专利名称：一种虾白斑综合症病毒病检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测病毒的试剂盒及检测方法，具体涉及一种检测白斑综 合症病毒的试剂盒及检测方法。
背景技术：
自1993年以来，我国沿海对虾养殖业常常遭受暴发性流行病的侵袭。该 病传染性强、宿主广、致死率髙，严重制约着我国对虾养殖业的持续发展。现 已证实对虾暴发病的病原是白斑综合症病毒(WSSV)。目前WSSV已遍及亚洲 主要对虾养殖国家和地区，并已传播到北美洲。在已报道的所有对虾病毒中， 该病毒毒力最强，危害最大，南美白对虾、斑节对虾、日本对虾、墨吉对虾、 长毛对虾、中国对虾、印度对虾、桃红对虾、蓝对虾、白对虾、褐对虾、刀额 新对虫下、脊尾白奸、斑节对虾等，大部分养殖对虾皆可被WSSV侵染，在浮 游生物、海葵、糠虫下、白虾、毛虾、天津厚蟹、日本大眼蟹等动物中可检测出 WSSV，在怀池的蟹、桡足类和昆虫(Ephydridae)体内也检到过WSSV,表明 WSSV地域分布及宿主范围非常广泛，早在1995年国际兽疫局(OIE)、联合 国粮农组织(FAO)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)将其列为 需要报告的重要的水生动物病毒病病原之一。
有关WSSV的研究在病原学、病理学、流行病学以及诊断学研究方面已 深入到分子水平，但由于诸多原因，到目前为止还不能完全控制WSSV的疫 情，面对WSSV的传布所能采取最主要的措施是及早发现和消灭传染源，果 断切断传播途径。这样就需要建立和完善灵敏、准确、髙效、快捷、方便的检 测方法，现有的检测WSSV感染的方法很多，大致可以分为三类，即病原学、 免疫学以及基因组检测。
用组织病理学和电子显微镜的方法来来检测WSSV耗时长，操作繁琐， 灵敏度低，极易漏检，不宜对大批样品进行检测。
免疫学检测制备髙效价抗体是WSSV免疫检测的关键，其最佳方案是制备单克隆抗体。wssv的单克隆抗体免疫检测，其特异性、灵敏性和可重复性
大大提髙，方法快速、灵敏、简单、低成本，在实验条件一般的实验室内均能 进行，但这类方法的发展落后于现代分子生物学技术。
通过基因组来检测，以WSSV的特有序列为耙序列进行检测，其中PCR 检测由于其快速而又特异，应用方便，还可以进一步衍生出巢式 PCR(nested-PCR)，但为避免假阳性结果需设置内控引物，同时因PCR反应 时间长、还需要专门的PCR仪，新近还有利用实时PCR (real-time PCR)来 检测WSSV,更是需要专用的仪器。另外还有利用核酸杂交技术，通过原位杂 交或斑点杂交来完成，原位杂交需要先制组织切片，而且此法耗时长，操作繁 琐，不适合在基层使用，斑点杂交需要把待测核酸固定于杂交膜上再行杂交、 显影，适合于批量样品操作，但仅杂交后的显影检测需15小时左右，耗时长。
近年来发展起来的环介导等温扩增法(LAMP， loop-mediated isothermal amplification),该方法可以高灵敏地非常有选择性地髙效扩增靶序列(Notomi et al.， 2000),最终的LAMP产物是是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结 构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区 带组成的阶梯式图谱。LAMP是一种全新的恒温核酸扩增方法，和其它核酸扩 增技术相比，其反应原理、引物设计更加复杂。但是它具有等温扩增只需要 一个恒温装置就可以；髙效灵敏模板仅需要10个拷贝或更少；扩增特异性 强应用包含了六个区段的四条引物按严格顺序进行扩增；检测时间短扩增 可以在90min完成，比普通PCR反应还要省时间；产物可以通过直接在反应 管中加SYBRGreenI染色(由橙色转为绿色)或用琼脂糖凝胶电泳检测。因 此LAMP在核酸的科学研究、疾病的诊断和预防、动物胚胎的性别鉴定和转 基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。2004年Tomoya Koiio将WSSV 从kuruma shrimp中纯化出来，再提取WSSV的核酸，利用LAMP技术对此 核酸进行扩增，结果证实LAMP可用于WSSV相应序列的扩增；但是该方法 对中提纯步骤复杂而且对设备要求髙，设备昂贵，适用性不普遍，另外，LAMP 技术应用到实际检测中，还需要解决的问题包括引物的设计和实验条件的优 化。
