专利名称：：表达人creg的重组腺病毒及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种携带人E1A激活基因阻遏子(CREG)基因的重组腺病毒，本发明还涉及所述重组腺病毒用于制备对PCI术后再狭窄具有明确抑制作用的药物的用途。
背景技术：
：经皮冠状动脉内介入治疗(PCI)是目前冠心病治疗的主要手段之一，全球每年有超过280万的冠心病患者接受PCI治疗，但术后10%—70%的再狭窄发生率降低了其带来的益处。在我国，PCI的数量逐年递增，再狭窄发生的数量也逐年上升，已经成为一个非常严峻的问题，针对再狭窄的发生，临床上应用了许多方法来预防其发生发展，包括抗血栓、调脂、再次PCI、支架植入术、切割球嚢、药物洗脱支架、血管内放射治疗及光动力疗法等。但这些方法不能根除再狭窄，不仅费用昂贵，而且长期效果尚不确定。基因治疗再狭窄越来越显示出优势。从基因水平来看，任何疾病都是由于体内基因发生改变而引起的，将有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷可以达到治疗疾病的目的，对于再狭窄的治疗也是如此。E1A激活基因阻遏子(cellularrepressorofE1A-activatedgenes，CREG)是一种细胞转录调控因子，其最早是Gill等通过酵母双杂交技术在果蝇cDNA文库中获得的可能与TBP转录因子相互作用的蛋白质序列，研究发现其部分氨基酸序列与E1A相同，故可以直接对抗E1A的激活作用。随后在人Hela细胞cDNA文库中克隆到全长约为2.Okb的人CREG基因的cDNA全长序列(Gi11G.MolCellBiol，1998;18(9):5032—5041)。文献检索发现，CREG蛋白在成熟分化的组织细胞中广泛表达，在去分化组织如小鼠胚胎干细胞、人畸胎瘤细胞却是低表达的，研究表明CREG具有抑制细胞增殖的作用，提示其可能对以血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)增生为主要病理机制的PCI术后再狭窄防治具有潜在价值[VealE.O画gene.2000;19(17):2120-2128;GillG.MolCellBiol，1998;18(9):5032-5041;DiBaccoA.Oncogene,2003;22(35):5436-5445]。本发明人在国际上最先报道了CREG基因对体外培养和在体损伤后的血管平滑肌细胞增殖具有明显的抑制作用(HanYL.Zhonghuayixuezazhi，2005;85(1):49-53),其中介导CREG基因的载体为逆转录病毒载体。然而，逆转录病毒存在以下缺陷首先，逆转录病毒仅能感染增生期的血管平滑肌细胞，感染效率较低；其次，逆转录病毒载体是一种能够稳定整合到宿主细胞基因组中并长期稳定表达的载体，因而可能破坏宿主细胞基因组的稳定性，不具有临床用药的可行性；再次，在防治PCI术后再狭窄的研究中，最理想和最可行的给药途径为血管内给药，而逆转录病毒载体仅适用于通过动脉球嚢损伤术后聚醚(pluronicF127)载体包裹血管外膜向血管内膜渗透的緩释方式完成(因球嚢损伤术后血管的血管平滑肌细胞增殖需要一定过程，血管内的即刻给药方式是不起效的)，但这种緩释方式仅适用于动物的实验性研究，缺乏临床应用的可行性。为克服上述现有技术的缺陷，本发明人采用经修饰的腺病毒作为载体，构建了携带人CREG基因的重组腺病毒，有望用于防治PCI术后再狭窄的基因治疗。
发明内容本发明的一个方面，涉及一种携带人CREG基因的重组腺病毒。在本发明中，所述CREG基因是指人CREG基因，其序列如SEQIDNO:1所示(网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrezdb-Nucleotide,GenBank登录号NM_00385。具体序列如下所述，方框所示为CREG起始和终止密码子)5-GGATCC刚GCCGGGCTATCCCGCGGGTCCGCGCGCGCACTGCTCGCCGCCCTGCTGGCGTCGACGCTGTTGGCGCTGCTCGTGTCGCCCGCGCGGGGTCGCGGCGGCCGGGACCACGGGGACTGGGACGAGGCCTCCCGGCTGCCGCCGCTACCACCCCGCGAGGACGCGGCGCGCGTGGCCCGCTTCGTGACGCACGTCTCCGACTGGGGCGCTCTGGCCACCATCTCCACGCTGGAGGCGGTGCGCGGCCGGCCCTTCGCCGACGTCCTCTCGCTCAGCGACGGGCCCCCGGGCGCGGGCAGCGGCGTGCCCTATTTCTACCTGAGCCCGCTGCAGCTCTCCGTGAGCAACCTGCAGGAGAATCCATATGCTACACTGACCATGACTTTGGCACAGACCAACTTCTGCAAGAAACATGGATTTGATCCACAAAGTCCCCTTTGTGTTCACATAATGCTGTCAGGAACTGTGACCAAGGTGAATGAAACAGAAATGGATATTGCAAAGCATTCGTTATTCATTCGACACCCTGAGATGAAAACCTGGCCTTCCAGCCATAATTGGTTCTTTGCTAAGTTGAATATAACCAATATCTGGGTCCTGGACTACTTTGGTGGACCAAAAATCGTGACACCAGAAGAATATTATAATGTCACAGTTCAG|TGA|GAATTC-3，(SEQIDNO:1)。在本发明中，用于递送所述人CREG基因的载体为第一代腺病毒载体，即El和E3区缺失型重组腺病毒载体。这一病毒载体由于E3区缺失而失去了细胞毒性效应，El区缺失后失去了自主复制能力，需在包装细胞系293A中才能复制扩增。本发明中的CREG基因是通过腺病毒入门载体pShuttle-CMV和腺病毒骨架载体pAdeasy-l同源重组的方法构建成上述带有CREG基因的重组腺病毒载体。本发明的另一方面，涉及所述携带人CREG基因的重组腺病毒用于制备血管成形术后血管再狭窄防治药物的用途。在本发明中，术语"防治"是指治愈、预防、抑制或至少部分阻止或部分预防目标疾病或病症，例如血管成形术后血管再狭窄。本发明的具体实施方案如下1、通过RT-PCR方法扩增人CREG基因cDM序列，将克隆到重组的腺病毒载体上，感染腺病毒包装细胞，从而获得CREG重组腺病毒。2、在体外的细胞培养研究中证明该CREG重组腺病毒可以有效的感染VSMC，抑制VSMC的增殖。3、在体颈动脉球嚢损伤模型研究证明CREG重组腺病毒可以有效感染在体VSMC，并介导其在VSMC中表达发挥生物学效应。4、在体颈动脉球嚢损伤后的CREG重组腺病毒治疗研究证明CREG重组腺病毒导入损伤血管后，能抑制血管新生内膜形成，实现防治再狭窄的目的。图1:颈动脉球嚢损伤及局部基因感染模示图，其中图1A表示入路，图1B表示球嚢损伤，图1C表示球嚢堵塞后腺病毒带入损伤血管，图1D表示结扎颈外动脉。图2:重组CREG腺病毒表达抑制球嚢损伤后的兔颈动脉再狭窄发生，其中图2A显示重组GFP腺病毒感染后在兔颈动脉中高表达；DAPI表示细胞核染色。图2B表示GFP和CREG腺病毒感染四周后，球嚢损伤血管中新生内膜形成的HE染色结果，提示CREG腺病毒感染抑制损伤后血管新生内膜的形成。图2C表示双侧颈总动脉造影显示GFP和CREG腺病毒感染四周后，球嚢损伤血管再狭窄情况。提示CREG腺病毒感染抑制球嚢损伤血管再狭窄发生。具体实施例方式下列实施例是对本发明的进一步解释和说明。实施例1.携带人CREGcDNA全序列的重组腺病毒载体的构建根据GenBank(NM-003851)中给出的CREGcDM序列设计CREG基因的RT-PCR引物，引物序列如下正向引物5、---aaggatccatggccgggctatcccgc-3'反向引物5'-gcgaattcteactgaactgtgacattataatattcttctgg-3'具体条件dH2036.5iaLd證4iaL緩冲液5ML引物(l)1.5jaL引物(2)1pL模板lMLDNA聚合酶(Takara7^司)94。C15秒、58。C3Q秒^45个循环72。C40秒1JUL从人体外培养的VSMC中提取mRNA并反转录成cDNA(TakaRa公司的cDM第一链合成试剂盒)。扩增条件是25°C，5分钟，42°C，50分钟，95°C，10分钟。通过下列反应体系和反应条件扩增出人CREGcDNA编码序列共667碱基，并将其克隆到pGEX-4T-l(+)载体(Amersham，No:27-4580-01)上。用亚克隆才支术通过Kpnl和Xhol两个酶切位点将pGEX-4T-l(+)/CREG中的CREGcDNA经pVAXl质粒(Invitrogen，No:V260-20)正向克隆至腺病毒入门载体pShuttle-CMV(QBI，No:AESIOOO)，将构建成功的入门载体pShuttle-CMV/CREG经Pmel酶切线性化后，与腺病毒骨架载体pAdeasy-l(QBI，No:AESIOOO)共转化大肠杆菌BJ5183(QBI，No:AES1005K))获得重组腺病毒载体pAd-CREG，以上每一步均经测序证实序列与GenBank(NM—003851)所述序列完全一致。