专利名称：：高产率和高产量制造木糖醇的方法
技术领域：
：本发明涉及高产率和高产量制造木糖醇的方法，更具体地，涉及利用产木糖醇微生物的木糖醇脱氢酶缺陷突变体高产率和高产量制造木糖醇的方法。
背景技术：
：木糖醇，一种五碳糖醇，在食品和糖果工业中用作天然甜味剂。它有抑制牙龋菌变形链球菌(Streptococcusmutans)生长的抗龋齿疗效(参见:Makinen，K.K,，J.Appl.Nutr.,44:16-28(1992))。其甜度与蔗糖相等，并且可以重量对重量的基准代替蔗糖。当溶解于水中时，木糖醇具有低粘度和负热效应，并且不需要胰岛素来调节代谢。由于这些优点，木糖醇在食品工业中的应用正在快速增长。当前，通过化学还原主要从木材水解产物衍生的D-木糖来大规模生产木糖醇。D-木糖是在木质纤维素中发现的主要戊糖，并且是第二位最丰富的天然糖(参见:Ladisch，M.R."etal.，EnzymeMicrob.Technol.，5:82-102(1983))。传统的木糖醇生产方法包括四个步骤植物材料的酸水解，纯化水解产物得到纯D-木糖，D-木糖氢化作用得到木糖醇以及和木糖醇的结晶化(参见Aminoff，C.，etal.，InCounsdl，J.N.(ed.).Xylitol.AppliedSciencePublishers,London,p.1-9(1978))。但是，纯D-木糖的纯化是高成本并造成污染的步骤(参见Kind，V.B.,etal,,Gidroliz.Lesokhim.Promst,3:11-12(1987))。另外，用Raney镍金属催化剂在高温高压下将D-木糖氢化为木糖醇很危险并引起污染(参见Hyv6nen，L.，etal"InAdvancesinFoodResearch,Vol.28,edsChishester,C.O.,Mrak，E.M.和Stewart,G..,AcademicPress,NewYork,pp.373-403(1982))。现有的传统木糖醇生产方法的缺点，包括髙污染水平和废物处理的顾虑，激发了研究者去开发其生产的替代途径。最具吸引力的方法之一是生物生产。生物生产不需要高纯度的底物D-木糖，并且是安全环保的方法。木糖醇由天然同化(assimilating)木糖的酵母和真菌，如管囊酵母(Pachysolentannophiulus)、季也蒙氏假丝酵母(Candidaguilliermondii)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)和热带假丝酵母(Candidatropicalis)产生(参见Dahiya，J.S.，Can.J.Microbiol"37:14-18(1991)，Yahashi,Y.，etal.，J.Ferment.Bioeng.，81:148-152(1996),Kim，S.Y.，etal.，FoodSci.Biotechnol"7:282-285(1998)，Morimoto,S.,etal"J.Ferment.Technol.，64:219-225(1986))。虽然据报告假丝酵母(Candidasp.)是最具活性并因而可能是最有用的菌株，但是由于与底物D-木糖(木糖醇的低产率昂贵原料)有关的高生产成本，木糖醇的工业化生产尚待实现。为开发更低成本的生产方法所进行的努力包括采用对溶解氧的控制(参见Kim,S.Y.等的美国专利5,686,277(1997))。但是，在工业化规模中将溶解氧控制在0.8-1.2%的水平并不容易，结果是，木糖醇产率低于70%,并且生产率不能实现经济效益。为了解决这些问题，本领域一直存在对利用代谢工程构建高产率和高产量的产木糖醇的新型菌株的需要。发明概述本发明提供了利用产木糖醇微生物的木糖醇脱氢酶缺陷突变体，高产率和高产量地制造木糖醇的方法。该目的通过阻断或灭活目的基因的表达，修饰产木糖醇微生物的代谢途径来实现，所述微生物优选天然同化木糖的酵母和真菌。因此，本发明的主要目的是通过利用木糖醇脱氣酶的表达被部分木糖醇脱氢酶基因的缺失、替换或添加所阻断的遗传修饰的微生物，提供高产率和高产量制造木糖醇的方法。