专利名称：农杆菌介导的花椒转基因方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体来说涉及一种农杆菌介导的花椒转基 因方法。
背景技术：
朝仓花椒(Z朋(力a y7"/z piperitum DC var. inerme Makino )芸香科花椒属 落叶灌木。花椒用途广，是一种重要的经济树木，其果实不但能入药、榨 油，且为人们日常烹饪的主要调料。现代研究表明花椒属植物的化学成分 主要有生物^喊、酰胺、木脂素、香豆素和脂肪酸等，对心血管系统、消化 系统、免疫机能、凝血功能、肿瘤等具有较强的药理活性。研究发现花椒 宁碱对癌细胞逆转录酶和DM聚合酶活力有较高的抑制能力，因此对花椒 中抗癌活性物质的研究，是国内外学者研究的热点。花椒树喜光、喜温， 耐干旱，不耐涝，不耐寒。冻害常给花椒生产造成重大损失，造成花椒大 量减产，甚至绝收。我国是世界花椒栽培面积、产量第一大国，但我国花 椒研究主要以丰产栽培和病虫害防治为主，而良种选育及产品开发严重滞 后。如不从根本上解决良种问题，花椒的生产水平难有大的发展，因此当 前急需开展优良品种的选育研究。
转基因育种相对于传统的杂交育种、诱变育种和多倍体技术育种来说， 不仅缩短了育种周期，而且能准确地选择任何一个目的基因(植物、动物乃 至人类)，从而打破了遗传物质分类上门、纲、目、科及属界限，实现了基 因的转移，大大拓宽了作物遗传改良可资利用的基因来源。
由于木本植物自身的特点，使其在遗传转化上有一定的难度和特殊性，
只有建立快捷高效的遗传转化体系，完善和优化转基因技术，才有可能提 高转化率，获得大量的转基因植株，筛选优良抹系，培育优良品种。由于 缺少高效的花椒组织培养再生体系，目前尚未见国内外有关花椒遗传转化 及转基因育种研究方面的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一为培育抗病虫、抗低温、抗干旱，高精油含 量、高药用价值及无刺的转基因花椒的农杆菌介导的花椒转基因方法。
一种农杆菌介导的花椒转基因方法，包括下列步骤 (l)材料消毒方法田间取外植体在流水中冲洗2h,用少量洗衣粉刷 洗材料表面，再用流水将洗衣粉充分冼净，75。/。酒精表面消毒45s后无菌水 沖洗1次再用0.1Q/。升汞消毒7min后无菌水冲洗5次，切取0.5-lcm带腋芽 茎段接种于诱导培养基；
(2) 农杆菌的准备用接种针蘸取-80。C冻存的含有pBinl9重组质粒 的农杆菌，在YEP固体培养基上划平板，28。C恒温培养24-48h至长出合适 大小的菌斑；用牙签挑取农杆菌单菌落加入到5mlYEP液体培养基中，28 。C200rpm震荡培养24 h，于5ml菌液中取500ul加入50ml YEP液体培养基 中，28。C200rpm震荡培养，直到OD值达到0.4-0.7;将菌液转移到50ml 离心管中，6000rpm， (C离心10min,收集菌体；用WPM重悬培养基重 悬离心收集的农杆菌，调节菌液OD值在0.3-0.4之间；
(3) 植物材料的农杆菌侵染取诱导培养20天腋芽叶柄及茎段，切 成0.5cm左右的切段，接种到诱导培养基中黑暗中培养48-72h，投入预先 准备好的农杆菌菌液中，不断摇动，使外植体与农杆菌充分接触，6-8min 后，取出外植体，置于干燥无菌滤纸上吸去多余的菌液，转入共培养基上， 培养48-72h。立刻转入筛选培养基中诱导愈伤组织的产生；
(4 )分化及壮苗材料转入筛选培养基后2周可见愈伤组织产生3个
月后愈伤组织再分化出芽，再生的芽4-5周后，小苗长至3-4公分高；
(5)完整植林的获得将小苗转至生根培养基中诱导生根，2周后材
料下端长出白色小根，继续培养即获得花椒转基因植抹试管苗。
其中植物组织培养各个阶段，除共培养及预培养阶段不需要光照外，
培养条件为光照强度为20001x,每日光照16小时，培养温度(26士2)。C。 生根培养基为1/2WPM培养基，其余培养基均为WPM常规培养基。 上述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中共培养基中含有0.5 mg/L
