专利名称：胃癌淋巴结转移的判断方法
技术领域：
本发明涉及判断胃癌淋巴结转移的方法、判断装置及其使用试剂盒。
背景技术：
近年来，在临床诊断领域，基因检查迅速普及。作为基因检查的一例，有癌症的淋巴结转移诊断。癌细胞脱离原发灶经血管和淋巴管转移到全身。在癌症手术中，需要尽可能将病灶切除干净，因此，要求正确地查出转移，并根据转移的程度采取适当处置。为此，术中的癌细胞淋巴转移的诊断显得尤为重要。作为癌症淋巴结转移的一种诊断方法，即以在正常细胞中不表达或表达量很低、在癌细胞中大量表达的蛋白质的核酸为靶核酸进行检测。随着近年来基因分析技术的发展，通过扩增、检测从生物体切除的淋巴结组织中所含靶核酸即可有效地进行癌症诊断。
为了用这种基因检查的方法检查癌向特定组织的转移，现在越来越多的人热衷于进行使用LAMP法(loop-mediated isothermalamplification method)和聚合酶链反应(PCR法，polymerase chainreaction)等检查癌基因的研究。这种基因检查可以通过检测组织和细胞等所含癌标志物(比如在癌细胞特异表达的蛋白质的mRNA等)进行。
众所周知，癌标志物(以下也单称为标志)之一角蛋白19(CK19)作为诊断乳腺癌淋巴结转移的标志非常有用。CK19是一种公认的在正常淋巴结的表达量和在转移到淋巴结的乳腺癌细胞上的表达量具有有意义之差的分子。
胃癌在中国、日本和韩国等亚洲和南美患者较多。据2003年癌症死亡人数统计，胃癌在日本，在男性中仅次于肺癌居第二位，在女性中仅次于大肠癌位居第二位。而且，癌症自觉症状很少，早期发现很困难，进展转移到淋巴结等的情况很多。
过去，人们使用角蛋白20和癌胚抗原作为判断胃癌淋巴结转移的标志。但关于胃癌基因检查的报告很少，判断胃癌淋巴结转移的更先进的方法有待开发。
发明内容
本发明旨在解决前述问题，目的是提供一种胃癌淋巴结转移的判断方法、判断装置及其试剂盒。
本发明提供一种胃癌淋巴结转移的判断方法，包括 定量步骤，定量用疑有胃癌转移的淋巴结组织制备的检测试样中的角蛋白19mRNA； 判断步骤，根据所得所述mRNA的定量结果判断胃癌的淋巴结转移。
所述判断步骤包括根据mRNA的定量值判断所述淋巴结组织中的转移灶转移度的步骤。
所述转移度为转移灶大小。
所述转移度为转移灶的癌细胞数。
在所述定量步骤用核酸扩增法定量所述角蛋白19的mRNA。
所述核酸扩增法为定量RT-PCR或定量RT-LAMP。
所述判断步骤包括比较所述mRNA定量值和预定的阈值，当定量值低于阈值时，判断胃癌淋巴结转移阴性，当定量值超过阈值时，判断胃癌淋巴结转移阳性。
所述mRNA定量值是所述检测试样中的所述角蛋白19mRNA的绝对量。
本发明还提供一种胃癌淋巴结转移判断装置，包括 定量系统，定量用疑有胃癌转移的淋巴结组织制备的检测试样中的角蛋白19mRNA； 判断系统，根据所得mRNA的定量值判断胃癌的淋巴结转移。
所述装置，还具备根据所得mRNA定量值，判断所述淋巴结组织中转移灶的转移度的第二判断系统。
本发明进一步提供一种用于判断胃癌淋巴结转移的试剂盒，其包括，用来制备检测试样的淋巴结组织前处理液、含能检出角蛋白19的引物的引物溶液以及含用于实施核酸扩增法的酶的酶溶液。
所述试剂盒的所述前处理液为含有二甲亚砜的缓冲液。
所述试剂盒的所述酶溶液含有RNA依赖型DNA聚合酶和DNA依赖型DNA聚合酶。
本发明可以提供一种胃癌淋巴结转移的判断方法、判断装置及其所用试剂盒。以此可以进行有效的胃癌基因检查。通过本发明还可以判断有胃癌转移的淋巴结组织中的转移灶的转移度。判断转移灶的转移度可以提供决定是否要手术的指标或决定手术方式的指标。
[图1]为本发明一实施方式的判断装置的整体结构斜视图。
[图2]为图1所示判断装置的作为定量系统的核酸扩增测定装置整体结构的斜视图。
[图3]为图2的核酸扩增测定装置的平面略图。
[图4]为本发明一实施方式的判断装置中作为判断系统的个人电脑CPU的转移判断流程。
[图5]为实施例1算出的胃癌淋巴结组织中CK19mRNA未标准化的拷贝数显示图。
[图6]为实施例2算出的胃癌淋巴结组织中CK19mRNA的标准化值的显示图。
[图7]为实施例3算出的胃癌淋巴结组织中CK19mRNA的拷贝数显示图。
[图8]为CK19mRNA定量值与转移灶大小的关系图。
[图9]为CK19mRNA定量值与癌细胞数的关系图。
[图10]为CK19mRNA定量值与转移灶大小的关系图。
[图11]为CK19mRNA定量值与癌细胞数的关系图。
[符号说明] 1 癌转移判断装置 101核酸扩增测定装置 51 反应部 52 浊度检测器 102电脑 102c 显示器 102d CPU
具体实施例方式 在本发明第一实施方式中，转移度只要是胃癌转移的淋巴结组织中能够反映转移程度或转移灶状态的东西均可，无特别限定。转移度比如可以表现为转移灶大小或转移灶中癌细胞数量。
淋巴结转移根据大小分为微转移(小转移)和大转移。转移灶长径小于2mm时，称为微转移(Micro metastasis)。转移灶长径大于2mm时，称为大转移(Macro metastasis)。小于0.2mm的转移灶称为游离癌细胞(Isolated Tumor CellITC)。一般一诊断为大转移，就要求摘除转移灶。微转移处于无法判断转移灶是否再增大的状态。本发明的一实施方式能够设定阈值，作为可识别微转移和大转移的数值。也可以根据转移灶的大小设定多个阈值。
在本发明一实施方式中，作为所用标本可以例举出含从胃癌患者身上采集的淋巴结组织的试样。更具体地说，可以例举出以生检为目的采集的胃癌附近的淋巴结组织。