发明内容
本发明目的是提供一种检测虾wssv的试剂盒及检测方法，简化检测步
骤，縮短检测耗时，同时提髙检测的灵敏度和特异性。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是 一种环介导等温扩增检测虾 白斑综合症病毒病(WSSV)的引物，由一对外引物和一对内引物组成，其中 一对外引物由前外引物F3-131和后外引物B3-131组成； 一对内引物由前内引 物FIP-131和后后内引物BIP-131组成；
所述前内引物FIP-131包含F1C, —个TTTT连接子和F2-131,其序列 如下所示5" -CCA GTG CAC TAT TCC CAT TAG AAG GTT TTA CCA CTC CCT TCA TTA TTG TC-3，；后内引物BIP-131包含B1C， 一个连接子和 B2-131,其序列如下所示5，-CCT TTT GCC CCT TCA GCT GAT TTT CTG AGC CAG GTG TTC TG-3，；前外引物F3-131的序列为5，-TGT GGA TGA TTA TCC TGT GTT-3，；后外引物B3-131的序列为5'-TCT CTC TGG TGA ACC CAT-3，。
上述引物是根据WSSV DNA基因组序列，选取WSSV ORF131 (其 GenBaiik登录号为No. EF524223),经BLAST分析确定其保守区域且与 GenBank公布的其它核酸序列无同源，同时根据引物设计原则分别设计的， 上述引物具体涉及的6个位点如下所示
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GGGGCAAGAG GGTCTGGTAT AAATACTGGA AGATATAGAA GAAATAACAC TGTTCTATAG CCCCGTTCTC CCAGACCATA TTTATGACCT TCTATATCTT CTTTATTGTG ACAAGATATC为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种环介导等温扩增检测虾 WSSA的试剂盒，由一套引物、DNA提取缓冲液、DNA聚合酶、环介导等温 扩增反应液、阳性对照、阴性对照、甜菜碱和dNTP组成；所述的一套引物是 由一对外引物和一对内引物组成，其中一对外引物由前外引物F3-131和后外 引物B3-131组成 一对内引物由前内引物FIP-131和后后内引物BIP-131组 成
所述前内引物FIP-131包含F1C, —个TTTT连接子和F2-131,其序列 如下所示5" -CCA GTG CAC TAT TCC CAT TAG AAG GTT TTA CCA CTC CCT TCA TTA TTG TC匿3，；
后内引物BIP-131包含B1C， 一个连接子和B2-131,其序列如下所示 5，-CCT TTT GCC CCT TCA GCT GAT TTT CTG AGC CAG GTG TTC TG-3,;
前外引物F3-131的序列为5，-TGT GGA TGA TTA TCC TGT GTT-3，； 后外引物B3-131的序列为5，-TCT CTC TGG TGA ACC CAT-3，； 所述提取缓冲液的组成包括10mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCI)， 0.05mM乙二胺四乙酸(EDTA)， 5mM硫酸铵((NH4)2S04)，