6-千氨基噤呤、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖，重悬培养基中含有20g/L蔗糖。
上述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中诱导培养基中含有 0.5mg/L-千氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸及30g/L蔗糖，筛选培养基1中含有 0.5mg/L6-节氨基噤呤、0.2mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、150mg/L头 孢霉素及30g/L蔗糖。
上述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中1/2WPM生根培养基中含 有150mg/L头孢霉素及20g/L蔗糖。
上述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中1LWPM培养基中包含 硫酸钾(KS04)990毫克，硝酸铵(NH4N03) 400毫克，氯化钙(CaCl2 . 2H20) 96毫克，硝酸钩(CaN03 ' 4H20) 556毫克，疏酸镁(MgS04 . 7H20) 370 毫克，磷酸二氢钾(KH2PO4)170毫克，硫酸锰(MnS04 .4H20)22.3毫克，硫 酸锌(ZnS04 . 7H20) 8.6毫克，钼酸钠(Na2Mo04 . 2H20) 0.25毫克，乙二胺 四乙酸二钠(NarEDTA.2H20) 37.25毫克，硫酸亚铁(FeS04 . 7H20) 27.8毫 克，硫酸铜(CuS04 . 5H20) 0.025毫克，氯化钴(COCl2 . 6H20) 0,025毫克， 肌醇IOO毫克，烟酸0.5毫克，盐酸硫胺素(VB1)1.0毫克，盐酸吡哆素(VB6)
0.5毫克，甘氨酸2毫克，PH值5.80。
上述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中lLYEP培养基中包含5.0g 蛋白胨，5.0g酵母提取物，2.5gNaCl， PH值7.20。
本研究采用花椒叶柄、茎段为外植体，通过诱导愈伤组织再分化出芽， 完善了花椒再生体系。在上述研究的基础上，筛选出较合理的遗传转化方 案，建立了农杆菌介导的花椒遗传转化体系，为通过转基因技术，深入研 究并发掘花椒的药用、食用价值奠定了基础。
图1:筛选4Od花椒再生芽诱导情况(整皿)；
图2:花椒叶柄通过愈伤组织再分化60 d再生芽(整皿)；
图3:花椒茎段通过愈伤组织再分化80 d再生芽(单个)；
图4:花椒转基因材料的壮芽；
图5:花椒转基因材料的生根；
图6:转基因植株叶片GUS染色检测结果；
图7:非转基因对照植林叶片GUS染色检测结果；
图8:转基因花椒植抹PCR检测结果。
图中标记
M: 100bp腿ladder;
P: /;7f-/7/7质粒；
1, 2, 3, 4, 5:转基因植林；
CK:非转基因植林
具体实施例方式
以下结合附图及实验例，进一步说明本发明的有益效果 实验例花椒叶柄、茎段抗生素敏感性实验
本实验中用于花椒遗传转化的构建中含有卡那霉素抗性基因，因此采 用卡那霉素对转基因植株进行筛选，另外本实验采用头孢霉素作为花椒材 料在组培过程当中的农杆菌抑制剂。在花椒诱导培养基中，分别附加0 mg/L 卡那霉素，5 mg/L卡那霉素，10 mg/L卡那霉素，20 mg/L卡那霉素，30 mg/L 卡那霉素，50mg/L卡那霉素和100mg/L卡那霉素，150mg/L的头孢霉素。 将0.5 cm左右的叶柄及茎段切段，接种到上述培养基中，25d后统计材料 的分化及存活情况。结果表明，150mg/L的头孢霉素对花椒胚轴及子叶的 分化影响不大，故在筛选时我们采用150mg/L的头孢霉素抑菌。花椒叶柄 及茎段对卡那霉素比较敏感，当卡那霉素浓度为30mg/L时，外植体死亡 率为78.1%,个别材料出现芽苗分化，但产生的芽严重白化，不能正常生长； 当卡那霉素浓度为50mg/ L时，叶柄褐变严重，死亡率97.5。/。，没有愈伤 组织的产生；当卡那霉素浓度达到100mg/L时，外才直体全部死亡。因而选择的筛选压为卡那霉素50mg/L，并附加150mg/L头孢霉素抑制农杆菌的 生长。
