专利名称：金耳与粗毛韧革菌的its区序列及用其鉴定金耳的方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌品种的DNA序列及利用该序列鉴定其品种的方法，更具体地说， 本发明涉及真菌金耳的ITS区序列及利用该序列鉴定其品种的方法，属于分子生物学方法鉴定 真菌品种和检测真菌纯度技术领域。
背景技术：
金耳7>"eme//flflwm"ft'fl/6aBandoni et Zang是银耳属的一种珍贵食药用真菌，营养成分丰 富，可提供多种氨基酸、多种维生素和人体必需的矿质元素，是一种良好的生物营养资源。 金耳药用历史悠久，在《名医别录》和《本草纲目》中对其形态、药用部位及性味功能有详 细描述。《中国药用真菌》(参考文献刘波.中国药用真菌.太原:山西人民出版社.1984,37-42)述其主 治肺热、痰多、感冒咳嗽、气喘、高血压等症。现代药理研究表明金耳富含水溶性多糖，连 续服用金耳子实体能化痰止咳并对四氧嘧啶所致糖尿病大鼠高血糖模型具有显著的降糖作 用，金耳子实体多糖也能明显降低正常小鼠及链脲霉素致高血糖小鼠血糖和血浆胆固醇水平， 金耳子实体也有较强的平喘作用。
金耳的野生资源稀有，但商品需求量较大。市售的金耳来源复杂，涉及金黄银耳7Ve/ne/Za awn2"rifli Schw. ex Fr.、脑状银耳7>e/we//a g"ce/ /w/a、黄金银耳或橙黄银耳7>"e7ne//a wewWencfl Retz ex Fr.或rrewe//a /wfesce/w Fr.等颜色和外形近似的种，甚至有人工染色后的 银耳直接冒充金耳，直接影响到金耳的临床疗效和消费者的利益。现行的金耳鉴定方法包括 性状鉴定和微观解剖，但这些方法仍未对金耳品种作出全面客观的鉴定。
真菌核糖体DNA区段含有多个串联重复序列，每个重复序列包含18S、 5.8S、 28SrRNA 基因及其间隔区域。其中内部间隔区ITS区(含5.8S)将18S和28SrRNA基因分隔开。不同种 的ITS区序列是不相同的，如果能对金耳的子实体的ITS区序列进行测序，获得其完整的ITS 区序列，就可通过对比其ITS区序列来鉴定金耳品种。
发明内容
本发明的目的是解决现有金耳鉴定技术存在的不足与问题，提供一种基于核基因组ITS 区序列分析的金耳真菌品种的分子鉴定方法，用特定的DNA序列进行金耳真菌鉴定，保证了 金耳品种及金耳和粗毛韧革菌菌种的鉴定更可靠、正确。
为达到本发明的目的，本发明人从金耳主产区采集了数个金耳样品，所有金耳样品均经 过真菌分类专家鉴定。所测的金耳样品和组成金耳子实体的寄主真菌粗毛韧革菌(Stereww / >^/"加(Willd.)Fr.)的ITS区序列见序列表，以测得的序列作为金耳的ITS区序列，金耳的
ITS区序列长度为467bp，如SEQ ID NO.l所示；寄主真菌粗毛韧革菌的ITS区序列长度为 548bp，如SEQ ID N0.2所示。金耳ITS区G+C含量为45%，寄主真菌粗毛韧革菌ITS区G+C 含量为48%。
上述金耳样品的ITS区序列的测定方法包括下列步骤首先建立了一套金耳高质量DNA 的制备方法，然后对它的ITS区序列进行测序，建立了ITS区序列，每个样品至少重复测序 5次，每个样品的序列也在互联网上的GenBank中与其他银耳属的品种作比较和验证，以保 证本发明的序列准确性，再在此基础上对待鉴定真菌的ITS区序列测序后通过比对序列差异 进行品种鉴定。
本发明中利用ITS区序列鉴定金耳品种所采用的步骤如下
(1) 取待鉴定真菌子实体或菌种，消毒处理后，研磨成粉末，用DNA提取试剂盒或氯化节试 剂提取方法提取总DNA;
(2) 以提取得到的DNA样品为模板，用针对金耳ITS区的专用引物进行聚合酶链式反应扩增 得到待鉴定真菌的ITS片段产物，扩增的正向引物P1为5'-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，， 位于18S上；反向引物P2为5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',位于28S上，在50PL的 体系中完成扩增反应，以双蒸水代替模板DNA作空白对照；