0.1%质量百分浓度曲拉通X-100 (Triton X-100);溶液pH为7.8;
所述DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶所述环介导等温
扩增反应缓冲液为与Bst DNA聚合酶配套的，并且配套出售提供的环介导等
温扩增反应液，通常配套提供的为10倍环介导等温扩增反应液(10XLAMP
反应液)；
所述阳性对照为WSSV质粒片段，选自WSSV ORF131 (其GenBank登 录号为No. EF524223)质粒片段；
所述阴性对照为健康IF的DNA提取物，即没有受到WSSV感染的健康的 虾，虾的种类与带检测的虾保持一致，例如当待检测的虾为克氏螯虾时，阴 性对照即为健康的克氏螯虾的DNA提取物；当待检测的虾为罗氏沼虾时，阴 性对照即为健康的罗氏沼虾的DNA提取物。以健康虾的DNA提取物为阴性 对照而不选用二次蒸馏水为阴性对照的目的是保证检测的真实有效性，因为如 果以二次蒸馏水为阴性对照，以WSSV质粒片段为阳性对照时，即使待检测的虾最后的检测结果呈阳性，那么也可能是由于虾的DNA导致的；而如果以 健康的同一种类的虾的DNA提取物为阴性对照，以WSSV质粒片段为阳性对 照时就不会出现这样的情况；所述虾的种类包括中国对虾、南美白对虾、克 氏螯怀、罗氏沼虾、斑节对虾等。
所述dNTP为含有四种dNTP的等量混合物。 使用上述试剂盒检测虾WSSV的方法，包括以下步骤
(1) 提取待检测虾的总DNA: (l)提取待检测虾的总DNA:取待检测虾的组 织于沸水中煮6 20min，离心去水分后加入DNA提取缓冲液，充分磨碎后加 酚摇匀10 30min,离心后将上清转移到新管中再加酚/氯仿摇匀5 15min， 离心后取其上清，作为供扩增的目的模板；
所述酚/氯仿溶液的配比为酚和氯仿的体积比为1: 1;
(2) 配置扩增体系在每25 1U扩增体系中，包含10XLAMP反应液2.5pL, 终浓度各为0.8pmol/L的内引物FIP-131和BIP-131,终浓度各为0.2pmol/L 的外引物F3-131和B3-131，终浓度为0.4nmol/L的dNTP，终浓度为lmol/L 的甜菜碱，步骤(l)所得的模板4pL;补加灭菌的超纯水至24pL;
(3) 将反应混合物混匀后加热变性，冷却后加入lpL的8U/pL的BstDNA 聚合酶，混匀后于60 63'C孵育60~90min,结束反应；
(4) 检测LAMP反应产物。
上述技术方案中，检测LAMP反应产物的方法为现有技术，可以通过1.5% 的琼脂糖凝胶电泳检测LAMP反应产物，有扩增条带出现的为检测结果阳性； 或者向LAMP反应产物中加入100倍稀释的SYBR Green I染料lfiL后，颜 色由橙色变为绿色，提示检测结果为阳性。
优选的技术方案中，步骤(l)提取待检测虾的总DNA的方法如下 取待检测虾的组织于沸水中煮lOmhi,离心去水分后加入DNA提取缓冲 液，充分磨碎后加酚摇匀15min,离心后将上清转移到新管中再加酚/氯仿摇 匀10min，离心后取其上清，作为供扩增的目的模板。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点 (l)本发明实现了对患WSSV病虾的快速诊断，整个检测时间可以在4小时 左右完成，比最快的PCR的检测还要短，比用核酸杂交法检测时间省10小时以上。
(2) 本发明基于检测是否存在WSSV基因组，对WSSV核酸相关片段进行
特异性扩增，通过检测是否有扩增产物来实验对患wssv病虾的wssv检测，
但LAMP不再需要PCR仪这样的专业仪器，代替PCR仪的只是一个恒温装 置，例如控温精度髙的水浴锅。
(3) 与PCR扩增检测相比，LAMP的检测灵敏度要比PCR髙出千倍以上。
(4) 特异性增强，PCR扩增是针对了靶序列的二个区段用2个(一对)引物 进行匹配实现扩增，而LAMP需要设计4个(二对)引物覆盖了靶序列的6 个区段，因而其特异性有很大提髙。