作为检测试样，只要可以定量标本中角蛋白19的mRNA即可，并无特别限定。比如混合标本与前处理液，对前处理液中的标本进行化学和/或物理处理，让含在标本中的细胞中的mRNA移动(增溶)到溶液中，获得mRNA。可以以此溶液为检测试样。
作为前处理液只要是可溶解标本中所含细胞中的mRNA即可，无特别限定。比如可以缓冲液为前处理液。为了控制RNA的分解，最好缓冲剂为酸性。具体而言，pH的理想范围为2.5～5.0，最好为3.0～4.0。为了使pH保持在这一范围，可以使用公认的缓冲剂。作为缓冲剂具体名称，可以列举出甘氨酸-盐酸缓冲剂等。缓冲剂的浓度只要能够让缓冲剂pH保持在上述范围内即可，无特别限定。
前处理液里最好含有表面活性剂。用表面活性剂破损细胞膜和核膜。通过这种破损，细胞中的核酸更易移到溶液中。对表面活性剂的种类没有特别限制，只要有这种作用即可，不过最好为非离子型表面活性剂，以聚氧乙烯类非离子型表面活性剂为好。
特别以如下通式所示聚氧乙烯类非离子型表面活性剂最为合适 R1-R2-(CH2CH2O)n-H (在此，R1是碳原子数10～22的烷基、链烯基、炔基、异辛基；R2是-O-或-(C6H4)-O-；n为8～120的整数)。比如可以使用聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯鲸蜡醚、聚氧乙烯油酯醚、聚氧乙烯肉豆蔻醚、聚氧乙烯硬脂醚、聚氧乙烯壬基苯酚醚和聚氧乙烯异辛苯酚醚等。其中具体地说以Brij35(聚氧乙烯(35)月桂醚)为宜。前处理液中的表面活性剂浓度0.1～6％(v/v)为宜，1～5％(v/v)更好。
用后述核酸扩幅法定量mRNA时，该前处理液最好添加二甲亚砜(DMSO)。淋巴结中有时含有阻碍核酸扩幅中的酶反应的物质(阻碍物质)，通过DMSO的作用可以有效地减少阻碍物质的影响。DMSO还有抑制核扩增酶的活性降低的作用。作为前处理液中的DMSO浓度，以1～50％(v/v)为宜，5～30％(v/v)更好，最好是10～25％(v/v)。
通过使用上述前处理液，不必使用市场出售的提纯试剂盒等进行普遍进行的核酸抽取和提纯，就能够便捷地制备出检测试样。
上述标本与前处理液的混合比例没有特别限定，但对于1mg标本可以使用0.0001～0.005mL的前处理液。关于上述混合过程没有特别限定，比如可以在室温下进行标本与前处理液充分混合的时间。
在混合标本与前处理液中，最好在前处理液中破碎标本。作为破碎的方法，可以列举出用均质器均质化、冻结融化等。作为均质器，可使用在该领域中常用的东西，比如韦林氏搅切器、Potter-Elvehjem型均化器、Polytron型均化器、杜恩斯均化器、弗氏压碎器(French press)和超声波破碎机等。破碎条件根据使用方法和装置适当设定即可。
用上述方法破碎的破碎液通过离心分离、过滤器过滤、柱层析等一般使用的提纯方法进行初提纯，即可制备出检测试样。根据检测试样的状态，也可用核酸提取法等方法进行再提纯。
在本发明的一实施方式中，定量检测试样中的角蛋白19的mRNA可以用诸如核酸扩增法和DNA芯片等众所周知的方法。特别推荐使用核酸扩增法。
作为用于定量角蛋白19的mRNA的DNA芯片，可以使用固定了能与角蛋白19的cDNA杂交的多核甙酸及/或其片段的基质。使用DNA芯片检测RNA可以使用众所周知的常用方法。比如可以如下进行先利用与存在于检测试样中的mRNA3’端的polyA序列结合的引物进行逆转录反应。进行逆转录反应时，比如使用以Cy3和Cy5等荧光物质标记的核甙酸合成经荧光标记的cDNA。让该cDNA与上述固定了多核甙酸的基质接触，则此多核甙酸和被标记的cDNA形成双链。接着，测定cDNA的荧光即可定量角蛋白19的mRNA。
作为可用于定量角蛋白19的mRNA的核酸扩增法可以使用在核酸扩增反应前含逆转录反应的核酸扩增法、比如RT-PCR(ReverseTranscription PCR)法和RT-LAMP(Reverse Transcription LAMP关于LAMP法参照美国专利6410278号公报)法等众所周知的核酸扩增法。更具体地说，可以制备含有上述检测试样、能够检出角蛋白19的引物和实施核酸扩增法用酶的反应液，用所得反应液进行核酸扩增，测定扩增后的cDNA。
在本发明的一实施方式中，引物也可作为引物液、作为一种试剂提供。引物溶液只要含有用以检测角蛋白19的引物即可，并无特别限定。作为引物溶液，以引物在溶液中稳定、易保存的为宜。
在本发明一实施方式中，用于实施核酸扩增法的酶也可以作为酶溶液、作为一种试剂提供。作为酶只要可以实施核酸扩增法即可，并无特别限定。作为酶溶液比如可以使用分别单独调制RNA依赖型DNA聚合酶(逆转录酶)和DNA依赖型DNA聚合酶(以下也称为DNA聚合酶)制备的酶溶液或既含有逆转录酶又含有DNA聚合酶的酶溶液。从反应液调制的简便性来看，尤以既含有逆转录酶又含有DNA聚合酶的酶溶液为宜。
逆转录反应和核酸扩增反应可以按照引物的序列等适当改变条件。逆转录反应和核酸扩增反应的条件可以使用比如Sambrook，J.etal.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd ed.)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York上记述的条件。
作为用于检测角蛋白19的引物，如有可扩增角蛋白19的mRNA或cDNA的多核甙酸。其序列无特别限定，具体而言，可以举出下列序列号所示的引物。另外，序列号1和2所示引物为适于RT-PCR的引物对，序列号5～10所示引物为适于RT-LAMP的引物对。
