专利名称：准确鉴定鲶和大口鲶的试剂盒及其鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种准确和批量鉴定鲶(Silurus asotus)和大口鲶的试剂盒，以及使用该试剂盒鉴定鲶和大口鲶(Silurus meridionalis)的方法。
背景技术：
鲶和大口鲶在分类上都属于鲶属(Silurus)鱼类，鲶是世界上的广布种类，而大口鲶主要分布在我国长江、闽江、湘江等水系，一般有大口鲶分布的水系都有鲶分布。成体时鲶(S.asotus)的个体比大口鲶(S.meridionalis)小很多，可通过个体大小和外部特征区分它们。然而，在种苗阶段，一般在250g以下，两种鲶鱼形态极相似，仅凭外形特征很难将它们正确区分开，即便是很有经验的鱼类分类学工作者也难以正确鉴定它们。所以，急需建立准确的鉴定技术，让非专业人员也能准确鉴定两种鲶。近年来，分子鉴定(尤其是PCR)技术已开始在鱼类分类中应用，为了准确鉴定两种鲶，有必要建立PCR鉴定技术和研制PCR鉴定试剂盒。通过RAPD技术在鲶和大口鲶筛选到一差异条带，对该条带克隆测序后，将该序列在GenBank中比对发现没有找到与其高度同源的序列，说明是未知序列，以该序列为摸板设计特异引物(NS和NA)来区分鲶和大口鲶。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种准确鉴定鲶和大口鲶的试剂盒，特别是提供一对特异引物NS和NA，使用该试剂盒可准确区分鲶和大口鲶。本发明建立了准确鉴定两种鲶的PCR检测技术并研制了检测试剂盒，以满足科学研究和生产中种苗准确鉴定的需要。
本发明的另一目的在于提供上述检测试剂盒鉴定两种鲶的方法。
本发明的目的是由下述技术方案实现的一种准确鉴定鲶(Silurus asotus)和大口鲶(Silurus meridionalis)的试剂盒，包括DNA提取试剂、聚合酶链式反应(PCR)试剂、电泳和显色试剂(a)DNA提取试剂，包括试剂1DNA提取缓冲液10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，2mmol/L EDTA(pH8.0)，0.4mol/L NaCl，1％SDS。
试剂2蛋白酶K 20mg/mL。
试剂3氯化钠6mol/L。
试剂4异丙醇(分析纯)。
试剂570％乙醇。
(b)聚合酶链式反应试剂包括反应预混试剂6和试剂7。
试剂6含有10倍聚合酶链式反应缓冲液(含MgCl215mM)、特异引物对NS和NA、dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)和灭菌双蒸水，含量分别为2.5μl、0.5-0.75μl(10μM)、0.5-0.75μl(10μM)、0.5μl(10μM each)和19.375-20.375μl。
试剂7Taq酶(5个单位/μl)。
(c)电泳和显色试剂，包括试剂8、试剂9、试剂10和试剂11。
试剂8为50倍TAE(电泳缓冲液)，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M；(实际使用时用蒸馏水稀释50倍)。
试剂9为凝胶加样缓冲液，含w/v为40％的蔗糖和0.25％的溴酚蓝和二甲苯青FF；试剂10电泳级琼脂糖。
试剂11溴化乙锭0.5μg/μl。
为了更好地实现本发明，所述特异引物NS和NA序列如下特异引物NS指5′AACTGTAGTCCACGAACAACATCTT 3′，特异引物NA指5′CTAAACTTTCTTACGGCTTCTCCC 3′。
所述聚合酶链式反应试剂的优选组成为试剂62.5μl 10×PCR Buffer，0.5μl NS，0.5μl NA，0.5μl dNTP(10mM each)，20.375μl ddH2O；试剂70.125μl Taq酶。
采用上述的试剂盒鉴定鲶和大口鲶的方法，包括以下步骤(1)取鱼鳍50-100mg，剪碎，加400μl试剂1；(2)加入10μl试剂2，55-65℃水浴2h，至颗粒完全溶解；(3)加300μl试剂3，振荡混匀30秒，然后10,000×g离心30min，取上清至新离心管；(4)加入等体积试剂4，-20℃放置1h，然后10,000×g离心15min，弃去上清；(5)用1ml试剂5洗涤沉淀，10,000×g离心5min，空气中控干，灭菌双蒸水溶解，即为DNA提取液；(6)PCR扩增取0.5-1μl DNA作为PCR扩增的模板；取23.875-24.375μl试剂6与0.125μl试剂7混合；在热循环仪上通过94℃解链3-5分钟；然后用94℃变性20-30秒，60-62℃复性30-40秒钟，72℃延伸45-90秒钟，如此循环30-35次，最后在72℃保温8-12分钟，将扩增目的特异片段增加到108mol以上。