本发明的上述和其他目的和特征从下文的描述结合附图将更为显而易见，其中-图1是酵母中木糖代谢的示意图。图2是pXYL2-Ura3的限制性酶切图谱。质粒pXYL2-Ura3用于阻断热带假丝酵母的木糖醇脱氢酶基因。缩写xyl2，木糖醇脱氢酶基因；Ura3，乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因。图3是在2.5升发酵罐中，热带假丝酵母的木糖醇脱氣酶基因阻断的突变体的木糖醇发酵分布图。甘油用作初始细胞生长和辅因子再生的共底物。符号，细胞干重；o，D-木糖；甘油；▽，木糖醇。图4是显示输氧速率(OTR)对木糖醇生产动力学的影响的分布图。虚线和实线分别指示D-木糖和木糖醇浓度。符号t，OTR,lOmmol02rV(300rpm);o，OTR，24mmo1021"h"(400rpm);，OTR，42mmo1021"1T1(500rpm)。图5是热带假丝酵母的木糖醇脱氢酶基因阻断的突变体在2.5升发酵罐中的补料(fed-batch)培养分布图。護，细胞干重；，葡萄糖；o，D-木糖；y，甘油；▽，木糖醇。图6是热带假丝酵母的木糖醇脱氢酶基因阻断的突变体在2.5升发酵罐中的补料培养分布图。■，细胞干重；，葡萄糖；o，D-木糖；t，甘油；▽，木糖醇。发明详述I.产木糖醇微生物的遗传修饰本发明提供了制造木糖醇的方法，包括在含有木糖、碳源、氮源和微量元素的培养基中培养产木糖醇微生物的木糖醇脱氢酶缺陷突变体，直至培养基中所含的木糖被完全消耗的步骤，所述突变体的木糖醇脱氢酶的表达被部分木糖醇脱氢酶基因的缺失、替换或添加所阻断。产木糖醇微生物包括天然同化木糖的酵母和真菌，优选假丝酵母并更优选利用季也蒙氏假丝酵母(Candidaguillermodi)、近平滑假丝酵母或热带假丝酵母。碳源、氮源和微量元素没有特别限制。在优选的实施方案中，甘油、果糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、纤维二糖或这些材料的混合物被用作木糖醇生产的细胞生长和辅因子再生的碳源，酵母提取物用作氮源，磷酸二氢钾、七水硫酸镁或这些材料的混合物用作微量元素。另外，产木糖醇菌株的发酵条件不受特别限制。在优选的实施方案中，发酵温度的范围从20。C至40。C。更具体的描述如下通常，在制造木糖醇的生物方法中，用同化木糖的酵母和真菌从木糖生产木糖醇。如图1所示，多数同化木糖的酵母经两个酶氧化还原反应，用木糖还原酶(EC1丄1.21)和木糖醇脱氢酶(EC1丄1.9)利用木糖(参见Alexander,M.A.，etal.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，29:478-486(1988))。木糖还原酶催化D-木糖还原成木糖醇，木糖醇脱氢酶催化木糖醇氧化成D-木酮糖。D-木酮糖被木酮糖激酶转化为5-磷酸D-木酮糖，然后进入磷酸戊糖途径。木糖醇脱氢酶需要NAD作为辅因子，而木糖还原酶则利用NAD(P)H。因此，木糖同化作用的整体效率与木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的活性相关联。在利用木糖的酵母，具柄毕赤氏酵母(Pichiastipitis)中，木糖还原酶和木糖醇脱氢酶分别由XYL1和XYL2编码(参见Amore，R.,etal.，Gene,109:89-97(1991)，K6tter，P.，etal"Curr.Genet"18:493-500(1990))。由木糖制造木糖醇的主要的产率限制因素是木糖醇在细胞生长和维持中的消耗。因此，如果从木糖醇向D-木酮糖的代谢步骤通过使相应的酶，木糖醇脱氢酶的失活而阻断，并且如果补充细胞生长和辅因子再生的共底物，则木糖醇的产率应该达到理论上100%的水平。为了分析木糖醇脱氢酶基因XYL2的DNA序列，利用基于具柄毕赤氏酵母中XYL2基因的序列设计的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)，从热带假丝酵母的基因组DNA扩增部分推测的XYL2基因。