专利名称：：一种无标记转基因蔬菜的获得方法
技术领域：
：本发明涉及蔬菜转基因技术，尤其涉及无标记转基因技术的改进，属于植物生物工程领域。
背景技术：
：自1983年首次获得转基因烟草以来，植物转基因枝术不断改进或创新，发展出了若干种方法，如农杆菌介导法、基因枪法、微注射法、花粉管通道法等。其中，应用得最为成功的是农杆菌介导法和基因枪法。但随着转基因作物商品化生产的加快，也呈现出越来越多潜在的问题。其中，抗性选择标记基因(Resistantselectablemakergene)潜在的生态环境和食用安全性不可忽视的。其可能会影响目的基因的稳定性、加重受体植物细胞代谢的负担；更为重要的是，抗性选择标记一般都是一些抗生素抗性标记，含此类选择标记的转基因植物在进入商品化生产应用后，会对人畜产生潜在的危害，会被病原菌所摄取而造成更为严重的潜在后果。
发明内容本发明就是针对上述问题，提供一种无标记转基因蔬菜的获得方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，本发明包括以下步骤(1)、转化处理转化的受体可以是外植体，也可以是愈伤组织；可以是农杆菌介导转化，也可以用基因枪介导转化；(2)、组织培养将转化处理后的外植体诱导成愈伤组织并通过培养进一步扩增，将转化处理后的愈伤组织通过培养进一步扩增；(3)、分割处理将转化后形成的愈伤组织切分成尽可能小的小块，小块的体积《1mm3，待小块长大后用可直接对基因进行检测的方法对有目标基因的细胞或组织进行追踪，通过多次的分割处理，分割处理次数^2次，确定出转化愈伤的具体分布，然后从转化愈伤组织密集区的中心区域选取转化了的愈伤组织分化植株或进行进一步的分割、鉴定及植株再生；(4)、分子检测用PCR等可直接对目标基因进行检测的方法选出有转化的愈伤组织；(5)、植株再生将选出的转化了的愈伤分化成再生植株；(6)、植株鉴定对再生植株逐一进行鉴定，保留所有最上部两个叶片均为阳性的植株。本发明所述的第一次分割后，待愈伤组织长大后采用减半排除法对其进行鉴定，减半排除法为将分割后长大的愈伤组织分成两组，分别放于两个小离心管进行鉴定，淘汰无反应组，将阳性组中的愈伤组织再均为两组取样，进行鉴定，如此反复直至找到有转化的愈伤组织。为了防止取样对愈伤组织的影响，多次取样时应给愈伤组织留出一定的让其恢复的时间间隔。本发明所述的第二次分割后，待愈伤组织长大后采用分组法对其进行检测，分组法为对于分割块数较多的处理，按愈伤组织在平皿上的排布关系进行分组，同一组的放同一小离心管，根据检测结果确定有转化的愈伤组织及转化愈伤组织最多的组别，然后对该组中的所有愈伤组织逐一检测，确定有转化愈伤组织的分布，选取最中央的一块。有益效果本发明避免了转基因植物中的选择标记可能产生的不利影响，并且跨越了现有的各种去除选择标记的技术所存在的局限性及缺点，它还具有操作简便、便于推广应用的特点，本发明适用于所有可组织培养成功的植物。具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有培养基均用蒸馏水配制。实施例1:利用分割法将"P_l，3—葡聚糖酶基因"转入番茄受体变为番茄，品种为毛T-5(当前生产上广泛种植的品种)，供体变为携带有p-l，3-葡聚糖酶基因的pAHGGGI质粒，农杆菌菌株为LBA4404。愈伤组织培养时的培养基激素调整为BA1.2mg/l+IAA0.2mg/1。分割递进度为32+32+32+32(128)的处理，从诱导愈伤到再生植株，总共花了48天时间。对来自20块随机愈伤的20株再生苗进行检测的结果为纯合体6株、准纯合体5株、嵌合体4株、未转化的5株，有效转化率为55.0%。权利要求1、一种无标记转基因蔬菜的获得方法，其特征在于包括以下步骤(1)、转化处理转化的受体是外植体或愈伤组织，采用农杆菌介导转化，或用基因枪介导转化；(2)、组织培养将转化处理后的外植体诱导成愈伤组织并通过培养进一步扩增，将转化处理后的愈伤组织通过培养进一步扩增；(3)、分割处理将转化后形成的愈伤组织切分成尽可能小的小块，小块的体积≤1mm3，待小块长大后用直接对基因进行检测的方法对有目标基因的细胞或组织进行追踪，通过多次的分割处理，分割处理次数≥2次，确定出转化愈伤的具体分布，然后从转化愈伤组织密集区的中心区域选取转化了的愈伤组织分化植株或进行进一步的分割、鉴定及植株再生；(4)、分子检测用PCR等可直接对目标基因进行检测的方法选出有转化的愈伤组织；(5)、植株再生将选出的转化了的愈伤分化成再生植株；(6)、植株鉴定对再生植株逐一进行鉴定，保留所有最上部两个叶片均为阳性的植株。全文摘要一种无标记转基因蔬菜的获得方法涉及蔬菜转基因技术，尤其涉及无标记转基因技术的改进，属于植物生物工程领域。本发明就是一种无标记转基因蔬菜的获得方法。本发明包括以下步骤(1)转化处理；(2)组织培养；(3)分割处理；(4)分子检测；(5)植株再生；(6)植株鉴定。本发明适用于所有可组织培养成功的植物。文档编号C12N5/10GK101434966SQ20071015811公开日2009年5月20日申请日期2007年11月15日优先权日2007年11月15日发明者张淑娟申请人:张淑娟