[RT-PCR的引物] 序列号15′-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3′ 序列号25′-CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3′ [RT-LAMP的引物] 序列号5 5′-GGAGTTCTCAATGGTGGCACCAACTACTACACGACCATCCA-3′ 序列号6 5′-GTCCTGCAGATCGACAACGCCTCCGTCTCAAACTTGGTTCG-3′ 序列号75′-TGGTACCAGAAGCAGGGG-3′ 序列号85′-GTTGATGTCGGCCTCCACG-3′ 序列号95′-AGAATCTTGTCCCGCAGG-3′ 序列号105′-CGTCTGGCTGCAGATGA-3′ 上述引物也可以用在该技术领域常用的技术进行修饰。上述引物的标记可以用放射活性元素或无放射活性分子进行。所用放射活性同位素可以列举出32P、33P、35S、3H或125I。无放射活性物质可以从生物素、抗生朊、链霉亲和素或诸如地谷新配质那样的配体、半抗原、色素和诸如放射线发光性、化学发光性、生物发光性、荧光或磷光性试剂那样的发光性试剂中选择。
有逆转录活性的酶和DNA聚合酶可以使用在该技术领域众所周知的东西。作为具有逆转录活性的酶如有AMV(Avian MyeloblastosisVirus)逆转录酶和M-MLV(Molony Murine Leudemia Virus)逆转录酶等。作为DNA聚合酶可以使用Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、T4DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶等。
通过测定上述核酸扩增生成的核酸扩增生物即可定量角蛋白19的mRNA。此时，推荐采用定量RT-PCR(Quantitative ReverseTranscription-PCR)和定量RT-LAMP(Quantitative ReverseTranscription-LAMP)等。采用这些方法，随着核酸(cDNA)的扩增，反应液的光学状态(浊度、吸光度、荧光强度等)会发生变化，因此，实时测定之，即可定量角蛋白19的mRNA。
作为RT-PCR的具体例子可以使用众所周知的方法，比如Taqman(注册商标)法和SYBR Green法(嵌合荧光法)预先在核酸扩增反应前的反应液中添加SYBR Green，实时测定扩增反应中随着cDNA的扩增而增强的荧光强度。角蛋白19的mRNA定量值可以根据反应液的荧光强度达到一定值时所需要的循环数计算出来。
使用RT-LAMP时，随着cDNA的扩增，作为副产品生成大量焦磷酸镁。此焦磷酸镁为非溶性，反应液会随焦磷酸镁的增加而变浊。因此，通过实时对反应液的浊度(或吸光度)进行光学测定即可定量角蛋白19的mRNA。另外，在RT-LAMP法中也可使用上述SYBRGreen法。角蛋白19的mRNA定量值可以根据反应液的浊度、吸光度、荧光强度等达到一定值所需时间(检测时间)计算出来。
在本发明一实施方式中，作为判断胃癌淋巴结转移的步骤，只要是可以根据上述检测试样中的角蛋白19mRNA的定量值绝对或相对地判断胃癌淋巴结转移即可，并无特别限定，但应该将角蛋白19的mRNA定量值与阈值相比较。
角蛋白19的mRNA定量值可以不管有无标准化处理，用于胃癌淋巴结转移的判断步骤，但是，最好不进行标准化处理，以角蛋白19的mRNA绝对量作为定量值使用。
在此，所谓标准化指将定量上述角蛋白19的mRNA所获得的定量值换算为与含从胃癌患者身上采集的淋巴结组织的试样即标本数量相应的值。更具体地说就是指用标本量或反映该量的信息、推荐用内部标准、最好用管家基因的mRNA量或反映该量的信息除以定量上述角蛋白19的mRNA所获得的定量值。
所谓管家基因指一般认为在大多数组织和细胞中都有一定量表达的基因。作为管家基因，可以举出β-肌动朊、GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)、β2微球蛋白和HPRT1(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1)等基因。所谓反映管家基因的mRNA量的信息指用与角蛋白19同样的方法定量管家基因时所得信息。
在本发明一实施方式中，标本的管家基因的mRNA测定值也可以作为判断核酸扩增反应是否正确进行的质控品使用，而不用于标准化。管家基因在几乎各种细胞中均有表达，因此，如果检测出管家基因的mRNA，就可认为癌标志物的核酸扩增反应也适当进行。另一方面，若没有检测出管家基因的mRNA，则可考虑由于酶失活等原因使核酸扩增反应没有正确进行的可能性。
在本发明一实施方式中，所谓角蛋白19mRNA的绝对量指用于定量mRNA的检测试样中的角蛋白19mRNA的绝对量或反映该绝对量的信息。求绝对量时不进行上述标准化。用上述这种绝对量作为定量值，直接与预先设定的阈值进行比较，即可比经标准化步骤更正确地判断胃癌的淋巴结转移。
过去通过组织诊断判断癌转移的方法是先制作组织切片，经染色等处理后进行镜检。但是，镜检方式的组织诊断只能检查组织的一部分，一旦在不含癌细胞的部位切片的话，有可能漏过癌细胞。而通过分子检查判断癌转移能够使用从生物体采集的所有组织标本(或制作切片剩余的组织标本)，因此，与仅凭部分截面检查的组织诊断不同，漏诊的可能较小。