(3) 将扩增反应得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化；
(4) 将纯化后的ITS区产物直接进行测序，得到待鉴定真菌样品的ITS区序列，其中测序引物 为聚合酶链式反应所用引物；
(5) 将步骤(4)得到的序列与SEQIDNO.l和SEQ ID N0.2序列分别进行比较，其中 步骤(4)得到的ITS区序列与SEQIDNO.l和SEQ ID N0.2序列都吻合则判断为金耳品种。
本发明中还利用ITS区序列鉴定金耳菌种或粗毛韧革菌菌种所采用的步骤如下
(1) 从待鉴定真菌样品中提取基因组DNA;
(2) 以步骤(1)提取得到的DNA样品为模板，用针对金耳ITS区的专用引物进行聚合酶链式 反应扩增得到待鉴定真菌的ITS片段产物，扩增的正向引物P1为 5，-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，，位于18S上；
反向引物P2为5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，，位于28S上，在50^L的体系中完成扩 增反应，以双蒸水代替模板DNA作空白对照；
(3) 将步骤(2)扩增反应得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化；
(4) 将步骤(3)纯化后的ITS区产物直接进行测序，得到待鉴定真菌样品的ITS区序列；
(5) 将步骤(4)得到的序列与SEQIDNO.l和SEQ ID N0.2序列分别进行比较，其中 若步骤(4)得到的ITS区序列仅与SEQIDNO.l序列吻合则判断为金耳菌种； 若步骤(4)得到的ITS区序列仅与SEQIDN0.2序列吻合则判断为粗毛韧革菌菌种。
上述鉴定方法中，待鉴定品种的基因组DNA提取采用氯化节提取纯化的方法，其步骤为 取菌体材料加入无菌研钵中，同时加入用pH9.0的0.15 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液7mL与 pH为8.0的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液8mL混合后定容至lOOmL配制而成的提取缓冲液， 迅速彻底研磨混匀，取研磨后的液体加入无菌离心管中，再依次加入质量百分浓度为10%的 十二烷基磺酸钠溶液和氯化苄试剂，混匀，50 'C水浴处理，加入等体积的pH为5.2的3mol/L 醋酸钠溶液混匀，冰水浴处理，离心取上清，加入等体积的无水乙醇析出DNA沉淀，离心 弃去无水乙醇，加入70-75%的乙醇洗涤沉淀，离心弃去乙醇，挥干乙醇后用无菌水溶解，琼 脂糖凝胶电泳分析得到基因组DNA样品。
上述方法步骤(2)中所述的针对金耳ITS区的专用引物为寡核苷酸，所述的ITS片段聚 合酶链式反应的反应条件如下聚合酶链式反应的50pL反应液含DNA模板l-5xl0力g,两 个2xl(T5 mol/L引物各lpL， 10xbuffer缓冲液(pH 8.3) 5 ^L，四种0.01 mol/L单核苷酸4pL， 5U/nLDNA聚合酶0.25pL;更进一步说，其所述的ITS片段聚合酶链式反应的反应循环参 数为94'C预变性5分钟，然后按94'C变性1分钟，52-57'C退火45秒钟，72'C延伸1分钟， 循环30次，最后在72t:延伸5分钟，在4。C终止反应。 本发明与现有技术相比还具有以下有益效果
1、 本发明首先建立了一套快速、可靠的金耳高质量基因组DNA的制备方法。
2、 本发明对食药用真菌金耳和寄主真菌粗毛韧革菌的核基因组ITS区序列进行了测序， 获得了ITS区的全部序列，运用它们可以准确地判定待鉴定真菌的真伪，也可以对人工培养 的金耳酵母状孢子菌种和寄主真菌粗毛韧革菌菌种进行准确的鉴定。本发明对于食药用真菌 生产、销售部门快速准确地鉴定金耳子实体和人工培养的菌种，搞好质量控制，是十分必要 的，对于各地质检部门打击假冒伪劣，净化市场具有十分重要的价值。
