糖化方法

专利名称：糖化方法
糖化方法对序列表的引用本发明包含计算机可读形式的序列表。通过引用将计算机可读形式并入本文。 发明领域本发明涉及用于生产啤酒用麦芽汁和用于产生啤酒的改进的糖化方法。
背景技术：
在现代的糖化方法中，当酶中的糖化麦芽量较低或允许使用所有辅助谷物 (adjunct grist)时，经常将酶作为补充剂而加入。也在用高含量酶进行充分修饰的麦芽 的糖化中使用酶，以增加提取回收率以及可发酵糖的量。因此公知应用脱支酶，例如，异 淀粉酶或支链淀粉酶，以增加可发酵糖的得率。可以在用于产生低热量啤酒的方法中应 用脱支酶。这种方法为 Willow 等(MBAATechnical Quarterly，1977，14 :105)、美国专利 No. 4，528，198,4, 666，718 和 4，318，927 和 GB 2056484 和 GB 2069527 的主题。发明概述本发明的发明人现在令人惊讶地发现，通过使用某种支链淀粉酶，可以使用更少 量的酶蛋白而实现糖化。因此，在第一方面，本发明提供用于产生啤酒用麦芽汁的方法，其中包括由谷物形 成醪，并将所述醪与支链淀粉酶(E. C. 3. 2. 1.41)接触，其中所述支链淀粉酶具有氨基酸， 所述氨基酸序列a)与SEQ ID NO :4中所示氨基酸序列至少50%相同，或b)由在低严紧条 件下与下述杂交的核酸序列编码i)编码SEQ ID NO :4中所示氨基酸序列的核酸序列的互 补链，或ii) (i)的至少100个核苷酸的亚序列。在第二方面，本发明提供根据由第一方面的方法产生的麦芽汁。在第三方面，本发明提供由第一方面的方法产生的浓缩的和/或干燥的麦芽汁。在第四方面，本发明提供由第二和第三方面的麦芽汁产生的啤酒。在第五方面，本发明提供适用于第一方面的方法中的组合物，所述组合物包括支 链淀粉酶(E. C. 3. 2. 1. 41)、葡糖淀粉酶和可选的α _淀粉酶，其中支链淀粉酶具有氨基酸 序列，所述氨基酸序列a)与SEQ ID NO :4中所示的氨基酸序列至少50%相同，或b)由在 低严紧条件下与下述杂交的核酸序列编码i)编码SEQ ID NO :4中所示氨基酸序列的核酸 序列的互补链，或ii) (i)的至少100个核苷酸的亚序列。发明详述酿造方法在本领域中公知，并且通常包括发麦芽(malting)、糖化(mashing)和发 酵的步骤。糖化是将来自碎大麦麦芽和固体辅料的淀粉转化成可发酵和不可发酵的糖，从 而产生具有理想组成的麦芽汁的方法。传统的糖化包括将碎大麦麦芽和辅料与水在设定温 度和以设定体积混合，以使在发麦芽工艺中开始的生物化学变化继续进行。糖化方法在各 种温度进行一段时期，以活化负责降解蛋白质和糖的内源酶。至今为止，糖化中带来的最重 要的变化是将淀粉分子转化成可发酵糖。在传统的糖化方法中负责淀粉转化的主要的酶是 α_和淀粉酶。α-淀粉酶通过将淀粉分子分解成很多可受到β-淀粉酶攻击的更短
3的链而非常快速地还原不可溶和可溶的淀粉。产生的二糖是麦芽糖。除了在糖化过程中形 成的麦芽糖之外，还产生短的支链葡萄糖寡聚物。短的支链葡萄糖寡聚物是不可发酵的糖， 能够使成品啤酒味道更好，并增加热量。在糖化后，当所有淀粉都已经分解时，需要从固体(酒糟)分离液体提取物(麦 芽汁)。麦芽汁的分离和过滤很重要，因为固体包含大量的蛋白质，基本未修饰的(poorly modified)淀粉，含脂肪材料，硅酸盐和多酚(丹宁)。在从酒糟分离麦芽汁后，可以用酿造 酵母发酵酒糟以产生啤酒。关于常规酿造方法的详细信息可以在Research and Teaching Institute ofBrewing, Berlin (VLB)的 Wolfgang Kunze 的"Technology Brewing andMalting" , 1999 年第二版修订版，ISBN 3-921690-39-0中找到。在糖化过程中形成的短的支链葡萄糖寡聚物可以通过加入外源酶(除了麦 芽之外加入的酶)而进一步水解。脱支酶如支链淀粉酶(pullulanase)和异淀粉酶 (isoamylase)水解这些寡聚物中的支链α _1_6糖苷键，从而释放葡萄糖或麦芽糖和直链 寡聚物，其受到内源酶(源自麦芽)和/或外源酶，例如，α-淀粉酶，β-淀粉酶和葡糖淀 粉酶的作用。本发明提供适于产生不可发酵糖含量低的麦芽汁的新方法。该方法使用特定选择 的支链淀粉酶活性。定义在本公开的内容中，使用了本领域普通技术人员通常理解的多个术语。但是，几个 术语使用了特定的含义，含义如下所限定。如本文所使用的，将术语“谷物(grist) ”理解为含有淀粉或糖的材料，其是啤酒生 产的基础，例如，大麦麦芽和辅料。通常，谷物不包含任何添加的水。将术语“麦芽”理解为任何发芽的谷类谷粒(malted cereal grain)，特别是大麦。将术语“辅料”理解为谷物中不是大麦麦芽的部分。辅料可包括任何富含淀粉的植 物材料，如，未发芽的谷物，如大麦、稻、玉米、小麦、黑麦、高粱和易于发酵的糖和/或糖浆。