在本发明一实施方式中，阈值可以设定为低于已确认有胃癌淋巴结转移的阳性标本所含mRNA的定量值、高于已确认无胃癌淋巴结转移的阴性标本所含mRNA的定量值。最好预测数个阳性标本的mRNA定量值和数个阴性标本的mRNA定量值，将能以最高概率识别阳性标本和阴性标本的值设定为阈值。具体而言，当用定量RT-PCR法定量角蛋白质19的mRNA时，阈值设为8～690个拷贝数为宜，用定量RT-LAMP法定量角蛋白质19的mRNA时，阈值设为10～270个拷贝数为宜。
本发明判断方法的判断步骤是根据角蛋白19的mRNA定量值判断上述胃癌淋巴结转移的。比较角蛋白19的mRNA定量值与阈值，mRNA定量值比阈值高时可以断定淋巴结转移为阳性，比阈值低时则断定为阴性。通过取得这种判断结果即可作为手术方式、切除范围和术后治疗方针等的决定指标。
mRNA定量值根据癌转移度高低，与转移灶大小和转移灶所含癌细胞数量有关。因此，如上所述，根据mRNA定量值可以对淋巴结中的转移灶进行定量测定和阶段性测定。进行阶段性测定时，将mRNA定量值与预设的数个阈值作比较。此时，最好至少有一个阈值(第一阈值)设定为可识别癌阴性和癌阳性。这些阈值根据癌和肿瘤标志物种类适当设定。即使在定量测定转移灶时，也最好先用此第一阈值识别阴性和阳性，再对转移阳性的病灶进行癌病灶定量测定。
在本发明一实施方式中，第一阈值可以设定为低于已确认有癌细胞存在的淋巴结(阳性标本)所含mRNA的定量值、高于已确认无癌细胞存在的淋巴结(阴性标本)所含mRNA的定量值。最好预先测定数个阳性标本的mRNA定量值和数个阴性标本的mRNA的定量值，以能够概率最高地区分阳性标本和阴性标本的值作为阈值。
如要取得上述阶段性信息，则除第一阀值外还使用第二阈值。比如预先设定上述第一阈值和可识别弱阳性和强阳性的第二阈值。当mRNA的定量值低于第一阈值时，可判断实际上不存在癌病灶(即癌阴性)。当mRNA的定量值高于第一阈值、低于第二阈值时，可判断存在较小癌病灶(癌弱阳性)。当mRNA的定量值高于第二阈值时，可判断存在较大癌病灶(癌强阳性)。
淋巴结转移按大小分为微转移(Micro metastasis)和大转移(Macro metastasis)。转移灶长边不足2mm时称为微转移。转移灶长边超过2mm时称为大转移。不到0.2mm的转移灶称为游离癌细胞(Isolated Tumor CellITC)。一般诊断为大转移，则需要摘除转移灶。微转移则被认为处于无法判断转移灶是否会再变大的状态。在本发明一实施方式中，上述第二阈值可以设定为能识别微转移灶和大转移灶的值。除第二阈值以外，还可以根据转移灶大小设定数个阈值。
测定角蛋白19的mRNA的表达量可以测定淋巴结中癌细胞数和癌病灶的尺寸(面积、体积或质量等)。即，淋巴结中的角蛋白19的mRNA表达量可以作为决定胃癌患者摘除淋巴结的范围的指标。比如，如果检查的淋巴结没有大转移灶，则不必进一步扩大摘除范围。如果检查的淋巴结中有大转移灶，则有必要摘除更大范围的淋巴结。现在的病理诊断能够切实检出的2mm大转移灶的，从道理上说，淋巴结直径均为4mm以下。再大的淋巴结就有可能漏检转移灶。病理诊断与本发明的方法并用的话就可以降低漏检转移灶的可能性。
本发明的另一个实施方式胃癌淋巴结转移判断装置包括定量系统，定量用从胃癌患者身上采集的淋巴结组织制备的检测试样中的角蛋白19的mRNA；判断系统，根据上述mRNA的定量值判断胃癌的淋巴结转移。
在本发明一实施方式中，对定量系统没有特别限定，只要能够从胃癌患者身上采集淋巴结组织制备检测试样，定量其中的角蛋白19mRNA即可。作为定量系统推荐能定量经LAMP法和PCR法扩增的核酸的核酸扩增测定装置。该核酸扩增测定装置具有测定单元，用引物和核酸扩增酶扩增检测试样中的角蛋白19mRNA，测定所得核酸扩增产物。
在本发明一实施方式中，对判断系统无特别限定，只要能够根据上述定量系统定量的角蛋白19的mRNA定量值绝对或相对地判断胃癌淋巴结转移即可。作为判断系统以通过比较定量值和预设的阈值来判断癌转移的为宜。定量值尤以检测试样中的上述角蛋白19mRNA的绝对量为宜。此装置也可具备显示所得判断结果的显示器。
在本发明一实施方式中，装置还具有判断转移灶在淋巴结组织中的转移度的判断系统，转移度判断系统可以与判断癌转移的癌转移判断系统分设，也可以是将二者功能集于一身的一个装置。
胃癌淋巴结转移判断装置的一实施方式如图1～3所示。图1为本发明一实施方式的判断装置的整体结构斜视图。图2为图1所示作为定量系统的核酸扩增测定装置的整体结构斜视图。图3为图2所示核酸扩增测定装置的平面略图。
本发明某实施方式的判断装置如图1所示，由核酸扩增测定装置101和与该核酸扩增测定装置连接能进行有线或无线通信、作为判断系统的电脑(PC)102组成。
核酸扩增测定装置101如图2所示，包括分装器件10、上样单元20、吸嘴安装单元30、吸嘴废弃单元40、由5个反应检测块50a构成的反应检测单元50和用于向X方向和Y方向移动分装器件10的移送器60。
分装器件10如图2所示，包括被移送器60向X方向和Y方向(水平方向)移动的旋臂11和与旋臂11相对可各自独立向Z方向(垂直方向)移动的一对(二支)注射器12。
如图2和图3所示，上样单元20从装置前侧开始依次有10个试样管插孔21a～21j、一个酶试剂容器孔21k和一个引物试剂容器孔211。10个试样管插孔21a～21j分5行2列排列。试样管插孔21c和21d、试样管插孔21e和21f、试样管插孔21g和21h、试样管插孔21i和21j分别从装置里面向外依次置于上样位置1、上样位置2、上样位置3和上样位置4。