实施例
(1) 材料消毒方法田间取外植体在流水中沖洗2小时，用少量洗衣 粉刷洗材料表面，再用流水将洗衣粉充分冼净，75°/。酒精表面消毒45秒后 无菌水冲洗1次再用0.1%升汞消毒7分后无菌水冲洗5次，切取0.5-lc.m 带腋芽茎段接种于诱导培养基
(2) 农杆菌的准备用接种针蘸取-8(TC冻存的含有pBinl9重组质粒 (重组质粒中含有异戊烯基转移酶基因ipt和重组酶基因flp)的农杆菌，
在YEP固体培养基上划平板,28°C恒温培养24-48h至长出合适大小的菌斑； 用牙签挑取农杆菌单菌落加入到5mlYEP液体培养基中，28。C200rpm震荡 培养24 h,于5ml菌液中取500ul加入50ml YEP液体培养基中，28。C200rpm 震荡培养，直到OD值达到0.4-0.7。将菌液转移到50ml离心管中，6000rpm， 4'C离心10min，收集菌体。用WPM重悬培养基重悬离心收集的农杆菌， 调节菌液OD值在0.3-0.4之间；
(3) 植物材料的农杆菌侵染取诱导培养20天腋芽叶柄及茎段，切 成0.5cm左右的切段，接种到诱导培养基中黑暗中培养48-72h,投入预先 准备好的农杆菌菌液中，不断摇动，使外植体与农杆菌充分接触，6-8min 后，取出外植体，置于干燥无菌滤纸上吸去多余的菌液，转入共培养基上， 培养48-72h。立刻转入筛选培养基中诱导愈伤组织的产生；
(4) 转基因植物的筛选及愈伤组织诱导情况见图1，在含有50mg/L卡 那霉素的筛选培养基中，由于导入了卡那霉素抗性基因，因此转基因材料 能够分解培养基中的卡那霉素，能够存活并能产生愈伤组织。
(5 )分化及壮苗材料转入筛选培养基后2周可见愈伤组织产生3个 月后可见愈伤组织再分化出芽，再生的芽约4-5周后，小苗可长至3-4公分 高。(见图3,图4)
(6) 完整植抹的获得将小苗转至生根培养基中诱导生根。2周后材 料下端长出白色小根，继续培养即获得花椒转基因植林试管苗。(见图5)
(7) 转基因植抹GUS组织活性检测本发明中用于花椒遗传转化的 构建中含有P -葡萄糖苷酸酶基因，可进行GUS染色。取待检测材料的叶片 清洗后抽真空，于5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D-葡糖苷酸染色液(X-Gluc 0.5mg/mL ,10Ommol/L磷酸緩冲液ph=7.0,0.10/oTriton X 100，lmmol/L铁氰化 钾，lmmol/L亚铁氰化钾)中于37。C下保温过夜，然后分别用10%, 25%, 50%， 75%， 95%的乙醇脱色，每种浓度的乙醇分别脱色5min,最后组织继续力丈 在95%的乙醇溶液中浸泡，直到绿色退去。
检测结果经过GUS染色，转基植株的叶片因含有GUS基因而呈蓝 色(见图6)，而对照植;眛的叶片没有着色，呈浅黄色(见图7)。
(8 )转基因植抹PCR分子检测本实验中用于花椒遗传转化的构建中 含有z》f基因，因此采用z》f引物对转基因植株及进行PCR检测。CTAB法 提取花椒基因组DNA,以基因组DNA为模版利用^引物进行PCR扩增， 待扩增片段长度为325bp。 引物序列为
Forward primer: 5 ，-ATCGGGTCCAATGCTGTGTCCTC-3';
Reverse primer: 5 ，-TGCTTAACTCTGGCCTTGGC-3'
反应体系20 pl反应体系中包含2.0 pi 10 x PCR buffer, 1.6 pi dNTP，
0.3ul primerl, 0.3ul primer2, 0.2ul template DNA， O.lul Taq酶，力口 ddH20
至总体积20ul;
扩增反应程序为①94。C5min,②94。C30s， 55。C30s， 72。C30s进行35 个循环，③72。Cl0min。扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测并拍照。
检测结果见图8，其中M为100bpDNAladder, P为zj9f-^p质粒，CK 为非转基因植抹，1、 2、 3 、 4、 5为转基因植抹，l-5号转基因植株扩增 出了 325bp的目标条带，结果与P^f-^p质粒一致，而非转基因植抹CK没 有扩增出带。