3、 本发明抓住金耳遗传关系确立和品种纯度检验这两个学术和生产上的关键问题，建立 了有效的技术方法。发明人采集了数个金耳真菌子实体，分析结果显示，金耳子实体中的两 种ITS区序列(含5.8S序列)的长度分别为467bp、 548bp，组成金耳子实体的两种ITS区序 列的长度和G+C含量存在明显差异，为同一子实体中存在的两个不同的物种，与金耳子实体 中有寄主真菌菌丝存在的形态解剖特征吻合。本发明的鉴定方法可以直接测定金耳品种或菌 种的ITS区序列，准确区分和判别金耳品种或菌种的真实性和纯度，为品种鉴定、保护、菌 种质量控制及有效菌种繁育提供可靠技术。
具体实施例方式
以下通过具体实施例说明本发明，但本发明并不仅仅局限于这些实施例。
实施例1利用金耳7>^脂//" awra""fl/6a Bandoni et Zang的ITS区序列鉴定金耳子实体品种
(1) 取外形似金耳的真菌子实体，提取子实体的基因组DNA，具体方法如下 无菌收集消毒待鉴定子实体O.lg置于已灭菌的研钵中，加0.5-1 mL提取缓冲液，此提
取缓冲液为pH9.0的0.15 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液7mL与pH为8.0的0.05 mol/L乙二胺四 乙酸二钠溶液8mL混合后定容至100mL配制而成，研磨混匀；将匀浆后的液体移入无菌离心 管中，加入0.1-0.2 mL质量百分浓度为10%的十二烷基磺酸钠溶液和0.3-0.6 mL氯化苄试齐U， 充分混匀，50 。C保温1-2小时；加入0.3 mL3 mol/LNaOAc (pH 5.2)混匀，冰水浴15-20 min， 6000 r/min室温离心15-20 min;取上清加等体积无水乙醇室温沉淀20-50 min，去上清，10000 r/min室温离心15 min，沉淀用70%乙醇洗一次，风干水溶，4。C保存；1.5%琼脂糖凝胶电 泳(100V电压下电泳30min)检测纯度和分子量范围；提取过程中均以无菌水作空白提取对 照，所有的提取对照在聚合酶链式反应过程中作为阴性对照的模板，以防止提取和扩增过程 中外源DNA的污染。如用DNA提取试剂盒提取DNA，按试剂盒的操作指南进行。
(2) 以提取得到的待鉴定真菌子实体的基因组DNA样品为模板，用针对金耳ITS区的专用引 物分别进行聚合酶链式反应扩增得到待鉴定真菌子实体的ITS片段产物，将产物进行琼脂糖凝 胶电泳，得到了碱基数分别为500bp和700bp的两个条带；聚合酶链式反应具体步骤如下
以待鉴定真菌子实体的基因组DNA分别进行聚合酶链式反应，得到扩增产物；以寡核 苷酸作为聚合酶链式反应的引物，扩增ITS区序列；扩增的正向引物P1为 5'陽CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3'，位于18S上；反向引物P2为
5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，，位于28S上，在50PL的体系中完成扩增反应，以双蒸 水代替模板DNA作空白对照；
聚合酶链式反应采用50pL反应体系DNA模板l-5xl(T9g,两个2xl(T5 mol/L引物各1 pL， 10xbuffer缓冲液(pH8.3) 5 ^L,四种0.01 mol/L单核苷酸4pL， 5U4iLDNA聚合酶 0.25 ^L，无菌双蒸水定容至50 ^L，加好后上盖石蜡油25
聚合酶链式反应的反应条件为94'C预变性5分钟，然后按94'C变性1分钟,52-57'C退 火45秒钟，72°C延伸1分钟，循环30次，最后在72'C延伸5分钟，在4'C终止反应；Agrose 琼脂糖凝胶电泳检査产物(Marker分子量范围100-1200 bp)。
(3) 对每一个条凝胶电泳条带进行割胶回收纯化，每样平行重复3次，另设空白对照组。
(4) 纯化后的ITS区产物经测序反应后直接进行测序，其中所有序列至少经过正反两次重复 测定，每个样品重复三次测序以保证序列的准确性，包括ITS区(含5.8S区)的全序列，其中 测序引物为聚合酶链式反应所用引物，测序正向引物P1为