将术语“醪(mash) ”理解为包含淀粉的浆料，该浆料包含浸于水中的谷物。将术语“麦芽汁”理解为糖化过程中提取谷物后的未发酵的液体流出物(liquor run-off)ο将术语“酒糟”理解为提取谷物和分离麦芽汁后残余的浙干的(drained)固体。将术语“啤酒”在本文中理解为发酵后的麦芽汁，S卩，从大麦麦芽，任选的辅料和啤 酒花酿造的含酒精饮料(alcoholic beverage)。术语“同源序列”用于表征如下序列，其具有与已知序列至少70%，优选至少 75%，或者至少80%，或者至少85%，或90%，或至少95%，至少96%，至少97%，至少 98%，至少99%或者甚至至少100%相同的氨基酸序列。用于同源性确定的氨基酸序列的 相关部分是成熟多肽，即，不含信号肽。术语“同源序列”也用于表征在低严紧性，中严紧性， 中/高严紧性，高严紧性，或甚至非常高严紧性与已知序列杂交的DNA序列。用于确定在低、 中或高严紧性核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间杂交的合适的实验条件包括将包含 DNA片段或RNA的滤膜预浸以在5x SSC (氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等，1989)中杂交10 分钟，并在 5x SSC，5x Denhardt 溶液(Sambrook 等，1989)，0. 5% SDS 和 100 微克/ml 变性
4超声处理鲑精DNA的溶液中将滤膜预杂交(Sambrook等，1989)，然后在包含浓度为IOng/ ml 的随机引发的(Feinberg 和 Vogelstein，1983，Anal. Biochem. 132 :6_13)、用 32P_dCTP 标记的(比活性> lxl09cpm/微克)探针的相同溶液中在约45°C杂交12小时。然后将滤 膜在2xSSC，0. 5% SDS中，在约55°C (低严紧性)，更优选约60°C (中严紧性)，更优选约 65 0C (中/高严紧性)，甚至更优选约70°C (高严紧性)，和甚至更优选约75°C (非常高严 紧性)洗涤两次共30分钟。使用χ射线片检测在这些条件下与寡核苷酸探针杂交的分子。将本公开中关于多肽或DNA序列所使用并涉及的术语“同一性”理解为两个序列 之间的同一性程度，表示第一个序列与第二个序列之间的差别(derivation)。同一性可以 通过本领域已知的计算机程序适当确定，如GCG程序包中提供的GAP (Program Manual for the Wisconsin Package,Version 8,August 1994,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)(Needleman,S. B.和Wunsch，C.D.，(1970),Journal of MolecularBiology,48,443-453) 0对于多肽序列比较，使用下述设定缺口产生罚分 (GAPcreation penalty)为 3. O 和缺口延伸罚分(GAP extension penalty)为 0.1。本发 明的氨基酸序列和不同的氨基酸序列(“外源序列”)之间的同一性程度如下计算两个序 列比对中完全匹配的数目，除以“发明序列”的长度或“外源序列”的长度中最短者。结果 表示为百分比同一性。麦芽汁生产按照第一方面，本发明提供用于产生啤酒用麦芽汁的方法，包括由谷物形成醪，并 将所述醪与支链淀粉酶(E. C. 3. 2. 1. 41)接触，其中所述支链淀粉酶具有如下氨基酸序列， 所述氨基酸序列a)与SEQ ID NO 4中所示的氨基酸序列至少50%，至少60%，至少70%， 至少75%，至少80%，或至少85%，或90%，或至少95%，至少96%，至少97%，至少98% 或甚至至少99%相同或b)由核酸序列编码，所述核酸序列在低严紧性，中严紧性，中/高严 紧性，高严紧性，或甚至非常高严紧性条件下与下述杂交i)编码SEQ ID NO :4中所示氨基 酸序列的核酸序列的互补链，或ii) (i)的至少100个核苷酸，至少200个核苷酸，至少300 个核苷酸，至少500个核苷酸，至少1000个核苷酸，或甚至至少1500个核苷酸的亚序列。在 一个优选实施方案中，支链淀粉酶具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID N0:3的氨基 酸序列相差不多于100个氨基酸，优选不多于80个氨基酸，更优选不多于50个氨基酸，更 优选不多于30个氨基酸，甚至更优选不多于20个氨基酸，和最优选不多于10个氨基酸。第一方面的谷物包括包含淀粉的发芽谷物和/或辅料。谷物可以优选包 括0% -100%，优选20% -100%，优选30% -100%，更优选40% -100%，甚至更优选 50 % -100 %，更优选60 % -100 %，如80 % -100 %或甚至最优选90 % -100 %的辅料，未发芽 谷物和/或未发芽大麦。