依照用于专利程序的布达佩斯条约，发明人于2008年1月2日将如上述获得的重组腺病毒命名为人腺病毒5型Ad5-CREG，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，武汉大学)，保藏号为CCTCC-V200801。2.重组腺病毒表达载体的包装及扩增采用磷酸钙沉淀法进行。感染前一天将包装细胞系293A(QBI，No:AES0503)接种于35mm培养皿(含10%FBS的DMEM)上，使细胞在感染当天达到70%~80%的融合率。在一个无菌10mL试管中，加入以PacI酶切线性化的pAd-CREGDM5~10jug，双蒸水207mL和2mol/LCaC1230jjl，混匀，迅速加入250pl的2xhbs(0.01MHEPES緩沖液pH7.4，0.15MNaCl，3mMEDTA，0.005%表面活性剂P20)，用移液枪吹打3一15秒，至吹打出丰富的泡沫。弃掉35腿皿中的培养基，重新加入1.5mL含10%新生牛血清的新鲜DMEM培养基，加入终浓度5jumol/L的氯喹，5分钟后，均匀而快速地滴加0.5mL上述混合物。37。C，5%C02培养24小时后，弃掉培养皿中的培养基，重新加入2mL含10%新生牛血清的新鲜DMEM培养基。约2周后可见病毒空斑出现。待大部分细胞出现空斑效应后，反复冻融3次收取腺病毒。以重组CREG腺病毒Ad5-CREG重复感染293A细胞，扩增并收获腺病毒，-80°C保存备用。3.重组CREG腺病毒Ad5-CREG滴度测定以TCID50法测定腺病毒滴度(ProcNatlAcadSci.1998;95(5):2509-2514)。预先将293A细胞以1x104/孔密度接种于含10。/。FBS的DMEM的96孔板上，24小时后以倍比稀释法用DMEM完全培养基准备10—3，10-4.......10—1。共10个不同滴度的病毒液,分别加入96孔板的每一行中，最后两孔不加病毒液，作为对照孔。继续培养10天，于倒置显微镜下计数出现细胞病变效应(CPE)的孔数N。重組CREG腺病毒滴度用以下公式计算病毒滴度(pfu/mL)=101+°'""+15)。4.重组CREG腺病毒Ad5-CREG感染后抑制体外培养的VSMC增殖将VSMC接种于35mm培养皿含10%新生牛血清的DMEM上，用0.5%新生牛血清的新鲜DMEM培养基培养48小时的VSMC更换含10%新生牛血清的新鲜DMEM培养基继续培养24小时，使细胞在感染当天达到70%~80%的融合率。按不同比例(l:10、1:100、1:400MOI)分别加入重组CREG腺病毒-DMEM混合液，单纯加入DMEM培养基和加入重组绿色荧光蛋白(GFP)腺病毒(购自上海美季生物技术有限公司)-DMEM混合液组作为空白对照和载体对照组。感染24小时后，更换为含10。/。新生牛血清的新鲜DMEM培养基。继续培养24小时后，O.25%胰酶收获细胞，70%冰乙醇固定24小时后，用碘化乙锭染色进行细胞周期分析。结果显示重组CREG腺病毒感染后，VSMC增殖受到明显抑制，G0/G1期细胞比率显著增加(表l)。表1不同浓度重组CREG腺病毒Ad5-CREG感染VSMC细胞的周期分布DMEM组GFP组1:101:1001:400G0/G132.8234.6939.0845.8348.98S37.8642.6244.5939.5438.46G2/M29.2322.6916.3314.6312.56注数据是各细胞周期占总计数细胞的比率，共计数2xl(T个细胞5.兔颈动脉球嚢损伤模型的建立雄性新西兰大白兔36只[12-18个月龄，体重(3-3.5Kg)]随机分为3组，每组12只①空白对照组；②重组CREG腺病毒感染组；③重组GFP腺病毒对照组。参照文献建立颈动脉损伤的实验模型(LiuQ，etal.Circulation.2005;111:1833-1840)，如图1所示。以2%戊巴比妥钠30rag/kg体重静脉注射麻醉动物，常规消毒，沿颈前正中线切开皮肤，在颈前三角区暴露左颈总动脉(CCA)及颈内动脉(ICA)、外动脉(ECA)，用穿刺针穿刺法，自颈外动脉向近心端插入3.0mm直径的经皮腔内冠状动脉成形术球嚢导管至CCA腔内起始部，注入生理盐水，使球嚢充分膨胀并产生轻微阻力，慢速回拉球嚢至ICA、ECA分叉处，回拉距离约为5cm，反复3次使颈总动脉内膜被充分剥脱破坏。于CCA起始部扩张球嚢并固定，再沿ECA插入第二根2.5mm有中心腔的快速交换(OTW)球嚢，于CCA分叉处扩张OTW球嚢并固定。以生理盐水沖洗两球嚢间的动脉段3次以除净血液后，三组动物分别注入lx1(Tpfu重组CREG腺病毒液(含有重组CREG腺病毒Ad5-CREG的PBS溶液)、重组GFP腺病毒液(同CREG腺病毒浓度和组成一致)或生理盐水lmL，孵育30分钟，其后抽出病毒液，以生理盐水冲洗2次，结扎穿刺处ECA，逐层缝合皮下组织与皮肤，常规分笼饲养。