专利名称：海产甲壳类寄生血卵涡鞭虫的pcr检测方法
技术领域：
本发明公开了一种对海产甲壳类动物寄生血卵涡鞭虫的PCR检测方法，适用于梭子蟹、锯缘青蟹、海水龙虾、日本蟳等海产甲壳类血卵涡鞭虫病的检测，属于水产养殖动物疾病的检测技术。
背景技术：
血卵涡鞭虫(Hematodinium)是一类危害海水甲壳动物的重要病原性寄生虫，具有很强的致病性，可引起挪威龙虾(N.norvegicus)、兰蟹(C.Sapidus)、白氏雪蟹(C.bairdi)以及蛛雪蟹(C.opilo)等许多重要经济甲壳类发病，并导致规模性死亡，由于其宿主和流行范围广、死亡率高、危害非常严重。2005年我们首次从养殖梭子蟹中发现该寄生虫病原，并进一步证实其是引起养殖梭子蟹规模性死亡重大疾病“牛奶病”的主要病原之一，继后又在养殖锯缘青蟹、海捕日本蟳等其他海产甲壳类当中检测到该寄生虫病原。至今尚缺少该寄生虫病原研究报道，对该寄生虫的许多基础研究尚属空白，特别是缺少有关该寄生虫的检测技术，为该寄生虫疾病的预防和控制带来了困难。
发明内容
为克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种血卵涡鞭虫的PCR检测方法，以实现对血卵涡鞭虫的准确检测，为预防和控制该病的发生，为健康养殖提供科学的依据。PCR是一种具有敏感性高、特异性强的靶DNA的快速检测方法，能实现病原的快速、正确检测，样品中即使含有少量的病原DNA，即能检出。
为了实现上述本发明的目的，本发明所建立的血卵涡鞭虫PCR检测方法包括下列步骤1)样品处理取检测样品肌肉组织100～500mg，用0.7～1mL试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；每分钟10000～12000转离心2～5min；或取检测样品血淋巴300μL，每分钟8000转离心5min；弃上清，用500μL试剂A悬浮样品。
2)DNA提取取500μL上述样品处理液，加入100μL试剂B混匀，在55℃浴中保温30～120min，期间不断混匀；加入等体积的酚/氯仿抽提，每分钟12000转离心10min，取上清并加入上清体积2倍的无水乙醇沉淀DNA，室温放置5～10min；每分钟12000转离心5～10min；弃上清，75％乙醇洗涤沉淀1～2次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于30～50μL灭菌双蒸水中，即为DNA提取液，-20℃保存备用。
3)反应体系在PCR试剂管中加入0.5～1μL上述的DNA提取液，每管加入2.5U/μL的Taq酶0.5～1.0μL，每分钟3000～5000转离心2～5s混匀，置于PCR试管内进行扩增。
4)扩增条件通过94℃解链5min；然后94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，如此进行循环35次；最后72℃延伸10min，得扩增物。
5)PCR扩增物分析取5～10μL扩增后的样品，与1～4μL 0.25％(w/v)溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.5μg/mL溴化乙锭的1％(w/v)琼脂糖中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察。
6)判断标准若样品孔有一条586bp核酸条带为有血卵涡鞭虫感染或污染的阳性样品，没有显示该核酸条带为阴性未感染。
其中所述的试剂A成分为0.5M NaCl，50mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)；试剂B成分为20mg/mL蛋白酶K、10％SDS；PCR试剂管成分为2.5～5.0μL 10 x buffer，2.0～4.0μL dNTP(为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度2.5mM)，1.5～3.0μL25mM MgCl2，0.25～0.5μL 25μM引物1，0.25～0.5μL 25μM引物2，17.5～35μL灭菌去离子水。
PCR试剂成分最佳组成为5.0μL 10 x buffer，1μL 2.5U/ul Taq酶，4.0μLdNTP，3.0μL 25mM MgCl2，0.5μL 25μM引物1，0.5μL 25μM引物2，35μL灭菌去离子水其中dNTP为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度2.5mM。
所述的上游引物1和下游引物2分别是由DNA合成仪按碱基序列为上游引物15’-CTGATTACGTCCCTGCCCTT-3’；下游引物25’-GCATGTCGCTGCGTTCTTC-3’合成的DNA片段。