纯化扩增的DNA片段并插入pGEM-TEasy中。对部分XYL2基因进行测序，随后测定完整的核苷酸序列。利用XYL2基因的DNA序列，通过缺失、替换或添加，构建不能表达酶活性的修饰的木糖醇脱氢酶基因。然后，构建基因阻断的质粒pXYL2-Ura3。将用pXYL2-Ura3扩增的线性阻断DNA片段插入宿主菌株热带假丝酵母中，并选择其木糖醇脱氢酶基因被同源重组所灭活的突变体。II.木糖醇的生产在含有50ml木糖醇发酵培养基的250ml烧瓶中对遗传修饰的菌株的木糖醇的生产进行评估。木糖醇发酵培养基由D-木糖、葡萄糖、酵母提取物、磷酸二氢钾和七水硫酸镁组成。修饰的菌株以100%的产率将D-木糖转化为木糖醇。但是，并非培养基中的所有D-木糖都转化为木糖醇，表明被修饰的菌株消耗的所有D-木糖都被转化为木糖醇，木糖醇生产受到缺乏木糖还原酶所需的辅因子的限制，因为木糖醇不能被进一步代谢再生辅因子。木糖醇生产期间，为了辅因子再生，需要另外的共底物碳源，因而筛选各种碳源用于木糖醇生产的效率。在含有50ml木糖醇发酵培养基和各种共底物的250ml烧瓶中进行木糖醇发酵。虽然细胞在含有葡萄糖作为共底物的培养基中生长最好，但是在用甘油、果糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖和纤维二糖作为共底物时木糖醇的生产更有利。特别是，在甘油用作共底物时，培养基中的所有D-木糖都转化为木糖醇。当热带假丝酵母的遗传修饰突变体用甘油作为共底物分批培养时，培养基中的D-木糖在大约48小时内被完全消耗，并产生产率98.3。/。和容积产率0.97gl"h"的木糖醇。但是，在补料培养的情况下，培养基中的D-木糖在大约14-15小时内被消耗，并产生产率为97-100%和容积产率为3.48gl"h"的木糖醇。结果是，这表明了补料培养生产木糖醇比分批培养更有效。另一方面，在搅拌速度300-500rpm和输氧速率(OTR)10-42mmolC^l"h"的条件下，补料培养热带假丝酵母的突变体时，木糖醇产量在1.4-3.5gl"h"的范围内变动，木糖醇产率不变。特别是，在搅拌速度500ipm和输氧速率(OTR)42mmo1021"h"的条件下，木糖醇的产量最大。但是，在搅拌速度300rpm和输氧速率(OTR)42mmo1021"h"的条件下进行补料培养工作的情况下，木糖醇产量没有明显降低。结果是，可以得出结论，搅拌速度和输氧速率(OTR)影响甘油同化速率和随后的木糖醇生产速率。为了低成本生产木糖醇，通过利用玉米芯的水解产物，补料培养热带假丝酵母的遗传修饰突变体，所述玉米芯水解产物是一种主要含有木糖成分的废料，能给出与利用纯D-木糖相似的木糖醇产率。因此，已发现玉米芯的水解产物代替D-木糖，能以低成本方式用作生产木糖醇的底物。本发明通过下列实施例进一步进行说明，所述实施例不能用于限制本发明的范围。实施例l.-构建热带假丝酵母的木糖醇脱氢酶缺陷突变体用总DNA提取试剂盒制备热带假丝酵母的基因组DNA。部分XYL2基因经聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。所用引物的DNA序列如下所示引物XYL2-F:5，-aatggtcttgggtcacgaatcc-3，(SEQIDNO:l)引物XYL2-R:5，-gctctgaccaagtcgtaggcttc-3,(SEQIDNO:2)产生的片段用PCR产物纯化试剂盒提纯，然后插入pGEM-TEasy载体中(PROMEGA,USA)。然后，在克隆在pGEM-TEasy载体中的XYL2基因片段的两端，导入Bamffl限制性酶的两个靶位点，形成的质粒称作pGEM-XYL2。用引物Ura3-F和Ura3-R，通过PCR利用热带假丝酵母的基因组DNA扩增1.2-kb的URA3基因。