(5) 基于对DNA提取方法的改进，改进后的提取方法与通常DNA提取方法 相比，时间要节约一半以上，而且操作更为方便。
(6) 与基于病原直接诊断、免疫学诊断来检测虾WSSV相比，本发明的检测 周期更短，操作简便，而且适合批量检测，所需费用也低。
具体实施方式
下面实施例对本发明作进一步描述 实施例一自然感染WSSV克氏螯虾的诊断
一种检测!l下WSSV的方法，该方法采用的试剂盒由一套引物、DNA提取 缓冲液、DNA聚合酶、环介导等温扩增反应液、阳性对照、阴性对照、甜菜 碱和dNTP组成；所述的一套引物是由一对外引物和一对内引物组成，其中一 对外引物由前外引物F3-131和后外引物B3-131组成； 一对内引物由前内引物 FIP-131和后后内引物BIP-131组成；
所述提取缓冲液的组成包括10mM三(羟甲基)氨基甲垸盐酸盐 (Tris-HCl), 0.05mM乙二胺四乙酸(EDTA)， 5mM硫酸铵((NH4)2S04)， 0.1%质量百分浓度曲拉通X-100 (Triton X-100);溶液pH为7.8;
所述DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶；所述环介导等温 扩增反应缓冲液为与BstDNA聚合酶配套的IO倍环介导等温扩增反应液(10 XLAMP反应液)；
所述阳性对照为WSSV质粒片段，选自WSSV ORF131 (其GenBaiik登录号为No. EF524223)质粒片段；取pET-28a(+)墨WSSV ORF13"l OD/500fi1) 0.5jU，其它成分同检测组，用双蒸水补足到总体积24jil;
所述阴性对照为健康虾的DNA提取物，含有克氏螯虾虾DNA (1 OD/200pl) 0.5fd,其它成分同检测组，用双蒸水补足到总体积24^1;
所述dNTP为含有四种dNTP的等量混合物。
技术操作过程如下
l.模板DNA的提取取环境中怀疑被自然感染WSSV的克氏螯虾新鲜组 织0.2 g,于沸水中煮10min，离心弃尽水后充分研磨，按1/3 (W/V)比例加 入DNA抽提缓冲液(10 mM Tris-HCl， 0.05 mM EDTA， 5mM(NH4)2S04， 0.1% Triton X-100，pH7.8),再力卩入500 饱和酚，颠倒混合15min后12,000 rpm， 离心10 rnin。上清转入新的离心管，加入等体积的酚/氯仿，颠倒混合，12,000 rpm，上清即可作为下一步扩增的模板用；耗时约50分钟。
2丄AMP扩增LAMP的反应为25 体系，其中包含10 X buffer 2.5 ; 针对WSSV ORF 131的FIP-131(5" -CCA GTG CAC TAT TCC CAT TAG AAG GTT TTA CCA CTC CCT TCA TTA TTG TC-3")， BIP (5，-CCT TTT GCC CCT TCA GCT GAT TTT CTG AGC CAG GTG TTC TG-3，)终浓度各为0.8 拜ol/L; F3 (5'隱TGT GGA TGA TTA TCC TGT GTT-3,), B3 (5，-TCTCTC TGG TGA ACC CAT-3，)终浓度各为0.2 pmol/L; dNTP终浓度为0.4 pmol/L; 甜菜碱终浓度为1 mol/L;模板4pL，补加灭菌的超纯水至24 pL。将反应混 合物混匀后，于95 min变性5 min，迅速至冰上冷却5 min后加入8 U (lpL) 的BstDNA聚合酶，混匀后于60'C孵育60 min, 90'C 2 min结束反应。
3丄AMP反应产物通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示有扩增条 带出现，表明结果为阳性。
实施例二人工感染WSSV后克氏螯虾的诊断
技术操作过程如下