本实施方式中，正面左侧的试样管插孔21c、21e、21g和21i用于插装有对预先切除的生物组织(淋巴结)进行处理(匀质化、过滤等)制作的溶解提取液(检测试样)的试样管22，正面右侧的试样管插孔21d、21f、21h和21j插装有上述试样稀释到10倍的稀释试样的试样管23。
试样管插孔21a用于放置装阳性质控品的容器24，该阳性质控品用于确认应该扩增的核酸正常扩增；而试样管插孔21b用于放置装有阴性质控品的容器25，该阴性质控品用于确认不该扩增的核酸正常未扩增。
酶试剂容器插孔21k和引物试剂容器插孔211分别放置装有用于扩增角蛋白19mRNA相应的cDNA(以下也简称为CK19)的核酸扩增酶试剂的酶试剂容器26和装有CK19引物试剂的引物试剂容器27。
反应检测单元50的各反应检测块50a如图2和图3所示，由反应部51、二个浊度检测器52和闭合器件53(参照图2)构成。设置于各反应检测块50a的反应部51如图3所示，有二个用于放置检测池54的检测池孔51a。各反应检测块50a从装置里侧向外依次排列于池位1、池位2、池位3、池位4和池位5。
浊度检测器52由置于反应部51一侧基板55a上的由有465nm波长的兰色发光二极管组成的发光二极管光源52a和配置于反应部51另一侧基板55b上的光电二极管集光器52b构成。各反应检测块50a分别配置了由一个发光二极管光源52a和一个光电二极管集光器52b组成一组的浊度检测器52各二组。
检测池54有装试样的二个池54a和盖二个池54a的二个盖54b。
移送器60如图2所示，有向Y方向移送分装器件10的直行向导61和球型螺杆62、驱动球型螺杆62的步进电动机63、向X方向移送分装器件10的直行向导64和球型螺杆65、驱动球型螺杆65的步进电动机66。向X方向和Y方向移送分装器件10是靠步进电动机63和步进电动机66分别转动球型螺杆62和65实现的。
电脑102如图1所示包括输入设备键盘102a和鼠标102b、由监视器组成的显示器102c以及分析试样测定结果的CPU102d。
下面参照图1～图3就本实施方式的判断装置1的运行过程进行说明。本实施方式的装置如上所述，用RT-LAMP法对胃癌手术切除的淋巴结组织中的角蛋白19mRNA进行扩增，测定随着扩增产生的焦磷酸镁形成的白色沉淀物引起的浑浊度变化，以此定量角蛋白19的mRNA，将定量值与阈值比较，判断癌细胞向该淋巴结的转移的情况。下面就这种装置进行说明。
预先对切除组织进行处理(如匀质化、过滤等)，将由此制备的溶解抽取液(以下称试样)装入试样管22，将该试样管22插入试样管插孔21c～21j(参照图2及图3)。将装有阳性质控品的容器24和装有阴性质控品的容器25分别插入试样管插孔21a和21b(参照图3)。在酶试剂容器孔21k和引物试剂容器孔211分别放入装有CK19扩增用核酸扩增酶试剂的酶试剂容器26和装有CK19扩增用引物试剂的引物试剂容器27(参照图3)。吸嘴安装单元30设置2个各自收纳36个一次性吸移管吸嘴31的托盘32。
核酸扩增测定装置101一启动，首先，分装器件10的旋臂11被图2所示移送器60从初始位置移到吸嘴安装单元30后，分装器件10的二个注射器12在吸嘴安装单元30向下移动。于是，二个注射器12的顶端插入二个吸移管吸嘴31的上部开口处，从而自动装上吸移管吸嘴31。当二个注射器12向上移动之后，分装器件10的旋臂11向X方向移动，移向装有引物试剂的引物试剂容器27的上方。位于引物试剂容器27上方的一个注射器12向下移动，吸移引物试剂后向上移动。分装器件10的旋臂11被移送器60向Y方向移动，使另一个注射器12同样位于引物试剂容器27的上方。然后另一个注射器12向下移动，同样从引物试剂容器27吸移引物试剂后向上移动。如此，引物试剂容器27内的CK19引物试剂被安装在注射器12上的二个吸移管吸嘴31吸移。
引物试剂吸移后，二个注射器12都移到上面，分装器件10的旋臂11被移送器60移向位于最里面(正对装置的里侧)池位1的反应检测块50a上方。在最里面的反应检测块50a，二个注射器12向下移动，使装在二个注射器12的二个吸移管吸嘴31分别插入检测池54的二个池54a中，再用注射器12将CK19的引物试剂分别注入二个池54a中。引物试剂分装后，注射器12向上移动。
二个注射器12分装引物试剂后，向上移动，分装器件10的旋臂11被移送器60向X方向移动，移到吸嘴废弃单元40的上方。在吸嘴废弃单元40的上方，吸移管吸嘴31被丢弃。具体而言，二个注射器12向下移动，使吸移管吸嘴31插入吸嘴废弃单元40的二个吸嘴废弃孔40a(参照图3)。在此状态下，分装器件10的旋臂11被移送器60向Y方向移动，使吸移管吸嘴31移到槽40b下面，然后向上移动二个注射器12，吸移管吸嘴31上部的缘卡在槽40b下面，受到向下的力，从而吸移管吸嘴31自动脱离二个注射器12的嘴部，这样，吸移管吸嘴31就被丢弃在吸嘴废弃单元40。
接下来，以同样的动作酶试剂从酶试剂容器26分注到上述池54a，再以同样的动作将试样从试样管22和试样管23分注到上述池54a。
引物试剂、酶试剂和试样向上述池54a的吸移动作完成后，检测池54的盖54b闭合。当此闭合动作完成后，将检测池54内的液温从约20℃加热到约65℃，通过RT-LAMP反应对CK19mRNA相应的cDNA进行扩增。随扩增生成的焦磷酸镁形成白色沉淀物，用比浊法检测该白色沉淀物。具体而言，用图3所示发光二极管光源52a和光电二极管集光器52b检测(监测)扩增反应过程中检测池54内的浊度，进行浊度检测。
试样的浊度数据从核酸扩增测定装置101实时传送到电脑102。电脑102的CPU102d将试样浊度与预设阈值进行比较，从而判断胃癌的淋巴结转移。在此，还可同时判断向淋巴结转移的病灶大小。