5'-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，；反向引物P2为5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC國3，。
(5) 将得到的待鉴定的真菌子实体品种的两个ITS区序列分别输入计算机后，用DNAStar软 件包中的Editseq和Seqman进行编辑，用Megalign中Clustal W方法，分别与已经确定的序 列表中的两种ITS区序列进行比较判定，用MEGA软件计算序列的碱基组成和两序列间的转 换/颠换比值，统计和分析序列的差异，用PAUP软件的PTPtest进行序列信息检验。
(6) 经上述步骤(5)的DNA数据分析，各项检测结果如下
a、 其中一个ITS区序列与本发明序列表中金耳的ITS区序列(SEQIDNO.l)的碱基差异为 0;另外一个ITS区序列与寄主真菌粗毛韧革菌的ITS区序列(SEQ IDN0.2)的碱基差异为0;
b、 其中一个ITS区序列与本发明序列表中金耳的ITS区序列的转换/颠换比值相等另外一 个ITS区序列与寄主真菌粗毛韧革菌的ITS区序列的转换/颠换比值相等；
c、 其中一个ITS区序列与本发明序列表中金耳的ITS区序列的相对遗传距离为0°/。；另外一 个ITS区序列与寄主真菌粗毛韧革菌的ITS区序列的相对遗传距离为0%;
d、 在NJ聚类树上，待鉴定真菌的两个序列分别与金耳和寄主真菌粗毛韧革菌聚在各自的分 支上，置信度为100%。
判定待鉴定真菌子实体为金耳7>vwe//a咖ra"rifl/6fl Bandoni et Zang子实体品种。 需要说明的是，步骤(5)除了使用软件进行比较外，通过人工比对也可，须得出同样的结论。
实施例2利用金耳rreme〃ar "wra"r/a/&a Bandoni et Zang的ITS区序列鉴定金耳菌种
CGMCC0179
(1) 提取现有待鉴定孢子菌种CGMCC0179 (中国普通微生物菌种保藏管理中心)的基因组 DNA，具体方法如下
无菌收集人工培养的待鉴定孢子菌种的培养3天的菌体0.1 g置于已灭菌的研钵中，力口 0.5-1 mL提取缓冲液，提取缓冲液为pH9.0的0.15 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液7mL与pH为 8.0的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液8mL混合后定容至lOOmL配制而成，研磨混匀；将勾 浆后的液体移入无菌离心管中，力口入0.1-0.2 mL质量百分浓度为10%的十二垸基磺酸钠溶液 和0.3-0.6 mL氯化节试剂，充分混匀，50 'C保温1-2小时；加入0.3 mL 3 mol/L NaOAc(pH 5.2) 混匀，冰水浴15-20 min， 6000 r/min室温离心15-20 min;取上清加等体积无水乙醇室温沉淀 20-50 min，去上清，10000 r/min室温离心15 min，沉淀用70%乙醇洗一次，风干水溶，4°C 保存；1.5%琼脂糖凝胶电泳(100V电压下电泳30min)检测纯度和分子量范围；提取过程 中均以无菌水作空白提取对照，所有的提取对照在聚合酶链式反应过程中作为空白对照的模 板，以防止提取和扩增过程中外源DNA的污染。如用DNA提取试剂盒提取DNA，按试剂 盒的操作指南进行。
(2) 以提取得到的待鉴定菌种的基因组DNA样品为模板，用针对金耳ITS区的专用引物进行 聚合酶链式反应扩增得到ITS片段产物，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到了一个碱基数约为 500bp的条带；聚合酶链式反应具体步骤如下
以所提取材料的基因组DNA分别进行聚合酶链式反应，得到扩增产物以寡核苷酸作 为聚合酶链式反应的引物，扩增ITS区段，所用的引物分别位于18S和28S的保守区段；
采用双向聚合酶链式反应扩增ITS区的整个片段,扩增的正向引物Pl为