在一个具体实施方案中，辅料由100%未发芽大麦组成。此外，谷 物优选包含0 % -100 %，优选20 % -100 %，优选30 % -100 %，更优选40 % -100 %，甚至更 优选50 % -100 %，更优选60 % -100 %，或最优选70 % -100 %，或甚至最优选90 % -100 % 发芽谷物和/或未发芽大麦。在一个具体实施方案中，谷物包含约50 %发芽谷物，例如，发 芽大麦，和约50%辅料，例如未发芽谷物，如未发芽大麦。第一方面的方法中使用的发芽谷物包括任何发芽的谷物，并且优选为选自发芽的 大麦、小麦、黑麦、高粱、黍、玉米和稻的发芽谷物，并且最优选发芽大麦。第一方面的方法中使用的辅料可以获得自块茎、根、茎、叶、豆类、谷类和/或完整的谷粒。辅料可以包含生和/或精制淀粉和/或含糖材料，其源自植物，如小麦、黑麦、燕麦、 玉米、稻、买罗高粱(milo)、黍、高粱、马铃薯、甘薯、木薯(cassava)、木薯淀粉(tapioca)、 西米(sago)、香蕉、糖甜菜和/或甘蔗。优选地，辅料包含未发芽谷物，例如，选自下列的未 发芽谷物大麦、小麦、黑麦、高粱、黍、玉米和稻，并且最优选未发芽大麦。在本发明的糖化 方法之前、过程中或之后，可以向大麦麦芽醪中加入包含可易于发酵的碳水化合物如糖或 糖浆的辅料，但是优选在糖化方法之后加入。根据本发明，支链淀粉酶(E. C. 3. 2. 1. 41)酶活性由外源提供并存在于醪中。可以 在形成醪之前、过程中或之后向醪成分例如水和/或谷物中加入支链淀粉酶。在特别优选 的实施方案中，α “淀粉酶(Ε. C. 3. 2. 1. 1)和/或葡糖淀粉酶(Ε. C. 3. 2. 1. 3)与支链淀粉 酶一起加入，并存在于醪中。在另一个优选的实施方案中，向醪中加入其它酶，所述酶选自下组异淀粉酶、蛋 白酶、漆酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、非汀(Phytin)和酯酶。在糖化方法中，从谷物提取的淀粉逐渐水解成可发酵的糖和较小的糊精。优选地， 在提取麦芽汁之前，醪对碘测试是淀粉阴性。糖化方法的温度通常在控制下逐步增加，其中每步中一种酶的作用胜过其它酶， 最终降解蛋白质、细胞壁和淀粉。糖化温度曲线通常在本领域中已知。在本发明中，糖化 方法中的糖化(淀粉降解)步骤优选在60°C -66°c，更优选在61°C -65°c，甚至更优选在 620C _64°C，和最优选在63°C _64°C进行。在本发明的一个具体实施方案中，糖化温度是 64 "C。从醪获得麦芽汁通常包括滤去(strain)酒糟中的麦芽汁，所述酒糟即形成谷物 的部分的不溶性谷粒和谷壳材料。可将热水通过酒糟以从谷物中冲洗或淋洗(sparge)出 任何残余的提取物。在本发明的方法中应用热稳定纤维素酶导致葡聚糖水平有效下降 以促进麦芽汁过滤，从而确保循环时间减少和高的提取回收率。优选地，提取回收率为至少 80 %，优选至少81%，更优选至少82 %，甚至更优选至少83 %，如至少84 %，至少85 %，至少 86 %，至少87 %，至少88 %，至少89 %，至少90 %，和最优选至少91%。在从第一方面的任何上述实施方案的谷物酒糟分离麦芽汁后，可以按原样使用麦 芽汁或将其脱水以提供浓缩和/或干燥的麦芽汁。浓缩和/或干燥的麦芽汁可以用作酿酒 提取物，麦芽提取物调味剂(flavoring)，用于不含酒精的麦芽饮料、麦芽醋、早餐谷物，用 于糖果等。在一个优选实施方案中，发酵麦芽汁以产生酒精饮料，优选啤酒，例如，爱儿啤酒 (ale)、烈性爱儿啤酒(strong ale)、苦味酒(bitter)、烈性黑啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒 (porter)、陈贮啤酒(lager)、出口 型啤酒(export beer)、麦芽酒(maltliquor)、大麦酒、 低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、 低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。麦芽汁的发酵可包括向麦芽 汁中投入(Pitch with)酵母浆料，该浆料包含新鲜酵母(即先前未用于本发明的酵母)或 者所述酵母可以是回收的酵母。应用的酵母可以是适于啤酒酿造的任何酵母，特别是选自 酵母属菌种(Saccharomyces spp.)的酵母，如酿酒酵母和葡萄汁酵母(S. uvarum)，其包括 这些生物体的天然或人工产生的变体。用于产生啤酒的麦芽汁的发酵方法为本领域的技术 人员所熟知的。