所用引物的DNA序列如下所示引物Ura3-F:5，-ggatccattctagatgatctggtttggattgttggag-3，(SEQIDNO:3)引物Ura3-R:5，-ggatccatctcgagtcatgagaactaaactagcag-3，(SEQIDNO:4)如图2所示，PCR扩增的URA3基因被插入到pGEM-XYL2中产生pGEM-Ura3。转化热带假丝酵母的线性DNA用PCR以引物XYL2-F和XYL2-R进行扩增。产生的DNA片段XYL2-URA3-XYL2用作阻断盒。热带假丝酵母用阻断盒转化，并在YNB板(6.7gl"的无氨基酸酵母氮源，20g1"葡萄糖和15gr1琼脂)上选择。选择的转化株既在YNB板上又在含木糖作为唯一碳源的木糖板(6.7gr1的无氨基酸酵母氮源，20gl"D-木糖，和15gl"琼脂)上孵育。选择可以在YNB上生长但不能在木糖板上生长的突变体，并以PCR证实所选突变体的遗传修饰。结果，突变体的木糖醇脱氢酶基因(称为"BS-xdh")被成功阻断。实施例2:用遗传修饰菌株生产木糖醇将如实施例1所述构建的修饰的菌株BS-xdh接种在含有3mlYM培养基(3gl'1酵母提取物，3gl"麦芽提取物，5gl"菌胨(bactopeptone)和20gl"葡萄糖)的15ml试管中，并用震荡培养器以30。C和200rpm孵育12小时。将lml所述种子培养物接种在含有50ml木糖醇生产培养基(50gl"D-木糖醇，10gl"葡萄糖，10gl"酵母提取物，5gl"磷酸二氢钾和0.2gl"七水硫酸镁)的250ml烧瓶中，并用震荡培养器在30。C和200rpm孵育36小时。每隔6小时取样(样品1-7)。分别分析样品1-7的干细胞浓度(每升培养基的细胞干重)以及D-木糖和木糖醇浓度。用分光光度计(Shimadzu，Japan)在600nm处由样品的光密度计算细胞干重。用高压液相色谱(HPLC,Waters,USA)分析D-木糖、木糖醇和各种共底物的浓度，条件是使用Sugar-PakI柱(Waters)，水为流动相，柱温90°C，流速0.5mlmiiT1。结果示于表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>如表1所示，BS-xdh将12.5gl"木糖转化为12.5gl"木糖醇。木糖醇产率为100%。但是，24小时后，培养基中的D-木糖不再转化为木糖醇，木糖醇的生产停止。D-木糖向木糖醇的转换率仅为28%，该结果表明全部的D-木糖并没有被有效代谢，木糖醇生产受到木糖还原酶所需的辅因子缺乏的限制。实施例3:筛选辅因子再生的共底物将如实施例1所述构建的修饰的菌株BS-xdh接种在含有3mlYM培养基(3gl"酵母提取物，3gl"麦芽提取物，5gI—1菌胨和20gI—1葡萄糖)的15ml试管中，并用震荡培养器以30。C和200rpm孵育12小时。将lml所述种子培养物接种在含有50ml各种木糖醇生产培养基(50gl"D-木糖，示于下表2的10gl"的各种碳源，10gl"酵母提取物，5gl"磷酸二氢钾和0.2g"七水硫酸镁)的250ml烧瓶中，并用震荡培养器以30°C和200rpm孵育96小时。发酵结束后，以前述方式测定产生的干细胞(A)、消耗的各种底物(B)、消耗的D-木糖(C)和产生的木糖醇(D)的浓度。从培养基中超过初始D-木糖浓度的消耗的D-木糖浓度计算D-木糖转化率(E),从产生的超过消耗的D-木糖浓度的木糖醇浓度计算产率(F)。结果示于表2中。表2千细胞浓度(a)、消耗的共底物(b)、消耗的d-木糖(c)、产生的木糖醇(d)、d-木糖转化率(e)和木糖醇产率(f)的比较碳源a(gr1)b(gr1)c(gl")d(gr1)e(gr1)f(gr1甘露糖2.99.036.436.372.899.6果糖"8.923.323.646.6101.2半乳糖2.79.226.027.052.0103.6麦芽糖2.28.329.927.259.890.9蔗糖4.48.935.536.071.0101.3乳糖0.40.12.52.75.0108.0纤维二糖159.139.438.378.897.2蜜二糖1.11.65.04.010.0訓甘油3.29.145.246.290.4102.3醋酸盐1.09.011.012.322.0112.1葡萄糖酸盐1.02.13.94.07.8102.2丙酸盐2.61.91.71.73.4100.0苹果酸盐2.10.94.04.18.0102.4如表2所示，当甘油、果糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖或纤维二糖用作共底物时，可以实现超过90%的木糖醇产率，并且这些共底物的转化率高于葡萄糖(28%)。