培养基及培养条件
共培养基中含有0.5 mg/ L 6-千氨基嘌呤、0.2 mg/ L萘乙酸、30g/L蔗 糖，重悬培养基中含有20g/L蔗糖。
诱导培养基中含有0.5mg/L-千氨基嗜呤、0.2 mg/ L萘乙酸及30g/L蔗 糖，筛选培养基l中含有0.5mg/L6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、50 mg/ L卡那霉素、150mg/L头孢霉素及30g/L蔗糖。
1/2WPM生根培养基中含有150mg/L头孢霉素及20g/L蔗糖。
本发明中生根培养基为1/2WPM培养基，其余培养基均为WPM常规 培养基。
1L WPM培养基中包含硫酸钾(KS04) 990毫克，硝酸铵(NH4N03) 400 毫克，氯化钙(CaCl2 2H20)96毫克，硝酸钙(CaN03 4H20 ) 556毫克， 硫酸镁(MgS04 . 7H20) 370毫克，磷酸二氢钾(KH2P04) 170毫克，硫酸锰 (MnS04 4H20) 22.3毫克，硫酸锌(ZnS04 7H20) 8.6毫克，钼酸钠 (Na2Mo04 ' 2H20) 0.25毫克，乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA.2H20) 37.25毫 克，硫酸亚铁(FeS04 . 7H20)27.8毫克，硫酸铜(CuS04 . 5H20) 0,025毫克， 氯化钴(COCl2 6H20) 0.025毫克，肌醇100毫克，烟酸0.5毫克，盐酸硫 胺素(VB1) 1.0毫克，盐酸吡哆素(VB6)0.5毫克，甘氨酸2毫克，PH值5.80。
1LYEP培养基中包含5.0g蛋白胨，5.0g酵母提取物，2.5gNaCl， PH 值7.20。
植物组织培养各个阶段，除共培养及预培养阶段不需要光照外，培养 条件为光照强度为20001x,每日光照16小时，培养温度(26 士 2)°C 。
权利要求
1.一种农杆菌介导的花椒转基因方法，包括下列步骤(1)将带腋芽幼嫩茎段及茎尖接种于诱导培养基中，以萌发20天腋芽的叶柄及茎段作为浸染外植体；(2)将农杆菌单菌落，用牙签挑取，加入到YEP液体培养基中培养震荡培养，直到OD值达到0.4-0.7，离心收集菌体，用WPM重悬培养基重悬制得农杆菌菌液；(3)将叶柄及茎段切成0.5cm左右的外植体，接种到诱导培养基于黑暗中预培养，培养时间48-72h，投入步骤b农杆菌菌液中，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体，转入共培养基上培养48-72h，然后转入筛选培养基中诱导芽再生，最后将材料接种到生根培养基中诱导生根。
2、 如权利要求1所述的农杆菌介导的花椒转基因方法，包括下列步骤(1) 材料消毒方法田间取外植体在流水中冲洗2h,用少量洗衣粉刷 洗材料表面，再用流水将洗衣粉充分冼净，75%酒精表面消毒45s后无菌水 冲洗1次再用0.1。/。升汞消毒7min后无菌水冲洗5次，切取0.5-lcm带腋芽 茎段接种于诱导培养基；(2) 农杆菌的准备用接种针蘸取-8(TC冻存的含有pBinl9重组质粒 的农杆菌，在YEP固体培养基上划平板，28。C恒温培养24-48h至长出合适 大小的菌斑；用牙签挑取农杆菌单菌落加入到5mlYEP液体培养基中，28 。C200rpm震荡培养24 h,于5ml菌液中取500ul加入50ml YEP液体培养基 中，28。C200rpm震荡培养，直到OD值达到0.4 0.7;将菌液转移到50ml 离心管中，6000rpm, 4'C离心10min,收集菌体；用WPM重悬培养基重 悬离心收集的农杆菌，调节菌液OD值在0.3 ~ 0.4之间；(3) 植物材料的农杆菌侵染取诱导培养20天腋芽叶柄及茎段，切 成0.5cm左右的切段，接种到诱导培养基中黑暗中培养48-72h后，投入预 先准备好的农杆菌菌液中，不断摇动，使外植体与农杆菌充分接触，6~8min 后，取出外植体，置于干燥无菌滤纸上吸去多余的菌液，转入共培养基上， 培养48-72h,立刻转入筛选培养基中诱导愈伤组织的产生；(4) 分化及壮苗材料转入筛选培养基后2周可见愈伤组织产生，3 个月后愈伤组织再分化出芽，再生的芽4-5周后，小苗长至3-4公分高；(5) 完整植抹的获得将小苗转至生根培养基中诱导生根，2周后材 料下端长出白色小根，继续培养即获得花椒转基因植株试管苗；其中植物組织培养各个阶段，除共培养及预培养阶段不需要光照外， 培养条件为光照强度为20001x,每日光照16小时，培养温度(26士。。C; 生根培养基为1/2WPM培养基，其余培养基均为WPM常规培养基。