本发明的方法可包括向发酵麦芽汁中加入二氧化硅水凝胶(silicahydrogel)，以 增加啤酒的胶质稳定性(colloidal stability)。这些方法还可以包括向发酵的麦芽汁中 加入硅藻土(kieselguhr)并过滤以使啤酒鲜亮(bright)。根据本发明的一个方面，提供由第二或第三方面的麦芽汁产生的啤酒，如通过将 麦芽汁发酵产生啤酒而产生的啤酒。啤酒可以是任何类型啤酒，例如，爱儿啤酒、烈性爱儿 啤酒、烈性黑啤酒、钵尔透黑啤酒、陈贮啤酒、苦味酒、出口型啤酒、麦芽酒、低麦芽啤酒、高 醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。酶待应用于本发明中的外源酶应该根据它们在本发明方法中的处理温度以及它们 在醪中的PH条件下保持充分活性的能力来进行选择，并应以有效量加入。酶可以源自任何 来源，优选来自植物或藻类，更优选来自微生物，如来自细菌或真菌。支链淀粉酶(E.C. 3. 2. 1. 41)在本发明的方法和/或组合物中使用的优选的支链淀粉酶是具有如下氨基酸序 列的直链淀粉酶，所述氨基酸序列与SEQ ID NO :4中所示的序列至少50%，如至少55%， 如至少60%，如至少65%，如至少66%，如至少70%，如至少75%，如至少80%，如至少 85%，如至少86%，如至少87%，如至少88%，如至少89%，如至少90%，如至少95%， 如至少98%或者甚至100%相同；特别是当使用下述设置用Needle程序比对时矩阵为 BL0SUM62，缺口起始罚分10. 0，缺口延伸罚分0. 5，无缺口同一性矩阵。最优选地，支链淀粉酶源自嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillusacidopullulyticus)。 支链淀粉酶可具有由 Kelly 等，1994(FEMS Microbiol. Letters 115 97-106) (SEQ ID NO 6)公开的氨基酸序列或同源序列。异淀粉酶(E.C. 3. 2. L 68)本发明的方法和/或组合物中使用的另一种酶可以是可替换的脱支酶，如异淀粉 酶(E. C. 3. 2. 1. 68)。异淀粉酶水解支链淀粉(amylopectin)和β -极限糊精中的α -1， 6-D-糖苷分支键，并且能通过异淀粉酶不能攻击支链淀粉和通过对α -限糊精的有限作用 而区别于支链淀粉酶。异淀粉酶可以本领域的技术人员公知的有效量加入。异淀粉酶可以 单独加入或与支链淀粉酶一起加入。α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)本发明的方法和/或组合物中使用的特定α-淀粉酶可以是芽孢杆菌 属(Bacillus) α-淀粉酶。公知的芽孢杆菌属α -淀粉酶包括源自地衣芽孢杆菌 (B. Iicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和嗜热脂肪芽孢 杆菌(B. stearothermophiIus)的菌株的α -淀粉酶。在本发明的上下文中，期望的芽孢 杆菌属α-淀粉酶是WO 99/19467第3页第18行至第6页第27行中所定义的α-淀 粉酶。优选的α-淀粉酶具有氨基酸序列，其与WO 99/19467中SEQ IDN0:4(本文公开 为SEQ ID NO 7)具有至少90%同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%， 至少98%，或者特别是至少99%。最优选的产麦芽糖α-淀粉酶是SEQ ID NO :9或包括 WO 99/43794中公开的其变体。期望的变体和杂合体在WO 96/23874、WO 97/41213和WO 99/19467中描述。特别期望的是来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶(Ε. C. 3. 2. 1. 1)，其 具有W099/19467中SEQ ID NO :3所公开的氨基酸序列(本文公开为SEQ ID Ν0:10)，其具
7有突变I181*+G182*+N193F。芽孢杆菌属α -淀粉酶可以以1. 0-1000NU/kg DS,优选2. 0_500NU/kg DS,优选 10-200NU/kg DS 的量加入。本发明的方法使用的另一种特定的α-淀粉酶可以是任何真菌α-淀粉 酶。例如，源自曲霉属(Aspergillus)内菌种的α -淀粉酶，并且优选来自黑曲霉 (Aspergillusniger)的菌株。特别期望的是与WO 2002/038787中SEQ ID NO :1所示的氨基 酸序列(本文公开为SEQ ID NO: 11)显示高同一性，即至少50%，至少55%，至少60%，至 少65 %，至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %或者甚至至少90 %同一性的真菌α -淀 粉酶。真菌 α -淀粉酶可以以 l-1000AFAU/kg DS，优选2_500AFAU/kg DS，优选20-100AFAU/ kg DS的量加入。葡糖淀粉酶(E.C. 3. 2. 1. 3)本发明的方法和/或组合物中使用的另一种特定的酶可以是源自微生物或植物 的葡糖淀粉酶(E. C. 3. 