1. 模板DNA的提取取实验室中养殖的健康克氏螯虾，用注射WSSV的 方法进行WSSV感染，待人工感染虾出现相关症状后，按实施实例一步骤1 提取模板DNA。
2. LAMP扩增所用引物针对了 WSSV ORF 131区域，经BLAST比对证实可被用于检测后，设计引物FIP-131 (5， -CCA GTG CAC TAT TCC CAT TAG AAG GTT TTA CCA CTC CCT TCA TTA TTG TC-3'), BIP (5，-CCT TTT GCC CCT TCA GCT GAT TTT CTG AGC CAG GTG TTC TG-3'), F3 (5，-TGT GGA TGA TTA TCC TGT GTT-3'), B3 (5，-TCT CTC TGG TGA ACCCAT-3，)。扩增的条件为631C 60 rnin,其余同实施实例一中步骤2。
3.向LAMP反应产物中加入100倍稀释的SYBR Green I染料ljiL后， 颜色由橙色变为绿色，提示检测结果为阳性。
实施例三人工感染WSSV的克氏螯虾诊断
1. 模板DNA的提取(采用了普通PCR方法中的DNA提取法，耗时约110 分钟)取怀疑被自然感染WSSV养殖的克氏螯虾组织0.2g，冰上充分研磨后 按1/6 (W/V)比例加入TN缓冲液(50 mM Tris隱HCl， 0.4 M NaCl, pH7.6)， 将含病毒的组织研磨液分至两个离心管中，每管500 ^1。加入等体积的酚，颠 倒混合。4'C， 12,000 rpm,离心10 min。上清转入新的离心管，加入等体积 的酚/氯仿，颠倒混合，4'C， 12,000 rpm,离心10 min。上清转入新的离心管， 加入等体积的氯仿，颠倒混合，4'C， 12,000 rpm，离心10 min。上清再转入 新的离心管中，加入1/10体积NaAC(3 mol/L)，两倍体积的预冷无水乙醇， 颠倒混匀后4'C， 12,000 rpm，离心10min。吸去上清，倒置两分钟后。加入 500 ^L70%乙醇于沉淀中洗盐后，4'C, 12,000 rpm离心5 min。弃上清，室 温或37'C晾干后溶于50pLTE缓冲液中，并作101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109倍系列稀释，作为下一步扩增用模板。
2. 靶序列LAMP扩增，取步骤1中所制备的样品各2pL作为模板，分别 进行LAMP扩增，扩增条件为60'C 90min，其余同实施实例 一 中步骤2 。
3丄AMP扩增产物的检测实施实例一中步骤3，结果全部显示阳性，以同 样模板进行PCR扩增并将扩增片段克隆测序证实为WSSV的核酸片段，结果 证明LAMP阳性结论正确，只是LAMP的灵敏度比PCR的灵敏度髙了上千 倍。
实施例四自然感染WSSV罗氏沼虾的诊断 技术操作过程如下
l.模板DNA的提取将待检测养殖的罗氏沼虾，按实施实例三步骤l提取模板DNA，但模板不作稀释。
2. 靶序列扩增同实施例一中步骤2。
3. 扩增产物检测同实施例一中步骤3。结果显示WSSV阳性，并且得到电 镜观察结果的支持。
权利要求
1. 一种环介导等温扩增检测虾白斑综合症病毒病的引物，由一对外引物和一对内引物组成，其特征在于其中一对外引物由前外引物F3-131和后外引物B3-131组成；一对内引物由前内引物FIP-131和后后内引物BIP-131组成；所述前内引物FIP-131的序列如下所示5’-CCA GTG CAC TAT TCC CAT TAG AAG GTT TTA CCA CTC CCTTCA TTA TTG TC-3’；后内引物BIP-131的序列如下所示5’-CCT TTT GCC CCT TCA GCT GAT TTT CTG AGC CAG GTG TTCTG-3’；前外引物F3-131的序列为5’-TGT GGA TGA TTA TCC TGT GTT-3’；后外引物B3-131的序列为5’-TCT CTC TGG TGA ACC CAT-3’。