3、 如权利要求2所述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中共培养 基中含有0.5 mg/L6-千氨基噤呤、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖，重悬培 养基中含有20g/L蔗糖。
4、 如权利要求3所述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中诱导培 养基中含有0.5mg/L-苄氨基嘌呤、0.2 mg/ L萘乙酸及30g/L蔗糖，筛选培 养基l中含有0.5mg/L6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉 素、150mg/L头孢霉素及30g/L蔗糖。
5、 如权利要求4所述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中1/2WPM 生根培养基中含有150mg/L头孢霉素及20g/L蔗糖。
6、 如权利要求2-5之一所述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中1L WPM培养基中包含硫酸钾(KS04) 990毫克，硝酸铵(NH4N03) 400亳克， 氯化4丐(CaCl2 . 2H20)96毫克，硝酸4丐(CaN03 4H20) 556毫克，硫酸镁 (MgS04 7H20) 370毫克，磷酸二氲钾(KH2P04) 170毫克，硫酸锰 (MnS04 4H20) 22.3毫克，硫酸锌(ZnS04 7H20) 8,6毫克，钼酸钠 (Na2Mo04 2H20) 0.25毫克，乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA.2H20) 37.25毫 克，硫酸亚铁(FeS04 . 7H20)27.8毫克，硫酸铜(CuS04 . 5H20) 0.025毫克， 氯化钴(COCl2 . 6H20) 0.025毫克，肌醇100毫克，烟酸0.5毫克，盐酸硫 胺素(VB1) 1.0毫克，盐酸吡喷素(VB6)0.5毫克，甘氨酸2毫克，PH值5.80。
7、 如权利要求2-5之所述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中1L YEP 培养基中包含lO.Og蛋白胨，10.0g酵母提取物，5.0gNaCl， PH值7.20。
全文摘要
本发明公开了一种农杆菌介导的花椒转基因方法，包括下列步骤(1)将带腋芽幼嫩茎段及茎尖接种于诱导培养基中，以萌发20天腋芽的叶柄及茎段作为浸染外植体；(2)将农杆菌单菌落，用牙签挑取，加入到YEP液体培养基中培养震荡培养，直到OD值达到0.4-0.7，离心收集菌体，用WPM重悬培养基重悬制得农杆菌菌液；(3)将叶柄及茎段切成0.5cm左右的外植体，接种到诱导培养基于黑暗中预培养，培养时间48-72h，投入步骤b农杆菌菌液中，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体，转入共培养基上培养48-72h，然后转入筛选培养基中诱导芽再生，最后将材料接种到生根培养基中诱导生根。本发明能培育抗病虫、抗低温、抗干旱，高精油含量、高药用价值及无刺的转基因花椒。
文档编号C12N15/82GK101195832SQ20071007806
公开日2008年6月11日 申请日期2007年12月25日 优先权日2007年12月25日
发明者曾晓芳, 岩 李, 赵德刚 申请人:贵州大学