2. 1. 3)。优选的是真菌或细菌来源的选自下组中一种或多种的葡 糖淀粉酶曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶(Boel等，1984，EMBO J. 3 (5) :1097-1102)，或它们的变体，如W092/00381和WO 00/04136中所公开的；泡盛曲 霉(A. awamori)葡糖淀粉酶(W084/02921)、米曲霉(A. oryzae) (Agric. Biol. Chem.，1991， 55(4) :941-949)，或其变体或片段。其它期望的葡糖淀粉酶包括踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自 埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii) (W0 99/28448)、Talaromycesleycettanus (美 国专利号Re. 32，153)、杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)和嗜热踝节菌(Talaromyces 让吐!11叩1^1118)(美国专利号4，587，215)的葡糖淀粉酶。优选的葡糖淀粉酶包括源自米曲 霉的葡糖淀粉酶，如与W000/04136中的SEQ IDNO 2中所示的氨基酸序列具有至少90%， 至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特别是至少99%或者甚至至少 90%同一性的葡糖淀粉酶。其它优选的葡糖淀粉酶包括源自埃默森踝节菌的葡糖淀粉酶， 如与埃默森踝节菌的氨基酸序列(W0 99/28448)具有至少90%，至少92%，至少95%，至少 96 %，至少97 %，至少98 %，或特别是至少99 %，或者甚至至少90 %同一性的葡糖淀粉酶。期望的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)的葡糖淀粉酶， 特别是热解淀粉梭菌(C. thermoamylolyticum) (EP 135，138)和热硫化氢梭菌 (C. thermohydrosulfuricum)(TO 86/01831)。还期望的是商业产品AMG 200L ；AMG 300L ； SAN SUPER 禾Π AMGtmE (来自 Novozymes) ；0PTIDEX 300 (来自 Genencor Int.) ；AMIGASE 禾Π AMIGASE PLUS (来自 DSM) ；G-ZYME G900(来自 EnzymeBio-Systems) ；G-ZYME G990ZR (黑曲霉葡糖淀粉酶和低 蛋白酶含量)。可以以本领域技术人员所熟知的有效量加入葡糖淀粉酶。蛋白酶合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋 白酶，即，通过在低于PH 7的酸性条件下水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。蛋白酶负责在醪中将全长的高分子量蛋白降解成低分子量蛋白。低分子量蛋白对 于酵母的营养是必需的，而高分子量蛋白保证泡沫稳定性。因此技术人员熟知蛋白酶应该 以平衡量加入，同时为酵母提供缓慢(amble)游离氨基酸并且保留足够的高分子量蛋白以使泡沫稳定化。可以以0. l-1000AU/kg DS，优选l-100AU/kg DS并且最优选5_25AU/kg DS 的量加入蛋白酶。纤维素酶(E.C. 3. 2. 1. 4)纤维素酶可以是微生物来源的，如源自丝状真菌(例如，曲霉属、木霉属 (Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium))的菌株。纤维素酶的具体实 例包括从特异腐质霉(H. insolens)可获得的内切葡聚糖酶(内切葡聚糖酶I)，其还由WO 91/17244中

图14的氨基酸序列定义，和WO 91/17243中所述43kD特异腐质霉内切葡聚糖酶。本发明的方法中使用的特定纤维素酶可以是内切葡聚糖酶，如内切-1，4_β-葡 聚糖酶。特别期望的是WO 2003/062409中SEQ ID NO :2中所示的β -葡聚糖酶(本 文公开为SEQ ID Ν0:14)和同源序列。可以使用的商业上可获得的纤维素酶制剂包括
CELLUCLAST 、CELLUZYME 、CEREFLO 和 ULTRAFLO (可从