本发明原理为试剂A和B将样品中的血卵涡鞭虫进行裂解，释放出虫体DNA，PCR反应试剂管含多聚酶链式反应试剂，通过试剂管中所含的血卵涡鞭虫特异DNA片段引物和Taq酶等成份，对样品中释放出的DNA进行特异性的扩增。由于本发明的引物为血卵涡鞭虫所特有，因此，如果样品中含有血卵涡鞭虫，那么它的DNA的特异片段在经过扩增后，浓度将达到108mol(克分子)以上，在电泳和溴乙锭染色后，紫外光检测就可以探测到一定分子量的目的条带。如果没有血卵涡鞭虫，则不能扩增到同样分子量的目的条带。
本发明选择特异引物并确立血卵涡鞭虫PCR检测技术，具有如下优点和积极效果1.本发明方法检测十分快速，4～8h即可得知检测结果，而其它方法则至少需要1天或一个星期以上。
2.本发明选择引物为针对ITS特异性引物，相比18S rRNA具有更强的特异性，进一步提高检测的准确性和灵敏度，检测下限低至1～10个左右的虫体。
3.本发明可以应用于多种样品的检测，可以检测所有海水甲壳类动物(包括梭子蟹、锯缘青蟹等)遭受血卵涡鞭虫感染的情况，还可以检测养殖饲料和鲜活饵料是否遭受血卵涡鞭虫污染，应用广泛，保证了健康养殖的需要。
具体实施例方式
实施例1按以下方法配制检测血卵涡鞭虫试剂1)试剂A成分为0.5M NaCl，50mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)；2)试剂B成分为20mg/mL蛋白酶K、10％SDS；3)PCR试剂管成分为2.5μL 10 x buffer，2.0μL dNTP(为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度2.5mM)，1.5μL 25mM MgCl2，0.25μL 25μM引物1，0.25μL 25μM引物2，17.5μL灭菌去离子水。
4)2.5U/μL Taq酶；5)含0.5μg/mL溴化乙锭的1.0％(g/mL)的琼脂糖；
6)0.25％(g/ml)溴酚蓝上样缓冲液；按以下步骤进行检测(1)样品处理取蟹肌肉组织100mg，用0.7mL试剂A悬浮样品，匀浆器匀浆。
(2)DNA提取取500μL组织匀浆，再加入100μL试剂B混匀，在55℃浴中保温30min，期间不断混匀；加入等体积的酚/氯仿抽提，每分钟12000转离心10min；取上清并加入上清体积2倍的无水乙醇沉淀DNA，室温放置10min；每分钟12000转离心10min；弃上清，75％乙醇洗涤沉淀1～2次，让乙醇彻底挥发，将其沉淀溶于30μL灭菌双蒸水中，即为DNA提取液，-20℃保存备用。
(3)在PCR试剂管中加入0.5μL的DNA提取液，每管加入2.5U/μL的Taq酶0.5μL，每分钟3000转离心2s混匀，置于PCR仪内进行扩增；通过94℃解链5min；然后94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，如此进行循环35次；最后72℃延伸10min，得扩增物。
(4)PCR扩增物分析取5μL扩增后的样品，与1μL 0.25％溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.5μg/mL溴化乙锭的1.0％(g/mL)的琼脂糖中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，如果所有样品孔均出现一条586bp核酸条带，说明样品有血卵涡鞭虫感染或污染。(其中电泳液组成、电泳方法及染色方法参考分子克隆实验指南(第二版)，p307，p309-313，p314。)实施例2按以下方法配制检测血卵涡鞭虫试剂1)试剂A成分为0.5M NaCl，50mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)；2)试剂B成分为20mg/mL蛋白酶K、10％SDS；
3)PCR试剂管成分为5.0μL 10 x buffer，4.0μL dNTP(为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度2.5mM)，2.5μL 25mM MgCl2，0.5μL 25μM引物1，0.5μL 25μM引物2，35μL灭菌去离子水。
4)2.5U/μL Taq酶；5)含0.5μg/mL溴化乙锭的1.0％(g/mL)的琼脂糖；6)0.25％(g/mL)溴酚蓝上样缓冲液；按以下步骤进行检测(1)样品处理取蟹肌肉组织300mg，用1.0mL试剂A悬浮样品，匀浆器匀浆。
(2)DNA提取取500/μL组织匀浆，再加入100μL试剂B混匀，在55℃浴中保温75min，期间不断混匀；加入等体积的酚/氯仿抽提，每分钟12000转离心10min；取上清并加入上清体积2倍的无水乙醇沉淀DNA，室温放置10min；每分钟12000转离心10min；弃上清，75％乙醇洗涤沉淀1～2次，让乙醇彻底挥发，将其沉淀溶于40μL灭菌双蒸水中，即为DNA提取液，-20℃保存备用。