在此，参照图4就电脑102的CPU102d的处理过程进行说明。首先，在步骤S1，CPU102d从核酸扩增测定装置101接收浊度数据。然后在步骤S2，CPU102d比较该浊度数据和预设阈值，以此判断癌转移为阳性还是阴性。在步骤S3，CPU102d将步骤S2判断的结果传送至显示器102c。
[实施例] 本实施例就通过定量从胃癌患者采集的淋巴结组织中的CK19mRNA来判断胃癌淋巴结转移的方法进行说明。
实施例1(用定量RT-PCR法判断胃癌的淋巴结转移> (1)检测试样的制备 用组织学上认为有胃癌转移的淋巴结(阳性淋巴结)10个和组织学上诊断为没有胃癌转移的淋巴结(阴性淋巴结)10个如下制备检测试样。
在各淋巴结(约50～600mg/个)中添加4mL含DMSO、pH3.4的处理液(含200mM甘氨酸-HCI、5％Brij35(聚氧乙烯(35)十二醇，希格玛公司生产)和20％DMSO(和光纯药制))，用搅拌机匀质化。将所得匀质液以10,000×g、室温下离心分离1分钟，用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN公司制，产品号74014)从200μL上清中提取、纯化RNA，得检测试样。
(2)定量CK19的mRNA 对如上从阳性淋巴结和阴性淋巴结制备的检测试样，采用实时PCR装置(ABI PRISM(注册商标)7000型荧光定量PCR仪，应用生物系统公司)用以下引物进行实时RT-PCR反应，定量CK19的mRNA。
实时RT-PCR使用RT-PCR试剂盒-Quanti Tect SYBR Green RT-PCR试剂盒(QIAGEN公司制，产品号204245)按照使用说明书进行，反应液的组成和反应条件如下 用于检测CK19的引物 上游引物5′-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3′(序列号1) 下游引物5′-CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3′(序列号2) 反应液 RNase free H2O 11.1μL 2×mastermix12.50μL 100μM上游引物(最终浓度500nM) 0.075μL 100μM下游引物(最终浓度500nM) 0.075μL QuantiTect RTmix0.25μL 检测试样1.00μL 合计25.00μL 反应条件 50℃、30分钟 95℃、15分钟 PCR以下工序重复40周期； 95℃、15秒 53℃、30秒 72℃、30秒。
求反应液荧光强度超过阈值(Threshold上述实时PCR仪配备的SDS软件自动设定的值)时的PCR周期数，根据此PCR周期数算出mRNA拷贝数。结果如图5所示。从图5的结果得知，通过将阈值设定为每个检测试样350个拷贝数，即可对胃癌转移得出与组织诊断的结果一致的判断。
实施例2 测定上述检测试样中β-肌动朊的mRNA的量作为管家基因。测定方法同实施例1中对CK19的mRNA的测定。用于PCR的引物如下 用于检测β-肌动朊的引物 上游引物5′-CCACACTGTGCCCATCTACG-3′(序列号3) 下游引物5′-AGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTCAG-3′(序列号4) 用在此所得β-肌动朊mRNA的拷贝数除以实施例1所得CK19的mRNA拷贝数(进行标准化)，结果如图6所示。从图6的结果可以看出，用作为管家基因的β-肌动朊mRNA的拷贝数除以CK19的mRNA拷贝数，进行标准化，也可判断胃癌的淋巴结转移。
从实施例1和2的结果可以看出，根据定量RT-PCR法定量CK19mRNA所得定量值可以判断胃癌淋巴结转移。并得知，定量值以CK19mRNA的绝对量更能明确区分阳性标本和阴性标本。
实施例3(用定量RT-LAMP法诊断胃癌的淋巴结转移> (1)检测试样的制备 用组织学上诊断为有胃癌转移的淋巴结(阳性淋巴结)7个和组织学上诊断为没有胃癌转移的淋巴结(阴性淋巴结)8个，如下制备检测试样。
在各淋巴结(约50～600mg/个)中添加4mL含DMSO、pH3.4的处理液(含200mM甘氨酸-HCI、5％Brij35(聚氧乙烯(35)十二醇，希格玛公司生产)和20％DMSO(和光纯药制))，用搅拌机匀质化。将所得匀质液以10,000×g、室温下离心分离1分钟，在20μL上清液中添加180μL处理液，得200μL检测试样。
(2)反应液的制备 混合以下各成份，制备13.97μL的反应液。
750mM TRIS缓冲液(pH8.0)1.00μl 10×Thermopol缓冲液(新英格兰bioLaboratorie公司生产)2.50μl 10mM dNTPs 2.00μl 100mM MgSO40.75μl 100mM 二硫苏糖醇 1.25μl 2％ Tergitol(Sigma Aldrich Japan公司制)2.50μl H2O3.97μl (3)酶试剂的制备 混合以下成份制备3.04μL的酶试剂。
10U/μl AMV逆转录酶(普洛麦格公司制)0.14μl 8U/μl Bst DNA聚合酶(新英格兰bioLaboratorie公司制) 2.27μl RNase inhibitor(普洛麦格公司制)0.63μl (4)引物的制备 混合以下成份制备6.00μL的引物溶液。