(7)电泳和显色检测取5-10μl扩增后的样品，与1-2μl试剂9(凝胶加样缓冲液)混合，在1.0％(W/V)的琼脂糖凝胶(0.1g试剂10中加入10ml已稀释50倍的试剂8)中电泳(试剂8用蒸馏水稀释50倍作为工作电泳缓冲液)，在紫外光下显色检测。如果出现一条约640核苷酸对(bp)的条带，说明该鱼为鲶；如果出现一条约420核苷酸对(bp)的条带，说明该鱼为大口鲶。
图1为鉴定鲶和大口鲶试剂盒对两种鱼的鉴定实验结果图。
其中MDNA marker，1为鲶特征性条带(约640bp)，2为大口鲶特征性条带(约420bp)。
具体实施例方式
下面实施例是进一步对本发明的说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1可使用100次的鉴定鲶和大口鲶的试剂盒，其成分组成如下(a)DNA提取试剂，包括试剂1，40毫升，其成分为10mmol/L Tris-HCl，pH8.0；2mmol/L EDTA，pH8.0；0.4mol/L NaCl，1％SDS；试剂2，0.8毫升，其成分为蛋白酶K，20mg/mL；试剂3，30毫升，其成分为氯化钠，6mol/L；试剂430ml异丙醇(分析纯)；试剂5100ml 70％乙醇。
(b)聚合酶链式反应试剂包括反应预混试剂6和试剂7；试剂6，含有100份以下组成成分(括号中的数字是1份的体积，100份的总量为2450μl)10倍聚合酶链式反应缓冲液(含MgCl215mM)(2.5μl)、特异引物NS(0.5μl(10μM))和NA(0.5μl(10μM))(请生物技术公司(如上海生工、英俊公司或大连Takara公司)按照序列(NS5′AACTGTAGTCCACGAACAACATCTT 3′，NA5′CTAAACTTTCTTACGGCTTCTCCC 3′)合成即可)、四种脱氧核苷酸的混合物(0.5μl(10μMeach))和灭菌双蒸水(20.375μl)；试剂7，130μl，推荐使用宝生物工程(大连)有限公司产品Taq酶，5U/μl；(c)电泳和显色试剂，包括试剂8、试剂9、试剂10和试剂11；试剂8，100毫升，为50倍电泳缓冲液，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M；(实际使用时用蒸馏水稀释50倍)试剂9，0.5毫升，为凝胶加样缓冲液，含w/v为40％的蔗糖和0.25％的溴酚蓝和二甲苯青FF；试剂10，10克电泳级琼脂糖；(使用时用稀释50倍的试剂8按W/V配置1.0％琼脂糖)试剂11，300μl溴化乙锭(0.5μg/μl)。(使用时按照每毫升琼脂糖加1μg溴化乙锭)使用操作步骤1、取鱼鳍100mg，剪碎，加400μl试剂1；2、加入10μl试剂2，55℃水浴2h，至溶液内无颗粒物；3、加300μl试剂3，振荡混匀30秒，然后10,000×g离心30min，取上清至新离心管；4、加入等体试剂4，-20℃放置1h，然后10,000×g离心15min，弃去上清；5、用1ml试剂5洗涤沉淀，10,000×g离心5min，空气中控干，灭菌双蒸水溶解，即为DNA提取液；6、PCR扩增取0.5μlDNA作为PCR扩增的模板；取24.375μl试剂6与0.125μl试剂7混合；在热循环仪上通过94℃解链3分钟；然后用94℃变性30秒，62℃复性30秒钟，72℃延伸45秒钟，如此循环30次，最后在72℃保温8分钟。
7、电泳和显色检测取10μl扩增后的样品，与2μl试剂9(凝胶加样缓冲液)混合，在1.0％(W/V)的琼脂糖凝胶(0.1g试剂10中加入10ml已稀释50倍的试剂8)中电泳(试剂8用蒸馏水稀释50倍作为工作电泳缓冲液)，在紫外光下显色检测。如果出现一条约640核苷酸对(bp)的条带，说明该鱼为鲶；如果出现一条约420核苷酸对(bp)的条带，说明该鱼为大口鲶。
实施例21、取鱼鳍50mg，剪碎，加400μl试剂1；
2、加入10μl试剂2，60℃水浴约2h，至溶液内无颗粒物；3、加300μl试剂3，振荡混匀30秒，然后10,000×g离心30min，取上清至新离心管；4、加入等体积体试剂4，-20℃放置1h，然后10,000×g离心15min，弃去上清；5、用1ml试剂5洗涤沉淀，10,000×g离心5min，空气中控干，灭菌双蒸水溶解，即为DNA提取液；6、PCR扩增取1μl DNA作为PCR扩增的模板；取23.875μl试剂6与0.125试剂7混合；在热循环仪上通过94℃解链3分钟；然后用94℃变性30秒，60℃复性30秒钟，72℃延伸45秒钟，如此循环30次，最后在72℃保温8分钟。