特别是，当甘油是共底物时，更有助于木糖醇产生。甘油用作共底物时，产率和D-木糖的转化率分别为100%和90%。因而，甘油被选作木糖醇生产的最佳共底物。实施例4:用甘油作共底物的木糖醇生产(I)将如实施例l所述构建的修饰的菌株BS-xdh接种在含有3mlYM200710085057.6说明书第10/16页培养基的15ml试管中，并用震荡培养器在30°C和200rpm孵育12小时。将lml种子培养物接种在含有50ml木糖醇生产培养基(50gl"D-木糖醇，10gl"甘油，10gl"酵母提取物，5gl"磷酸二氢钾和0.2gr1七水硫酸镁)的250ml烧瓶中，并用震荡培养器在30eC和200rpm孵育60小时。在0、6、12、18、24、36、48和60小时分别获取样品(样品11-18)。按照实施例2的描述分析干细胞浓度，D-木糖、甘油和木糖醇的浓度。结果示于表3中。表3用含有甘油作为共底物的木糖醇生产培养基的木糖醇生产分布<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>如表3所示，48小时BS-xdh将47.4gl"D-木糖转化为46.6g1"木糖醇。培养基中所有D-木糖被成功转化为木糖醇。该结果表明，用甘油作为共底物，充分供应木糖还原酶所需的辅因子，D-木糖被有效转化并生成木糖醇。另外，木糖醇产量和产率分别为0.97g1"h"和98.3%。实施例5:用甘油作共底物的木糖醇生产(II)将如实施例1所述构建的修饰的菌株BS-xdh接种在含有3mlYM培养基的15ml试管中，并用展荡培养器在30。C和200rpm孵育12小时。将lml所述种子培养基接种在含有50mlYM培养基的250ml烧瓶中，并用蔑荡培养器在30eC和200rpm孵育12小时。将50ml所述种子培养物在pH4.5和30°C下，接种在含有1L补充了20gr甘油的木糖醇生产培养基的2.5升发酵罐(KoBiotech，Korea)中。按照实施例2的描述分析细胞干重、D-木糖、甘油和木糖醇浓度。结果示于图3中。图3是当甘油用作唯一碳源时，细胞干重、D-木糖、甘油和木糖醇浓度随时间改变的分布图。实心圆(參)指细胞干重，空心圆(O)指D-木糖浓度，实心倒三角(▼)指甘油浓度，空心倒三角(▽)指木糖醇浓度。用于经木糖还原酶将D-木糖还原为木糖醇的辅因子通过甘油作为唯一碳源的同化作用再生。发酵在14小时时终止，木糖醇的终浓度为48.8gl'1。木糖醇产量和产率分别为3.48gl"h"和98yo。实施例6:输氧速率对木糖醇生产动力学的影响将如实施例1所述构建的修饰的菌株BS-xdh接种在含有3mlYM培养基的15ml试管中，并用震荡培养器在30°C和200rpm孵育12小时。将lml所述种子培养物接种在含有50mlYM培养基的250ml烧瓶中，并用震荡培养器在30。C和200rpm孵育12小时。将50ml所述种子培养物在pH4.5和30°C下接种在含有1L补充了20g"甘油的木糖醇生产培养基的2.5升发酵罐(KoBiotech,Korea)中。发酵试验在搅拌速度为300、400和500rpm，l.Ovol.vol".miiT1(vvm)通风条件下进行。300、400和500rpm的输氧速率(OTR)分别为10、24、42mmo1021"h—1。木糖醇和D-木糖的浓度变化采用实施例2所述的方法，在不同的OTR条件下，随时间推移进行分析(参见图4)。虚线和实线指D-木糖和木糖醇的浓度，实心倒三角(T)指OTR，10mmol021"h"(300rpm);空心圆(O)指OTR，24mmo1021"h"(400rpm);实心圆(*)指OTR,42mmol02r1h"(500rpm)。