5，-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，，位于18S上；反向引物P2为 5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，，位于28S上；
聚合酶链式反应体系(50nL): DNA模板l-5xl(T9g,两个2xl(T5 mol/L引物各1 ^L， 10xbuffer缓冲液(pH 8.3) 5 ^L，四种0.01 mol/L单核苷酸4pL， 5 U/pLDNA聚合酶0.25 ^L， 无菌双蒸水定容至50nL，加好后上盖石蜡油25pL;
聚合酶链式反应的反应条件94'C预变性5分钟，然后按94'C变性1分钟,52-57'C退火 45秒钟，72'C延伸1分钟，循环30次，最后在72。C延伸5分钟，在4'C终止反应；Agrose琼 脂糖凝胶电泳检査产物(Marker分子量范围100-1200 bp)。
(3) 对得到的凝胶电泳条带进行割胶回收纯化，每样平行重复3次，另设空白对照组。
(4) 纯化后的ITS区产物经测序反应后直接进行测序，其中所有序列至少经过正反两次重复 测定，每个样品重复三次测序以保证序列的准确性，包括ITS区(含5.8S区)的全序列，其中 测序引物为聚合酶链式反应所用引物，测序正向引物P1为
5'-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，；反向引物P2为5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，。
(5) 将得到的待鉴定菌种的ITS区序列输入计算机后，用DNAStar软件包中的Editseq和 Seqman进行编辑，用Megalign中Clustal W方法，与已经确定的序列表中的金耳ITS区序列进 行比较判定，用MEGA软件计算序列的碱基组成和两序列间的转换/颠换比值，统计和分析序 列的差异。用PAUP软件的PTP test进行序列信息检验。
(6) 经上述步骤(5)的DNA数据分析，各项检测结果如下
a、 待鉴定菌种的ITS区序列与本发明的序列表中金耳的ITS区序列的碱基差异为0;
b、 待鉴定菌种的ITS区序列与本发明的序列表中金耳的ITS区序列的转换/颠换比值相等；
c、 待鉴定菌种的ITS区序列与本发明的序列表中金耳的ITS区序列的相对遗传距离为0%; 判定待鉴定真菌菌种CGMCC0179为金耳r^we//a做ra""a/6a Bandoni et Zang菌种。
实施例3
(1)提取现有待鉴定菌种的菌丝体基因组DNA，具体方法如下
无菌收集培养5天的待鉴定菌种的菌丝体0.1 g置于已灭菌的研钵中，加0.5-1 mL提取
缓冲液(提取缓冲液为pH9.0的0.15 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液7mL与pH为8.0的0.05 mol/L
乙二胺四乙酸二钠溶液8mL混合后定容至lOOmL配制而成)研磨混匀。将匀浆后的液体移入无 菌离心管中，力n入0.1-0.2 mL质量百分浓度为10%的十二垸基磺酸钠溶液和0.3-0.6 mL氯化 苄试剂，充分混匀，50。C保温l-2小时。加入0.3mL3mol/LNaOAc (pH5.2)混匀，冰水 浴15-20 min， 6000 r/min室温离心15-20 min。取上清加等体积无水乙醇室温沉淀20-50 min， 去上清，10000 r/min室温离心15min，沉淀用70%乙醇洗一次，风干水溶，4。C保存。1.5% 琼脂糖凝胶电泳(100V电压下电泳30min)检测纯度和分子量范围。提取过程中均以无菌水 作空白提取对照，所有的提取对照在聚合酶链式反应过程中作为阴性对照的模板，以防止提 取和扩增过程中外源DNA的污染。
如用DNA提取试剂盒提取DNA，按试剂盒的操作指南进行。
(2) 以提取得到的待鉴定菌种菌丝体的基因组DNA样品为模板，用针对金耳ITS区的专用引 物进行聚合酶链式反应扩增得到ITS片段产物，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到了一个碱基 数约为700bp的条带。聚合酶链式反应具体步骤如下