80pmol/μl上游内引物 1.00μl (序列号55′-GGAGTTCTCAATGGTGGCACCAACTACTACACGACCATCCA-3′) 80pmol/μl下游内引物 1.00μl (序列号65′-GTCCTGCAGATCGACAACGCCTCCGTCTCAAACTTGGTTCG-3′) 5pmol/μl上游外引物1.00μl (序列号75′-TGGTACCAGAAGCAGGGG-3′) 5pmol/μl下游外引物1.00μl (序列号85′-GTTGATGTCGGCCTCCACG-3′) 60pmol/μl loop上游引物1.00μl (序列号95′-AGAATCTTGTCCCGCAGG-3′) 60pmol/μl loop下游引物1.00μl (序列号105′-CGTCTGGCTGCAGATGA-3′) (5)RT-LAMP反应液的制备 制备由上述反应液、酶试剂和引物试剂构成的RT-LAMP反应液。RT-LAMP反应液是以CK19mRNA为铸模，用RT-LAMP法扩增cDNA的反应液。
(6)定量CK19的mRNA 将上述检测试样2μl添加到23μl RT-LAMP反应液，用实时浊度测定装置(Teramecs公司制LA-200)进行核酸扩增的同时，实时测定作为核酸扩增副产品生成的非溶性焦磷酸镁所造成的白浊。
测定从用RT-LAMP法扩增各检测试样中所含mRNA相应的cDNA到浊度达到0.1所需的时间(检测时间)，根据此值，计算出CK19mRNA绝对量。结果如图7所示。从图7可以看出，阈值设定为每个检测试样140拷贝数，即可使对胃癌转移的判断与组织诊断结果一致。
从实施例3的结果得知，定量RT-LAMP法也可以从CK19的mRNA定量值判断胃癌的淋巴结转移。
从以上结果看，显然根据角蛋白19的mRNA定量值可以得出有关胃癌淋巴结转移的正确判断结果。本发明的胃癌淋巴结转移的判断方法不论用何种mRNA定量法、特别是何种核酸扩增法，均可有效判断。
实施例4(定量RT-PCR法测定淋巴结转移灶大小) 对从9名胃癌患者采集的11个淋巴结测定癌细胞数和CK19mRNA表达量。
(1)测定转移灶大小并对癌细胞计数 从有胃癌(非充实低分化腺癌)转移的11个淋巴结切出厚约10μm的切片，放在载玻片上。对该切片用抗CK19抗体和Envision试剂盒(均为DAKO公司产品)进行免疫组织化学染色。再用GS-710Calibrated Densitometer(Bio-Rad公司制)检测该切片的癌细胞转移灶大小(mm2)。用WinROOF(三谷商事株式会社)对癌细胞计数(细胞数/片)。
(2)定量CK19的mRNA 在上述(1)制作的切片邻近处切取切片(厚约10μm)，用RNeasyMini试剂盒(QIAGEN公司制)提取RNA，制备RNA试样。用此RNA试样配制以下成份的反应液，通过TaqMan法计算出CK19mRNA的拷贝数(拷贝数/片)。TaqMan法的测定用TaqMan一步法RT-PCR混合试剂盒(TaqMan One-step RT-PCR Master Mix)和PRISM7700实时荧光PCR仪(Prism 7700 Realtime PCR system)(均为ABI(应用生物系统公司)产品)按照所附使用说明书进行。
反应液 RNase free H2O10.205μL TaqMan 2x Universal PCR混合试剂盒 12.5μL 40X MultiScribe and RNase Inhibitor Mix 0.63μL 100μM上游引物0.075μL 100μM下游引物0.075μL 9.7pmol/μL(终浓度200nm)TaqMan探针0.515μL 检测试样 1μL 合计 25.00μL 检测CK19mRNA的引物序列和TaqMan探针的序列如下 上游引物5′-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3′(序列号1) 下游引物5′-CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3′(序列号2) TaqMan探针5′-GCCTACCTGAAGAAGAACCATGAGGAGGAA-3′ (序列号11) 此TaqMan探针5′端有6-羧基荧光素(FAM)，3′端有6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)。
反应条件 48℃、30分钟 95℃、10分钟 PCR以下工序重复40周期； 95℃、15秒 60℃、1分。
图8显示了mRNA的定量值(拷贝数/片)与胃癌转移灶大小的关系。图9显示了定量值与癌细胞数的关系。从图8和图9可以确认，mRNA的定量值与转移灶大小和癌细胞数有关。因此，可以确认，定量淋巴结的CK19mRNA可以预测转移灶的大小。
实施例5(用定量RT-LAMP法测定淋巴结转移大小) 对从9名胃癌患者采集的11个淋巴结测定癌细胞数和CK19mRNA表达量。
(1)测定转移灶大小并对癌细胞计数 按照实施例4(1)所述方法，从有胃癌(非充分低分化腺癌)转移的11个淋巴结制作厚10μm的切片，进行免疫组织化学染色。然后，按实施例4(1)所述方法测定这些切片的癌细胞转移灶大小(mm2)。再按实施例4(1)所述方法对癌细胞数(细胞数/片)计数。
(2)定量CK19的mRNA 在上述(1)切取的切片邻近处切取切片(厚约10μm)，用RNeasyMini试剂盒(QIAGEN公司制)提取RNA，制备RNA试样。然后按实施例3所述方法制备反应液，实施RT-LAMP。
图10显示了mRNA的定量值(拷贝数/片)与胃癌转移灶大小的关系。图11显示了定量值与癌细胞数的关系。从图10和图11可以确认，mRNA的定量值与转移灶大小和癌细胞数有关。因此，可以确认，定量淋巴结的CK19mRNA可以预测转移灶大小。