术后常规静脉注射青霉素40万单位以预防切口处感染。6.腺病毒可将靶基因有效感染到动物颈动脉血管中用我们创建的上述双球嚢孵育重组腺病毒法将不同浓度的重组GFP腺病毒(2xl(Tpfu—lxl(Tpfu)感染到球嚢拉伤的动物颈动脉血管中。将感染重组GFP腺病毒组的兔颈动脉血管直接行冰冻切片，在荧光显微镜下观察显示，重组GFP腺病毒感染后兔颈动脉中GFP蛋白呈高表达(图2A)。Westernblot分析也显示重组GFP腺病毒感染组动物颈动脉的总蛋白中有较高的GFP蛋白表达，并可维持至术后2周左右(图2B)，提示该法能将靶基因(CREG基因和GFP基因)有效感染到动物颈动脉血管中(表2)。表2不同感染时间的重组腺病毒在血管中的表达分析(ng/jaL)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>7.腺病毒介导的CREG表达抑制动脉损伤后内膜形成免疫组化染色分析显示，重组GFP腺病毒感染组动物在动脉损伤7天后有明显的新生内膜形成，以后逐渐增厚，28天时内膜形成达到高峰。能够反应内膜与中膜增厚相对变化的更敏感指标内膜/中膜面积比值的变化趋势也同内膜面积的变化一致。与GFP组相比，CREG感染组的内膜面积在动脉球嚢损伤后降低了32%，内膜/中膜面积比值降低了45°/。。兔在体双侧颈总动脉造影显示，术后28天CREG组管腔内径比GFP感染组增加了34%(图2C，表3)。表3术后28天重组CREG腺病毒治疗后血管形态学指标分析<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>8.实验的统计学处理方法本研究实验数据均为平均值±SD。组间比较应用单因素ANOVA分析，统计学处理均应用SPSS11.5.0软件包处理。P<0.05为有统计学差异。序列表<110〉中国人民解放军沈阳军区总医院〈120〉表达人CREG的重组腺病毒及其用途〈130〉IDC070106〈140>200810000053.8<141〉2008-(U-04〈160〉3<170〉Patentlnversion3.3<210〉1〈211〉675<212〉腿〈213〉CREG基因<■>1tgctcgccgccctgctggcg60gcggcggccgggaccacggg120gcgaggacgcggcgcgcgtg180ccaccatctccacgctggag240gcgacgggcccccgggcgcg300tctccgtgagcaacctgcag360ccaacttctgcaagaaacat420tgtcaggaactgtgaccaag480tcattcgacaccctgagatg540tgaatataaccaatatctgg600aagaatattataatgtcaca660675ggatccatggccgggctatctcgacgctgttggcgctgctgac化ggacgaggcctcccggcccgcttcgtgacgcacgtgcggtgcgcggccggcccttggcagcggcgtgccctatttgagaatccatatgctacactggatttgatccacaaagtccaaaarctggccttccagccagtcctggactactttggtggccgcgggtccgcgcgcgcaiccgtgtcgcccgcgcggggtcgctgccgccgctaccaccccctccgactggggcgctxtggcgccgacgtcctctcgctcactacctgagcccgctgcagcgaccatgactttggcacagacctttgtgttcacataatgctattgcaaagcattcgttattaattggttctttgctaagtaccaaaaatcgtgacaccag<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>权利要求1、一种携带人E1A激活基因阻遏子(CREG)基因的重组腺病毒。2、权利要求1所述重组腺病毒用于制备对PCI术后再狭窄具有明确抑制作用的药物的用途。全文摘要本发明涉及一种携带人E1A激活基因阻遏子(CREG)基因的重组腺病毒，本发明还涉及所述重组腺病毒用于制备对PCI术后再狭窄具有明确抑制作用的药物的用途。文档编号C12N15/861GK101475961SQ20081000005公开日2009年7月8日申请日期2008年1月4日优先权日2008年1月4日发明者建康,捷邓,亮郭,韩雅玲申请人:中国人民解放军沈阳军区总医院