洗涤后干燥，沉淀用10-20μl TE缓冲液溶解后，4℃保存备用；3.设置PCR检测试剂盒，该试剂盒包括(1)PCR试剂管试剂管内含10×buffer，dNTP，引物1和引物2，MgCl2，其中引物1和引物2分别是按下述碱基序列由DNA合成仪合成的DNA片段引物15’＞CGAGCATTATCCGGATTTATTG＜3’引物25’＞ACATGCTCCACCACTTGTTCAG＜3’(2)阳性对照该对照为含有目的基因片段的重组质粒，是将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒，该质粒含猪附红细胞体403bp基因片段，具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
(3)阴性对照，该对照为双重蒸馏水；(4)Taq酶；(5)GoldView DNA染料；(6)溴酚蓝上样缓冲液(常规浓度)。
4.PCR扩增在每个PCR检测试剂管中加入提取的DNA样品2μl，加入Taq酶0.2μl，同时设阴阳性对照。混匀后稍离心，置PCR仪进行扩增，PCR反应循环条件95℃ 5min，94℃ 60s，60℃ 30s，72℃ 60s，共35循环，最后在72℃后延伸7min。
5.扩增产物分析将琼脂糖溶于电泳缓冲液中，然后每100ml中加入5μl GoldView DNA染料，混匀后制胶。将样品扩增产物与溴酚蓝上样缓冲液混合，用微量移液器将样品依次加入加样孔内，恒压电泳。电泳完成后，放在透射紫外灯下观察，将样品孔出现的电泳带与阳性对照和阴性对照比对，判定被检样品为猪附红细胞体阳性或阴性。结果参见图1，其中1为阳性对照，2为阴性对照，3为被检样品阴性，4、5为被检样样品阳性。
实施例二方法基本同实施例一，随机无菌采集猪血样，提取DNA，PCR扩增，结果参见图2，其中1为阳性对照，2为阴性对照，4、5、12、14、18为被检样品阴性，3、6、7、8、9、10、11、13、15、16、17为被检样样品阳性。阳性率为68.75％。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明涉及的序列<120>猪附红细胞体PCR检测方法<160>3<170>DNA Star 5.0<210>1<211>22<212>DNA<213>猪附红细胞体(Eperythrozoon suis)<220>
<221>RRNA<400>1cgagcattat ccggatttat tg 22<210>2<211>22<212>DNA<213>猪附红细胞体(Eperythrozoon suis)<220>
<221>RRNA<400>2acatgctcca ccacttgttc ag 22<210>3<211>403<212>DNA<213>猪附红细胞体(Eperythrozoon suis)<220>
<221>RRNA<400>3cgagcattat ccggatttat tgggcgtaaa ggaagcgtag gctgaagtgt gtatccattg60ttaaaagtac ttgcttaaca agtgttcgcg gtggagatta cacttctaga attagttaga120gggcactgga attcaatgtg tagtggtgga atacgtagat atattgagga acaccagagg180ctaaggcgag tgcctgggac ataattgacg ctgaggcttg aaagcgtggg tagcaaatgg240gattagatac cccagtagtc cacgccgtaa acgatgggta ttagtcattt gaatttaagt300tgagtgatgt agctaacgcg ttaaataccc cgcctgggta gtatatatgc aaatatgaaa360ctcaaagaaa ttgacgggga cctgaacaag tggtggagca tgt40权利要求
1.猪附红细胞体PCR检测方法，其特征是通过以下技术方案实现(1)被检样品DNA提取取200μl无菌抗凝血液，Trizol试剂裂解后常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，4℃保存备用；(2)设置PCR检测试剂盒由PCR试剂管、阳性对照、阴性对照、Taq酶、GoldView DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液组成，其中，PCR试剂管含10×缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物1、引物2及MgCl2，引物1和引物2具有的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列SEQ ID NO 15’＞CGAGCATTATCCGGATTTATTG＜3’SEQ ID NO 25’＞ACATGCTCCACCACTTGTTCAG＜3’；(3)PCR扩增在PCR试剂管中加入处理后的样品DNA，同时设阴、阳性对照，每管加入Taq酶不少于0.2μl，混匀后稍离心，置PCR仪进行扩增，PCR反应循环条件为95℃5min，94℃60s，60℃30s，72℃60s，共35循环，最后在72℃后延伸7min；(4)扩增产物分析将PCR产物进行琼脂糖电泳，被检样品孔出现的电泳带与阳性对照和阴性对照比对，以判定样品为猪附红细胞体阳性或阴性。
2.根据权利要求1所述的猪附红细胞体PCR检测方法，其特征是所述步骤(3)中阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，通过将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒，该质粒含猪附红细胞体403bp基因片段，具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的猪附红细胞体PCR检测方法，其特征是所述步骤(3)中阴性对照为双重蒸馏水。
全文摘要
本发明提供一种猪附红细胞体PCR检测方法，所用试剂包括PCR检测试剂盒，及含有目的基因片段重组质粒的阳性对照、阴性对照、Taq酶、GoldView DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液，通过被检样品DNA提取、PCR扩增及扩增产物分析达到检测目的。本发明提供的方法可快速、准确地检测出被检样品中的附红细胞体，也可用于猪附红细胞体病的分子流行病学调查及疗效监测。本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，可排除镜检时细菌和杂质颗粒的干扰，从而大大提高诊断准确率，降低假阳性率。
文档编号C12Q1/68GK1850991SQ200610049619
公开日2006年10月25日 申请日期2006年2月27日 优先权日2006年2月27日
发明者杜爱芳, 侯玉慧, 赵现锋 申请人:浙江大学