以所提取材料的基因组DNA分别进行聚合酶链式反应，得到扩增产物以寡核苷酸作 为聚合酶链式反应的引物，扩增ITS区段，所用的引物分别位于18S和28S的保守区段；
采用双向聚合酶链式反应扩增ITS区的整个片段，扩增的正向引物P1为 5，-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，，位于18S上；反向引物P2为 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，位于28S上；
聚合酶链式反应体系(50pL): DNA模板l-5xl(T9g,两个2xl(T5 mol/L引物各1 pL， 10xbuffer缓冲液(pH 8.3) 5 nL，四种0.01 mol/L单核苷酸化L， 5 U/pLDNA聚合酶0.25 pL， 无菌双蒸水定容至50^L，加好后上盖石蜡油25 ^L;
聚合酶链式反应的反应条件94'C预变性5分钟，然后按94'C变性1分钟,52-57'C退火 45秒钟，72°C延伸1分钟，循环30次；最后在72'C延伸5分钟，在4。C终止反应。Agrose琼 脂糖凝胶电泳检査产物(Marker分子量范围100-1200 bp)。
(3) 对得到的凝胶电泳条带进行割胶回收纯化，每样平行重复3次，另设空白对照组。
(4) 纯化后的ITS区产物经测序反应后直接进行测序，其中所有序列至少经过正反两次重复 测定，每个样品重复三次测序以保证序列的准确性，包括ITS区(包括5.8S区)的全序列，其 中测序引物为聚合酶链式反应所用引物，测序正向引物P1为
5，隱CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，；反向引物P2为5'隱TCCTCCGCTTATTGATATGC國3，。
(5) 将得到的待鉴定菌种的ITS区序列输入计算机后，用DNAStar软件包中的Editseq和
Seqman进行编辑，用Megalign中Clustal W方法，与已经确定的序列表中的金耳ITS区序列进
行比较判定，用MEGA软件计算序列的碱基组成和两序列间的转换/颠换比值，统计和分析序
列的差异，用PAUP软件的PTP test进行序列信息检验。 (6)经上述步骤(5)的DNA数据分析，各项检测结果如下
a、 待鉴定菌种的ITS区序列与本发明的序列表中金耳的寄主真菌粗毛韧革菌的ITS区序列的 碱基差异为0;
b、 待鉴定菌种的ITS区序列与本发明的序列表中金耳的寄主真菌粗毛韧革菌的ITS区序列的 转换/颠换比值相等；
c、 待鉴定菌种的ITS区序列与本发明的序列表中金耳的寄主真菌粗毛韧革菌的ITS区序列的 相对遗传距离为0%:
判定待鉴定真菌菌种为金耳的寄主菌粗毛韧革菌Stere鹏/n'ra^附(Willd.)Fr.菌种。 实施例4
(1) 提取现有待鉴定孢子菌种的菌体基因组DNA，具体方法如下 无菌收集待鉴定孢子菌种的培养3天的菌体0.1 g置于巳灭菌的研钵中，加0.5-1 mL提
取缓冲液，提取缓冲液为pH9.0的0.15 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液7mL与pH为8.0的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液8mL混合后定容至100mL配制而成，研磨混匀；将匀浆后的液体 移入无菌离心管中，加入0.1-0.2 mL质量百分浓度为10%的十二垸基磺酸钠溶液和0.3-0.6 mL 氯化苄试剂，充分混匀，50。C保温l-2小时。加入0.3mL3mol/LNaOAc (pH5.2)混匀， 冰水浴15-20 min， 6000 r/min室温离心15-20 min;取上清加等体积无水乙醇室温沉淀20-50 min，去上清，10000 r/min室温离心15min，沉淀用70%乙醇洗一次，风干水溶，4。C保存； 1.5%琼脂糖凝胶电泳(100V电压下电泳30min)检测纯度和分子量范围；提取过程中均以 无菌水作空白提取对照，所有的提取对照在聚合酶链式反应过程中作为空白对照的模板，以 防止提取和扩增过程中外源DNA的污染。如用DNA提取试剂盒提取DNA，按试剂盒的操 作指南进行。