(3)在PCR试剂管中加入1μL的DNA提取液，每管加入2.5U/μL的Taq酶0.5μL，每分钟4000转离心3.5s混匀，置于PCR仪内进行扩增；通过94℃解链5min；然后94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，如此进行循环35次；最后72℃延伸10min，得扩增物。
(4)PCR扩增物分析取8μL扩增后的样品，与4μL 0.25％溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.5μg/mL溴化乙锭的1.0％(g/mL)的琼脂糖中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，如果所有样品孔均出现一条586bp核酸条带，说明样品有血卵涡鞭虫感染或污染。(其中电泳液组成、电泳方法及染色方法参考分子克隆实验指南(第二版)，p307，p309-313，p314。)实施例3按以下方法配制检测血卵涡鞭虫试剂1)试剂A成分为0.5M NaCl，50mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)；2)试剂B成分为20mg/mL蛋白酶K、10％SDS；3)PCR试剂管成分为5.0μL 10 x buffer，4.0μL dNTP(为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度2.5mM)，3.0μL 25mM MgCl2，0.5μL 25μM引物1，0.5μL 25μM引物2，35μL灭菌去离子水。
4)2.5U/μL Taq酶；5)含0.5μg/mL溴化乙锭的1.0％(g/mL)的琼脂糖；6)0.25％(g/mL)溴酚蓝上样缓冲液；按以下步骤进行检测(1)样品处理取蟹肌肉组织500mg，用1mL试剂A悬浮样品，匀浆器匀浆。
(2)DNA提取取500μL组织匀浆，再加入100μL试剂B混匀，在55℃浴中保温120min，期间不断混匀；加入等体积的酚/氯仿抽提，每分钟12000转离心10min；取上清并加入上清体积2倍的无水乙醇沉淀DNA，室温放置10min；每分钟12000转离心10min；弃上清，75％乙醇洗涤沉淀1～2次，让乙醇彻底挥发，将其沉淀溶于50μL灭菌双蒸水中，即为DNA提取液，-20℃保存备用。
(3)在PCR试剂管中加入1μL的DNA提取液，每管加入2.5U/μL的Taq酶1.0μL，每分钟5000转离心5s混匀，置于PCR仪内进行扩增；通过94℃解链5min；然后94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，如此进行循环35次；最后72℃延伸10min，得扩增物。
(4)PCR扩增物分析取10μL扩增后的样品，与2μL 0.25％溴酚蓝上样缓冲液混合，在含1.0μg/mL溴化乙锭的1％(g/mL)的琼脂糖中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，如果所有样品孔均出现一条586bp核酸条带，说明样品有血卵涡鞭虫感染或污染。(其中电泳液组成、电泳方法及染色方法参考分子克隆实验指南(第二版)，p307，p309-313，p314。)实施例4按以下方法配制检测血卵涡鞭虫试剂1)试剂A成分为0.5M NaCl，50mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)；2)试剂B成分为20mg/mL蛋白酶K、10％SDS；3)PCR试剂管成分为5.0μL 10 x buffer，4.0μL dNTP(为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度2.5mM)，3.0μL 25mM MgCl2，0.5μL 25μM引物1，0.5μL 25μM引物2，35μL灭菌去离子水。
4)2.5U/μL Taq酶；5)含0.5μg/mL溴化乙锭的1.0％(g/mL)的琼脂糖；6)0.25％(g/ml)溴酚蓝上样缓冲液；按以下步骤进行检测(1)样品处理取检测样品血淋巴300μL，每分钟8000转离心5min；弃上清，用500μL试剂A重新悬浮沉淀。
(2)DNA提取加入100μL试剂B，55℃浴中保温30min，期间不断混匀；加入等体积的酚/氯仿抽提，每分钟12000转离心10min；取上清并加入2倍体积的无水乙醇，沉淀DNA，室温放置10min；每分钟12000转离心10min；弃上清，75％乙醇洗涤沉淀1～2次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于50μL灭菌双蒸水中，即为DNA提取液，-20℃保存备用。