7、电泳和显色检测取10μl扩增后的样品，与2μl试剂9(凝胶加样缓冲液)混合，在1.0％(W/V)的琼脂糖凝胶(0.1g试剂10中加入10ml已稀释50倍的试剂8)中电泳(试剂8用蒸馏水稀释50倍作为工作电泳缓冲液)，在紫外光下显色检测。如果出现一条约640核苷酸对(bp)的条带，说明该鱼为鲶；如果出现一条约420核苷酸对(bp)的条带，说明该鱼为大口鲶，检测结果见图1。
权利要求
1.一种准确鉴定鲶和大口鲶的试剂盒，包括DNA提取试剂、聚合酶链式反应试剂、电泳和显色试剂(a)DNA提取试剂，包括试剂1DNA提取缓冲液10mmol/L Tris-HCl，pH8.0；2mmol/L EDTA，pH8.0；0.4mol/L NaCl，1％SDS；试剂2蛋白酶K 20mg/mL；试剂3氯化钠6mol/L；试剂4异丙醇；试剂570％乙醇；(b)聚合酶链式反应试剂包括反应预混试剂6和试剂7；试剂6含有10倍聚合酶链式反应缓冲液，其中含MgCl215mM，2.5μl；特异引物NS0.5-0.75μl，10μM和NA 0.5-0.75μl，10μM、四种脱氧核苷酸的混合物0.5μl，每种10μM和灭菌双蒸水19.375-20.375μl；试剂7Taq酶，5U/μl；(c)电泳和显色试剂，包括试剂8、试剂9、试剂10和试剂11；试剂8为50倍电泳缓冲液，含三羟基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，浓度分别为0.04M和0.001M；试剂9为凝胶加样缓冲液，含w/v为40％的蔗糖和0.25％的溴酚蓝和二甲苯青FF；试剂10电泳级琼脂糖；试剂11溴化乙锭，0.5μg/μl
2.根据权利要求1所述的准确鉴定鲶和大口鲶的试剂盒，其特征在于所述特异引物NS和NA如下特异引物NS指5′AACTGTAGTCCACGAACAACATCTT 3′；特异引物NA指5′CTAAACTTTCTTACGGCTTCTCCC 3′。
3.根据权利要求1所述的准确鉴定鲶和大口鲶的试剂盒，其特征在于，所述聚合酶链式反应试剂的组成为试剂62.5μl 10×PCR Buffer，0.5μl NS，0.5μl NA，0.5μl dNTP 10mM each，20.375μlddH2O；试剂70.125μl Taq酶。
4.采用权利要求1-3任一项权利要求所述的试剂盒鉴定鲶和大口鲶的方法，其特征在于包括如下步骤(1)取鱼鳍50-100mg，剪碎，加400μl试剂1；(2)加入10μl试剂2，55-65℃水浴2h，至颗粒完全溶解；(3)加300μl试剂3，振荡混匀30秒，然后10,000×g离心30min，取上清至新离心管；(4)加入等体试剂4，-20℃放置1h，然后10,000×g离心15min，弃去上清；(5)用1ml试剂5洗涤沉淀，10,000×g离心5min，空气中控干，灭菌双蒸水溶解，即为DNA提取液；(6)PCR扩增取0.5-1μl DNA作为PCR扩增的模板；取23.875-24.375μl试剂6与0.125μl试剂7混合；在热循环仪上通过94℃解链3-5分钟；然后用94℃变性20-30秒，60-62℃复性30-40秒钟，72℃延伸45-90秒钟，如此循环30-35次，最后在72℃保温8-12分钟，将扩增目的特异片段增加到108mol以上；(7)电泳和显色检测取5-10μl扩增后的样品，与1-2μl试剂9混合，在1.0％W/V的琼脂糖凝胶中电泳，将试剂8用蒸馏水稀释50倍作为工作电泳缓冲液，在紫外光下显色检测；如果出现一条约640核苷酸对bp的条带，说明该鱼为鲶；如果出现一条约420核苷酸对bp的条带，说明该鱼为大口鲶。
全文摘要
本发明提供了一种准确鉴定鲶和大口鲶的试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括DNA提取试剂，包括试剂1、试剂2、试剂3、试剂4和试剂5；聚合酶链式反应试剂，包括反应预混试剂6和试剂7；电泳和显色试剂，包括试剂8、试剂9、试剂10和试剂11。本发明特别提供一对特异引物NS和NA，利用该对引物进行PCR扩增反应可准确鉴定鲶和大口鲶，特点是准确、批量、对鉴定鱼损伤轻，不会导致被鉴定活鱼死亡。
文档编号C12Q1/68GK101024858SQ20071007835
公开日2007年8月29日 申请日期2007年3月30日 优先权日2007年3月30日
发明者张其中 申请人:西南大学