木糖醇的容积产率取决于搅拌速度和OTR，并且在1.4-3.5g.l".h'1的范围内变动，而木糖醇产率不取决于搅拌速度和OTR，并且在97%和100%的范围之间。在搅拌速度500rpm和OTR42mmo102rh'1时，容积产率最大，但是在搅拌速度300rpm和OTR42mmo1021"h"的补料培养条件下，并不降低很多。这表明搅拌速度和OTR影响甘油同化率和随后的木糖醇生产。当BS-xdh将D-木糖转化为木糖醇时，充分的氧气供应对于辅因子的快速再生是必需的，并导致高木糖醇产率。这表明BS-xdh的木糖醇产率受到OTR的显著影响。之前的研究已发现，当溶解氧的水平控制在0.8%和1.2%之间时，用非代谢工程化的近平滑假丝酵母的木糖醇产率和容积产率最大(参见Kim,S.Y.等美国专利5,686,277(1997))。但是，在工业规模上控制0.8-1.2%水平的溶解氧是不容易的，并且结果是，木糖醇产率低于70%并且产率不能实现经济效率。本实施例6显示的结果证实了代谢工程化的突变体BS-xdh以几乎是理论产率的97-100%产生木糖醇而与02输送速率无关。这提示突变体的木糖醇产率产生自通过阻断木糖醇脱氢酶基因而阻断木糖代谢，而不是来自细胞胞质中的氧化还原失衡。另外，在限制氧气的条件下，细胞质中合成的用于氧化还原平衡的副产物如乙醇和甘油不会在培养基中蓄积，因为培养基中充分供应了氧气。实施例7:用补料培养生产木糖醇(I)含D-木糖作为主要成分的玉米芯的半纤维素水解产物是工业化制造木糖醇的有经济价值的原材料，因其作为木糖醇前体比纯D-木糖价廉得多。另外，在回收过程例如浓縮和结晶化中，高浓度的木糖醇也很重要。因而，为提高利用玉米芯的木糖醇终浓度，进行补料培养。将如实施例1所述构建的修饰的菌株BS-xdh接种在含有3mlYM培养基的15ml试管中，并用震荡培养器在30°C和200rpm孵育12小时。将lml所述种子培养基接种在含有50mlYM培养基的250ml烧瓶中，并用簾荡培养器在30。C和200rpm孵育12小时。将50ml所述种子培养物接种在含有1L包括20g1"甘油的木糖醇生产培养基的2.5升发酵罐(KoBiotech，Korea)中，并在pH4.5和30°C下培养。玉米芯水解产物用来制备木糖醇生产培养基(IOOgrlD-木糖，7gl"葡萄糖，13gl"L-阿拉伯糖，30gl"甘油，10gl"酵母提取物，5gr1磯酸二氫钾和o.2gr1七水硫酸镁)。当D-木糖浓度降至iogr1的水平时，加入200ml补料溶液(feedingsolution)(500gl"D-木糖，35g1"葡萄糖，65gl"L-阿拉伯糖，30gl"甘油)。如实施例2描述的方法，随时间推移分析细胞干重和葡萄糖、D-木糖、甘油和木糖醇的浓度(参见图5)。实心方块(B)表示细胞干重，实心圆(參)表示葡萄糖浓度，空心圆(O)表示D-木糖浓度，实心倒三角(V)表示甘油浓度，空心倒三角(V)表示木糖醇浓度。如图5所见，81小时消耗的D-木糖的总量为167gl"，从D-木糖得到的99。/。产率的木糖醇终浓度为165gl'1。实施例8:用补料培养生产木糖醇(II)将如实施例1所述构建的修饰的菌株BS-xdh接种在含有3mlYM培养基的15ml试管中，并用震荡培养器在30。C和200rpm孵育12小时。将lml所述种子培养物接种在含有50mlYM培养基的250ml烧瓶中，并用震荡培养器在30。C和200rpm孵育12小时。将50ml所述种子培养物接种在2.5升发酵罐(KoBiotech，Korea)中，所述发酵罐含有1L包括20g.l"甘油的木糖醇生产培养基，并在pH4.5和30。C下培养。玉米芯水解产物用来制备木糖醇生产培养基(50gl"D-木糖，4g"葡萄糖,7gl"L-阿拉伯糖，20gl"甘油，10gl.1酵母提取物，581"磷酸二氢钾和0.221"七水硫酸镁)。当D-木糖浓度降至10gl"的水平时，加入100ml补料溶液(500gl'!D-木糖，35gl'1葡萄糖，65gl"L-阿拉伯糖，30gl"甘油)。