Novozymes A/S 获得)，LAMINEX 和SPEZYME CP (可从 Genencor Int.获得)和 ROHAMENT 7069K 可从R6hm，Germany 获得)。可以以1. 0-10000BGU/kg DS,优选 10_5000BGU/kg DS,优选 50-1000B⑶/kg DS 和 最优选100-500B⑶/kg DS的量加入β -葡聚糖酶。材料与方法酶支链淀粉酶1，其源自嗜酸普鲁兰芽孢杆菌，并具有SEQ ID NO :1中所示序列。支 链淀粉酶1可由Novozymes作为Promozyme 400L获得。支链淀粉酶2，其源自Bacillus deramificans (美国专利No. 5，736，375)，并具有 SEQ ID NO 2中所示序列。支链淀粉酶2可由Novozymes作为Promozyme D2获得。支链淀粉酶3，其源自嗜酸普鲁兰芽孢杆菌，并具有SEQ ID NO :4中所示序列。酸性真菌α-淀粉酶，其源自黑曲霉，并具有SEQ ID NO=Il中所示序列。葡糖淀粉酶G1，其源自黑曲霉(boel等，见上文)。方法α -淀粉酶活性(NU)使用马铃薯淀粉作为底物可以确定α-淀粉酶活性。这种方法基于改性的 (modified)马铃薯淀粉通过酶的分解，并通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合来跟踪 此反应。起初，形成蓝黑色(blackish blue color)，但是在淀粉分解过程中，蓝色越来越 浅，并逐渐变成红褐色(reddish-brown)，将其与有色玻璃标准相比较。一千Novo α -淀粉酶单位(KNU)等于1000NU。一个KNU定义为在标准条件下(即， 370C +/-O. 05 ；0. 0003Μ Ca2+ ；禾PpH 5. 6)降解5. 26g淀粉干物质(Merck Amylum solubile) 的酶量。酸性α -淀粉酶活性(AFAU)酸性α -淀粉酶活性可以以AFAU (酸性真菌α -淀粉酶单位)测定，其相对于酶 标准物确定。IFAU定义为在下述标准条件下每小时降解5. 260mg淀粉干物质的酶量。酸性α-淀粉酶是内切-α-淀粉酶(l，4-a-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶， Ε. C. 3. 2. 1. 1)，催化淀粉分子内部区域中的α -1，4-糖苷键，形成不同链长的糊精和寡糖。碘与淀粉形成的蓝色的强度与淀粉浓度成正比。使用反向比色法，测定在特定分析条件下 淀粉浓度的减少作为淀粉酶活性。
α-淀粉酶标准条件/反应条件底物可溶淀粉，大约0. 17g/L缓冲液柠檬酸盐(citate)，大约0. 03M碘(I2)0. 03g/LCaCl2 1. 85mMpH: 2.50 士 0· 05温育温度40°C反应时间23秒波长590nm酶浓度0·025AFAU/mL酶的作用范围0.01-0. 04AFAU/mL葡糖淀粉酶活性(AGU)Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37°C和pH 4. 3每分钟水解1微摩尔麦芽糖 的酶量。使用来自Boehringer Mannheim，124036 的 Glucose GOD-Perid 试剂盒，通过根 据(AEL-SM-0131，可应要求从Novozymes获得)修正的方法以AGU/ml确定活性。标准品 AMG-标准品，批号7-1195，195AGU/ml。将375 μ L底物(50mM乙酸钠，pH 4. 3中的麦芽 糖)在37°C温育5分钟。加入稀释于乙酸钠中的25 μ L酶。10分钟后，通过加入IOOyL 0. 25Μ NaOH而停止反应。将20 μ L转移至96孔微量滴定板并加入200 μ LGOD-Perid溶液 (124036，Boehringer Mannheim)。30分钟后，在室温测定650nm处的吸光度，并由AMG-标 准品，AGU/ml计算活性。分析方法(AEL-SM-0131)的详细描述可以应要求从Novozymes获 得。支链淀粉酶活性(PUN)一个支链淀粉酶单位(PUN)定义为在pH 5的柠檬酸盐缓冲液中，在50°C能从支链 淀粉底物每分钟形成1微摩尔葡萄糖的酶量。支链淀粉酶样品和底物(红色支链淀粉)一起温育。内切支链淀粉酶水解红色支 链淀粉中的α-1，6-糖苷键，释放红色底物降解产物。使用乙醇将未降解的底物沉淀。在 510nm用分光光度法测定释放颜色的量，其与样品中的内切-支链淀粉酶活性成比例。将样 品的颜色形成与支链淀粉酶活性已知的样品产生的颜色形成相比较。支链淀粉酶是支链淀粉6-葡聚糖-水解酶，酶分类号为E. C. 3. 2. 1. 41。反应条件温度50°C 士2°CpH5.0淀粉+碘λ = 590nm蓝/ 紫
—糊精+寡糖
40°C, pH 2. 5 t = 23秒脱色
底物浓度酶浓度反应时间波长