序列表
<110>希森美康
<120>胃癌淋巴结转移的判断方法
<160>11
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
cagatcgaag gcctgaagga20
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
cttggcccct cagcgtact 19
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
ccacactgtg cccatctacg20
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>aggatcttca tgaggtagtc agtcag
<400>4
aggatcttca tgaggtagtc agtcag 26
<210>5
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ggagttctca atggtggcac caactactac acgaccatcc a
<400>5
ggagttctca atggtggcac caactactac acgaccatcc a41
<210>6
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>gtcctgcaga tcgacaacgc ctccgtctca aacttggttc g
<400>6
gtcctgcaga tcgacaacgc ctccgtctca aacttggttc g41
<210>7
<211>18
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<220>
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<400>7
tggtaccaga agcagggg 51
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>gttgatgtcg gcctccacg
<400>8
gttgatgtcg gcctccacg 19
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>agaatcttgt cccgcagg
<400>9
agaatcttgt cccgcagg 18
<210>10
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>cgtctggctg cagatga
<400>10
cgtctggctg cagatga 17
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的用作TaqMan探针的核苷酸序列
<400>11
cctcaataac acatacaact caaaa2权利要求
1. 一种胃癌淋巴结转移的判断方法，包括
定量步骤，定量用疑有胃癌转移的淋巴结组织制备的检测试样中的角蛋白19mRNA；
判断步骤，根据所得所述mRNA的定量结果判断胃癌的淋巴结转移。
2. 权利要求1所述方法，其特征在于所述判断步骤包括根据mRNA的定量值判断所述淋巴结组织中的转移灶转移度的步骤。
3. 权利要求2所述方法，其特征在于所述转移度为转移灶大小。
4. 权利要求2或3所述方法，其特征在于所述转移度为转移灶的癌细胞数。
5. 权利要求1所述方法，其特征在于在所述定量步骤用核酸扩增法定量所述角蛋白19的mRNA。
6. 权利要求5所述方法，其特征在于所述核酸扩增法为定量RT-PCR或定量RT-LAMP。
7. 权利要求1所述方法，其特征在于所述判断步骤包括比较所述mRNA定量值和预定的阈值，当定量值低于阈值时，判断胃癌淋巴结转移阴性，当定量值超过阈值时，判断胃癌淋巴结转移阳性。
8. 权利要求1所述方法，其特征在于所述mRNA定量值是所述检测试样中的所述角蛋白19mRNA的绝对量。
9. 一种胃癌淋巴结转移判断装置，包括
定量系统，定量用疑有胃癌转移的淋巴结组织制备的检测试样中的角蛋白19mRNA；
判断系统，根据所得mRNA的定量值判断胃癌的淋巴结转移。
10. 权利要求9所述装置，还具备根据所得mRNA定量值，判断所述淋巴结组织中转移灶的转移度的第二判断系统。
11. 一种用于判断胃癌淋巴结转移的试剂盒，其包括，用来制备检测试样的淋巴结组织前处理液、含能检出角蛋白19的引物的引物溶液以及含用于实施核酸扩增法的酶的酶溶液。
12. 权利要求11所述试剂盒，其特征在于所述前处理液为含有二甲亚砜的缓冲液。
13. 权利要求11或12所述试剂盒，其特征在于所述酶溶液含有RNA依赖型DNA聚合酶和DNA依赖型DNA聚合酶。
全文摘要
发明提供胃癌淋巴结转移的判断方法、判断装置及其试剂盒。通过包括以下步骤的胃癌淋巴结转移判断方法、基于该方法的判断装置及该方法所用试剂盒解决上述课题定量步骤，定量用疑有胃癌转移的淋巴结组织制备的检测试样中的角蛋白19mRNA；判断步骤，根据所得上述mRNA的定量结果判断胃癌的淋巴结转移。
文档编号C12M1/34GK101260428SQ20081000044
公开日2008年9月10日 申请日期2008年1月10日 优先权日2007年1月15日
发明者高田英基, 桧山佳代, 中林一树, 大友泰裕 申请人:希森美康株式会社