(2) 以提取得到的待鉴定菌种的基因组DNA样品为模板，用针对金耳ITS区的专用引物进行 聚合酶链式反应扩增得到ITS片段产物，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到了一个碱基数约为 500bp的条带；聚合酶链式反应具体步骤如下
以所提取材料的基因组DNA分别进行聚合酶链式反应，得到扩增产物以寡核苷酸作 为聚合酶链式反应的引物，扩增ITS区段，所用的引物分别位于18S和28S的保守区段；
采用双向聚合酶链式反应扩增ITS区的整个片段，扩增的正向引物P1为 5，-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，，位于18S上；反向引物P2为 5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，，位于28S上；
聚合酶链式反应体系(50pL): DNA模板l-5xl0'、两个2><10'5 mol/L引物各1 pL，
10xbuffer缓冲液(pH 8.3 )5 ^L，四种0.01 mol/L单核苷酸4pL， 5 U/^iLDNA聚合酶0.25 ^L， 无菌双蒸水定容至50 pL，加好后上盖石蜡油25 ^L;
聚合酶链式反应的反应条件94'C预变性5分钟，然后按94'C变性1分钟，52-57'C退火 45秒钟，72'C延伸1分钟，循环30次，最后在72'C延伸5分钟，在4'C终止反应。Agrose琼 脂糖凝胶电泳检查产物(Marker分子量范围100-1200 bp)。
(3) 对得到的凝胶电泳条带进行割胶回收纯化，每样平行重复3次，另设空白对照组。
(4) 纯化后的ITS区产物经测序反应后直接进行测序，其中所有序列至少经过正反两次重复 测定，每个样品重复三次测序以保证序列的准确性，包括ITS区(含5.8S区)的全序列，其中 测序引物为聚合酶链式反应所用引物，测序正向引物P1为
5'隱CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，；反向引物P2为5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，。
(5) 将得到的待鉴定菌种的ITS区序列输入计算机后，用DNAStar软件包中的Editseq和 Seqman进行编辑，用Megalign中Clustal W方法，与已经确定的序列表中的金耳ITS区序列进 行比较判定，用MEGA软件计算序列的碱基组成和两序列间的转换/颠换比值，统计和分析序 列的差异。用PAUP软件的PTP test进行序列信息检验。
(6) 经上述步骤(5)的DNA数据分析，各项检测结果如下
a、 待鉴定菌种的ITS区序列与本发明的序列表中金耳的ITS区序列的碱基差异为0;
b、 待鉴定菌种的ITS区序列与本发明的序列表中金耳的ITS区序列的转换/颠换比值相等；
c、 待鉴定菌种的ITS区序列与本发明的序列表中金耳的ITS区序列的相对遗传距离为0%; 判定待鉴定真菌菌禾中为金耳7>ewe//a awra""a化fl！ Bandoni et Zang菌种。
SEQUENCE LISTING
〈110〉江苏同源堂生物工程有限公司
〈120〉金耳与寄主真菌粗毛韧革菌的ITS区序列及利用该序列鉴定金耳的方法 〈■2
〈210>1
〈211〉467
〈212〉DNA
〈213〉金耳(7>ewe//a awmw//of/6a Bandoni et Zang)
〈400〉1
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<210〉2
〈211〉548
〈212〉DNA
〈213〉粗毛韧革菌(&erew附/z/nsw^w (Willd.)Fr.)