0. 67%红色支链淀粉 0.04-0. 13PUN/mL 30分钟试剂/底物氯化钾溶液0. 5M红色支链淀粉底物2%。供应商为Megazyme，Australia柠檬酸盐缓冲液0. 05M pH 5. 0包括25mM半胱氨酸的柠檬酸盐缓冲液0. 05M pH 5. 0乙醇 99. 8%将904PUN/g的支链淀粉酶标准品制备物在柠檬酸盐缓冲液0.05M中稀释成 0. 05-0. 20PUN/ml的标准品稀释液系列。空白柠檬酸盐缓冲液0.05M将酶样品在柠檬酸盐缓冲液0. 05M中稀释至活性为0. 06-0. 20PUN/ml，并与标准 品稀释液系列比较。实施例1在这个实施例中，分析不同的支链淀粉酶以降低麦芽汁中不可发酵糖(糊精/ DP4/4+)的量的能力。使用如下糖化温度曲线将100%充分修饰的麦芽糖化，所述糖化温度曲线包括 460C 26分钟，然后以1°C /分钟增加至64°C，之后使温度保持恒定。在98、128和158分钟 收集样品。在0分钟加入酶。分别以1000AGU/kg DS和250AFAU/kg DS向所有处理中加入葡 糖淀粉酶和α-淀粉酶。根据表1加入支链淀粉酶。将样品煮沸10分钟并过滤(孔径0. 20微米)。通过HPLC分析样品，并计算不可 发酵糖(DP4/4+)的百分比。
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使用表1中的数据，通过回归，计算与支链淀粉酶3的2. 74mg酶蛋白/kg相同效 果所需的支链淀粉酶1和支链淀粉酶2的酶剂量(见表2)。 由这些结果可以看出，支链淀粉酶3是最有效的酶。因此，减少不可发酵糖(糊精 /DP4/4+)的量需要的支链淀粉酶3酶蛋白更少，由此增加了麦芽汁的发酵(attenuation)。实施例2在本实施例中分析不同支链淀粉酶的pH曲线和温度曲线。用下述条件根据相对酶活分析而进行PH和温度曲线的研究。分析方法原理通过支链淀粉酶水解支链淀粉中的α -1，6-糖苷键，并且由修改的 Somogyi-Nelson方法检测增加的还原糖量。在本实验中，以相对活性评价活性，其中活性最强的样品指定为100%。检测条件 如下缓冲液柠檬酸盐0. 1M+0. 2M磷酸盐(在pH曲线中调节，在温度曲线中为pH 5)底物0.2%支链淀粉 Sigma (p-4516)温度在pH曲线中为60°C，在温度曲线中调节反应时间30分钟
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根据Nelson，1944，J. Biol. Chem. 153 :375_380 和 Somogyi，1945，J. Biol. Chem. 160 :61_68中描述的原理检测由支链淀粉酶释放的还原糖。简言之，通过以对应于样 品体积的体积(例如，2ml的样品加2ml)加入Somogyi氏铜(cobber)试剂而终止水解反 应。将样品煮沸20分钟，并在颜色反应前冷却。通过加入对应于样品1/2体积的Nelson 试剂(例如，样品+Somogyi铜试剂共4ml时加入2ml)而进行反应。样品混合2分钟，然后 加入与Nelson试剂等量的水。在暗处温育样品30分钟，并在分光光度计中在540nm测量。可以如下制备试剂Somogyi 铜试剂在1000ml H2O 中溶解 70. 2g Na2HP04x2H20 和 80. Og KNAC4H406x4H20 (kaliumsodium tartrat (酒石酸钾钠))(稍稍加热)。再加入 60g NaOH ； 16. 0gCuS04x5H20 和 360. Og Na2SO4 并加水至2000ml。用NaOH调pH至10. 8Nelson 试齐[J:在1200ml H2O 中溶解 100. Og (NH4) 6Mo7024x7H20。小心加入 84. 0mlH2S04。此外，在 IOOml H2O中溶解12. OOg Na2HAS04x7H20(砷酸氢二钠)，并将此溶液缓慢加入第一种溶液中 并加水至2000ml。下面的表3和4中给出了三种支链淀粉酶的pH和温度曲线。
这些结果表明，与其它两种支链淀粉酶比较，支链淀粉酶3在高温时具有宽的PH 曲线和活性。这些性质使支链淀粉酶3成为酿酒(糖化条件)中非常稳健的酶，特别是对 于糖化温度为62°C -65°C时。实施例3用支链淀粉酶1和3 (SEQ ID NO 1和4)进行浸出糖化(infusion mashing)测 试。以100%大麦为底物(谷物)制备6个糖化样品。将大麦(DS%:86. 73)磨碎，并且对于每个样品，将50. Og样品(总DS 43. 34g)与 50 °C的200g自来水和3. OmllM H3PO4混合。 所有样品均加入无支链淀粉酶的相同的酶混合物。然后根据下表向样品1-6加入支链淀粉酶酶剂量活性/g 然后在运行下述程序的自动化糖化设备中测试样品。
糖化后，所有样品均加入自来水至总共300g并过滤。然后将过滤的样品煮沸10分钟并用去离子水1 1稀释。将50ml子样品离心并进行标准密度分析，计算RDF% (发
酵的真实水平)。结果作为RDF%和以％表示的麦芽汁糖(DP2和DP4+)给出。