(3)PCR扩增在PCR试剂管中加入1μL的DNA提取液，每管加入2.5U/μL Taq酶1.0μL，每分钟4000转离心3s混匀，置PCR仪进行扩增。通过94℃解链5min；然后94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，如此进行循环35次；最后72℃延伸10min，得扩增物。
(4)PCR扩增物分析取5μL扩增后的样品，与1μL 0.25％溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.5μg/mL溴化乙锭的1％(g/mL)的琼脂糖中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，如果样品孔有一条586bp核酸条带，说明样品有血卵涡鞭虫感染或污染。(其中电泳液组成、电泳方法及染色方法参考分子克隆实验指南(第二版)，p307，p309-313，p314。)
权利要求
1.一种海产甲壳动物类寄生血卵涡鞭虫的PCR检测方法，其特征在于包括下列操作步骤1)样品处理取检测样品肌肉组织100～500mg，用0.7～1mL试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；每分钟8000～12000转离心2～5min；或取检测样品血淋巴300μL，每分钟8000转离心5min；弃上清，用500μL试剂A悬浮样品。2)DNA提取取500μL上述样品处理液，加入100μL试剂B混匀；再在55℃水浴中保温30～120min，其间不断混匀；加入等体积的酚/氯仿抽提，每分钟12000转离心10min；取上清并加入上清体积2倍的无水乙醇沉淀DNA；室温放置5～10min，每分钟10000～12000转离心5～10min；弃上清，75％乙醇洗涤沉淀1～2次，让乙醇彻底挥发，将其沉淀溶于30～50μL灭菌双蒸水中，即为DNA提取液，-20℃保存备用。其中所述的试剂A成分为0.5M NaCl，50mM Tris，10mM EDTA；Tris和EDTA pH均为8.0；试剂B成分为20mg/mL蛋白酶K、10％SDS；3)PCR在PCR试剂管中加入0.5～1μL上述的DNA提取液，每管加入2.5U/μL的Taq酶0.5～1.0μL，每分钟3000～5000转离心2～5s混匀，置于PCR试管内进行扩增；通过94℃解链5min；然后94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，如此进行循环35次；最后72℃延伸10min，得扩增物。其中所述PCR试剂管成分为2.5～5.0μL 10×buffer，2.0～4.0μL dNTP(为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度2.5mM)，1.5～3.0μL 25mM MgCl2，0.25～0.5μL 25μM引物1，0.25～0.5μL 25μM引物2，17.5～35μL灭菌去离子水；所述的上游引物1和下游引物2分别是由DNA合成仪按碱基序列为上游引物15’-CTGATTACGTCCCTGCCCTT-3’；下游引物25’-GCATGTCGCTGCGTTCTTC-3’合成的DNA片段。4)PCR扩增物分析取5～10μL扩增后的样品，与1～4μL0.25％(w/v)溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.5μg/mL溴化乙锭的1.0％(w/v)琼脂糖中进行电泳和显色，在透射紫外灯下观察，样品孔有一条586bp核酸条带，为有血卵涡鞭虫感染或污染的阳性样品。
2.根据权利要求1所述一种海产甲壳动物类寄生血卵涡鞭虫的PCR检测方法其特征在于PCR试剂成分最佳组成为5.0μL 10×buffer，1μL2.5U/μLTaq酶，4.0μL dNTP，3.0μL 25mM MgCl2，0.5μL 25μM引物1，0.5μL 25μM引物2，35μL灭菌去离子水；其中dNTP为dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸的混合物，每种浓度2.5mM。
全文摘要
本发明公开了一种海产甲壳动物类寄生血卵涡鞭虫的PCR检测方法，属于水产养殖动物疾病的检测技术，包括由样品处理试剂A和B、PCR试剂管、Taq酶、普通琼脂糖、溴化乙锭溶液、溴酚蓝上样缓冲溶液组成的PCR检测试剂的配置以及PCR、PCR扩增物分析等一套检测操作程序。本发明在PCR反应的基础上，进行电泳和溴化乙锭染色，可快速、准确、敏感地检测出供检样品中的血卵涡鞭虫，为水产养殖动物的健康养殖提供有效的检测技术。
文档编号C12Q1/68GK101067154SQ20071006770
公开日2007年11月7日 申请日期2007年3月16日 优先权日2007年3月16日
发明者许文军, 施慧, 李鹏飞, 徐汉祥 申请人:浙江省海洋水产研究所