〈400〉2
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CCtCtC333tgcaLtt3gtgcgtcttgttgcgscgtgcgcctcggtgtgst33tt3tCt3C權
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3tCg33Ct
权利要求
1、一种金耳与寄主真菌粗毛韧革菌的ITS区序列，其特征在于所说金耳的ITS区序列，如SEQ ID NO.1所示；金耳的寄主真菌粗毛韧革菌的ITS区序列，如SEQ ID NO.2所示。
2、 一种利用权利要求1所述的金耳与寄主真菌粗毛韧革菌的ITS区序列鉴定金耳品种的方法，包括以下步骤(1) 从待鉴定真菌样品中提取基因组DNA;(2) 以步骤(1)提取得到的DNA样品为模板，用针对金耳ITS区的专用引物进行聚合酶链式 反应扩增得到待鉴定真菌的ITS片段产物，扩增的正向引物P1为 5，-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，，位于18S上；反向引物P2为5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，，位于28S上，在50叱的体系中完成扩 增反应，以双蒸水代替模板DNA作空白对照；(3) 将步骤(2)扩增反应得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化；(4) 将步骤(3)纯化后的ITS区产物直接进行测序，得到待鉴定真菌样品的ITS区序列；(5) 将步骤(4)得到的序列与SEQIDNO.l和SEQ ID N0.2序列分别进行比较，其中 步骤(4)得到的ITS区序列与SEQIDNO.l和SEQ ID N0.2序列都吻合则判断为金耳品种。
3、 一种利用权利要求1所述的金耳与寄主真菌粗毛韧革菌的ITS区序列鉴定金耳菌种或粗毛 韧革菌菌种的方法，包括以下步骤(1) 从待鉴定真菌样品中提取基因组DNA;(2) 以步骤(1)提取得到的DNA样品为模板，用针对金耳ITS区的专用引物进行聚合酶链式 反应扩增得到待鉴定真菌的ITS片段产物，扩增的正向引物P1为 5，-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，，位于18S上；反向引物P2为5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，位于28S上，在50化的体系中完成扩 增反应，以双蒸水代替模板DNA作空白对照；(3) 将步骤(2)扩增反应得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化；(4) 将步骤(3)纯化后的ITS区产物直接进行测序，得到待鉴定真菌样品的ITS区序列；(5) 将步骤(4)得到的序列与SEQIDNO.l和SEQ ID N0.2序列分别进行比较，其中 若步骤(4)得到的ITS区序列仅与SEQIDNO.l序列吻合则判断为金耳菌种；若步骤(4)得到的ITS区序列仅与SEQIDN0.2序列吻合则判断为粗毛韧革菌菌种。
全文摘要
本发明涉及一种真菌品种的DNA序列及利用该序列鉴定其品种的方法，所说的金耳的ITS区序列如SEQ ID NO.1所示；寄主真菌粗毛韧革菌的ITS区序列如SEQ ID NO.2所示。鉴定时，先提取待鉴定样品的ITS区序列，交其与与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列分别进行比较，从而得到结果。本发明可以准确地判定待鉴定真菌的真伪，也可以对人工培养的金耳酵母状孢子菌种和寄主真菌粗毛韧革菌菌种进行准确的鉴定。，能准确区分和判别金耳品种或菌种的真实性和纯度，为品种鉴定、保护、菌种质量控制及有效菌种繁育提供可靠技术。
文档编号C12N15/31GK101348833SQ20081012443
公开日2009年1月21日 申请日期2008年7月16日 优先权日2008年7月16日
发明者俞建国, 刘春卉, 瞿伟箐, 马维新 申请人:江苏同源堂生物工程有限公司