结果表明，对于获得高％1^^，支链淀粉酶3明显优于支链淀粉酶1，并且支链淀粉 酶3能够产生甚至优于支链淀粉酶1的麦芽糖水平(DP2水平)。实施例4用支链淀粉酶3(SEQ ID NO 4)进行浸出糖化测试，以评价支链淀粉酶3的麦芽糖 产生性质。以100%大麦为底物(谷物)制备6个糖化样品。将大麦(DS%:86. 73)磨碎，并且对于每个样品，将50. Og样品(总DS 43. 34g)与 50°C的200g自来水和5% Na2SO3和IM H3PO4混合。所有样品均加入无支链淀粉酶的相同的酶混合物。然后根据下表向样品1-6加入支链淀粉酶3 然后运行下述程序在自动化糖化设备中测试样品。 糖化后，向所有样品中加入自来水至总量为300g并过滤。然后将已过滤的样品煮 沸10分钟，并用去离子水1 1稀释。将50ml子样品离心并进行分析。结果如下 结果表明麦芽糖浓度随着支链淀粉酶3的剂量增加而增加，并且麦芽糖％的增加 之后发酵(RDF% )增加。糊精部分(HPLC分析DP4/4+)在同时降低。只有大麦淀粉酶能在这个反应中产生麦芽糖，并且支链淀粉酶3可以促进大 麦的淀粉酶的作用。
葡萄糖浓度低，且不受支链淀粉酶3作用的影响，这是发酵产生的麦芽汁时的一 个优势。通过大麦淀粉酶，并且通过麦芽汁的发酵(RDF%)增加，支链淀粉酶3帮助降 解糊精，并促进麦芽糖的形成。
权利要求
用于产生啤酒用麦芽汁(Brewer’s wort)的方法，其中包括从谷物形成醪，和将所述醪与支链淀粉酶接触，其中所述支链淀粉酶具有下述氨基酸序列a)与SEQ ID NO4中所示氨基酸序列至少86％相同；或b)由核酸序列编码，所述核酸序列在低严紧条件下与下述杂交i)编码SEQ ID NO4中所示氨基酸序列的核酸序列的互补链；或ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列。
2.根据权利要求1的方法，其中所述支链淀粉酶源自嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)。
3.根据权利要求1或2的方法，其进一步包括将所述醪与葡糖淀粉酶和/或α_淀粉 酶接触。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶源自黑曲霉 (Aspergillus niger)或埃默森躁节菌(Talaromyces emersonii)。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括将所述醪与选自下组的酶接触 纤维素酶、异淀粉酶、木聚糖酶和蛋白酶。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述谷物包括发芽和/或未发芽的谷粒。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中未发芽的谷粒和/或发芽的谷粒选自下 列大麦、小麦、黑麦、高粱、黍、玉米和稻。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中发芽的谷粒包括选自发芽的大麦、小麦、黑 麦、高粱、黍、玉米和稻的发芽谷粒。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述麦芽汁是浓缩的和/或干燥的。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其还包括发酵麦芽汁以获得酒精饮料。
11.根据权利要求10的方法，其中所述酒精饮料是啤酒。
12.根据权利要求11的方法，其中所述啤酒是爱儿啤酒、烈性爱儿啤酒、苦味酒、烈性 黑啤酒、钵尔透黑啤酒、陈贮啤酒、出口型啤酒、麦芽酒、大麦酒、低麦芽啤酒、高醇啤酒、低 醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。
13.由根据前述权利要求中任一项的方法产生的麦芽汁。
14.根据前述权利要求中任一项的浓缩的和/或干燥的麦芽汁。
15.由根据前述权利要求中任一项的麦芽汁产生的啤酒。
16.适用于根据前述权利要求中任一项的方法中的组合物，所述组合物包括支链淀粉 酶、葡糖淀粉酶和任选的α -淀粉酶，其中所述支链淀粉酶具有如下的氨基酸序列，所述氨 基酸序列a)与SEQID NO 4中所示氨基酸序列至少50%相同；或b)由在低严紧条件下与下述杂交的核酸序列编码i)编码SEQID NO 4中所示氨基酸序列的核酸序列的互补链或ii)(i)的至少100个核苷酸的亚序列。
17.根据权利要求16的组合物，其中葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶源自黑曲霉或埃默 森踝节菌。
全文摘要
本发明提供用于产生啤酒用麦芽汁的方法，其中包括从谷物形成醪，和将所述醪与支链淀粉酶接触。
文档编号C12N9/44GK101918525SQ200780101920
公开日2010年12月15日 申请日期2007年12月12日 优先权日2007年12月12日
发明者尼尔斯·埃尔维格, 珀·L·乔尔根森, 迈克尔·托马斯 申请人:诺维信公司;诺维信股份有限公司