由实施例2描述的方法，随时间推移而分析细胞千重和葡萄糖、D-木糖、甘油和木糖醇的浓度(参见图6)。实心方块(画)表示细胞干重，实心圆(參)表示葡萄糖浓度，空心圆(O)表示D-木糖浓度，实心倒三角(V)表示甘油浓度，空心倒三角(V)表示木糖醇浓度。如图6所见，96小时消耗的D-木糖的总量为186g1"，木糖醇终浓度和木糖醇产率分别为184gl"和99。/。。序列表<110>韩国科学技术院(KoreanAdvancedInstituteofScienceandTechnology)<120〉高产率和高产i制造木糖醇的方法(METHODFORMANUFACTURINGXYLITOLWITHHIGH-YIELDANDHIGH-PRODUCTIVITY)<130>SPI070850-47<160>4〈170〉Kopatentln1.71<210〉1<211〉22<212〉DNA<213>ArtificialSequence<220><223〉primer〈400〉1aatggtcttgggtcacgaatcc22〈210〉2<211〉23<212>腿<213>ArtificialSequence〈220〉<223>primer<400〉2gctctgaccaagtcgtaggcttc23<210>3<211>37<212〉DNA<213〉ArtificialSequence<220><223〉primer<400>3ggatccattctagatgatctggtttggattgttggag37<210>4<211〉35<212〉腿〈213〉ArtificialSequence<220〉<223>primer〈400〉4ggatccatctcgeigtcatgagaactaaactagcag3权利要求1.一种制造木糖醇的方法，包括在含有木糖、碳源、氮源和微量元素的培养基中培养产木糖醇微生物的木糖醇脱氢酶缺陷突变体，直至培养基中所含的木糖被完全消耗的步骤，所述突变体的木糖醇脱氢酶的表达被部分木糖醇脱氢酶基因的缺失、替换或添加所阻断。2.权利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中产木糖醇微生物是假丝酵母(Candidasp.)。3.权利要求l所述的制造木糖醇的方法，其中的假丝酵母是季也蒙氏假丝酵母(C.guillermondi)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)或热带假丝酵母(C.tropicalis)。4.权利要求l所述的制造木糖醇的方法，其中的碳源是甘油、果糖、半乳糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、纤维二糖或其混合物。5.权利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中的氮源是酵母提取物。6.权利要求l所述的制造木糖醇的方法，其中的微量元素是磷酸二氢钾、七水硫酸镁或其混合物。7.权利要求l所述的制造木糖醇的方法，其中的木糖醇脱氢酶缺陷突变体在20'C至40。C下培养。8.权利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中在搅拌速度为300-500rpm，输氧速率(OTR)为10mmol021"h"至42mmol02r1h"的条件下补料培养木糖醇脱氢酶缺陷突变体。9.权利要求1所述的制造木糖醇的方法，其中木糖以玉米芯水解产物的形式添加到培养基中。全文摘要本发明提供了通过利用产木糖醇微生物的木糖醇脱氢酶缺陷突变体，高产率和高产量制造木糖醇的方法。该目标通过阻断或灭活目的基因的表达，修饰产木糖醇微生物的代谢途径而得以实现，所述微生物优选天然的同化木糖的酵母和真菌。文档编号C12P7/02GK101255448SQ20071008505公开日2008年9月3日申请日期2007年2月28日优先权日2007年2月28日发明者金政会,高秉三申请人:韩国科学技术院;株式会社Lpbio