2. —种环介导等温扩增检测虾白斑综合症病毒病的试剂盒，其特征在于 由一套引物、DNA提取缓冲液、DNA聚合酶、环介导等温扩增反应液、阳性 对照、阴性对照、甜菜碱和dNTP组成；所述一套引物是由一对外引物和一对内引物组成，其中一对外引物由前外 引物F3-131和后外引物B3-131组成； 一对内引物由前内引物FIP-131和后后 内引物BIP-131组成；所述前内引物FIP-131的序列如下所示5' -CCA GTG CAC TAT TCC CAT TAG AAG GTT TTA CCA CTC CCT TCA TTA TTG TC陽3，；后内引物BIP-131的序列如下所示5，-CCT TTT GCC CCT TCA GCT GAT TTT CTG AGC CAG GTG TTC TG-3，；前外引物F3-131的序列为5，-TGT GGA TGA TTA TCC TGT GTT-3，； 后外引物B3-131的序列为5，-TCT CTC TGG TGA ACC CAT-3，。 所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；所述阳性对照为WSSV质粒片段，选自WSSV ORF 131质粒片段； 所述阴性对照为健康虾的DNA提取物。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述DNA提取缓冲液的组成包括lOmM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，0.05mM乙二胺四乙酸，5mM 硫酸铵，0.1%质量百分浓度曲拉通X-100;溶液pH为7.8。
4. 使用权利要求2所述的试剂盒检测虾白斑综合症病毒病的方法，其特征在于包括以下步骤(1) 提取待检测虾的总DNA:取待检测虾的组织于沸水中煮6 20min，离 心去水分后加入DNA提取缓冲液，充分磨碎后加酚摇匀10 30min，离心后 将上清转移到新管中再加酚/氯仿摇匀5 15min,离心后取其上清，作为供扩 增的目的模板(2) 配置扩增体系:在每25U1扩增体系中，包含10倍环介导等温扩增反 应液2.5pL，终浓度各为0.8pmol/L的内引物FIP-131和BIP-131，终浓度各 为0.2pmol/L的外引物F3-131和B3-131，终浓度为0.4|umol/L的dNTP，终 浓度为lmol/L的甜菜碱，步骤(l)所得的模板4fiL;补加灭菌的超纯水至24HL;(3) 将反应混合物混匀后加热变性，迅速于冰中冷却后加入lpL的8U/^L 的BstDNA聚合酶，混匀后于60 63"C孵育60 90min，结束反应；(4) 检测环介导等温扩增反应体系，如检测到环介导等温扩增反应产物，则 待测虾患有白斑综合症病毒病。
5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于步骤(l)提取待检测虾 的总DNA的方法如下取待检测虫下的组织于沸水中煮lOmiii,离心去水分后加入DNA提取缓冲 液，充分磨碎后加酚摇匀15min,离心后将上清转移到新管中再加酚/氯仿摇 匀10min,离心后取其上清，作为供扩增的目的模板。
全文摘要
一种虾白斑综合症病毒病检测试剂盒及检测方法，该试剂盒由一套引物、DNA提取缓冲液、DNA聚合酶、环介导等温扩增反应液、阳性对照、阴性对照、甜菜碱和dNTP组成；采用本发明可以检测出待检测虾是否感染虾白斑综合症病毒；本发明利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6个区域，在等温条件下生成大量的茎环样结构，在定性检测时不需任何特殊设备。因此具有特异性、灵敏度高和检测时间比普通PCR短的特点。
文档编号C12Q1/70GK101418352SQ200810243140
公开日2009年4月29日 申请日期2008年12月9日 优先权日2008年12月9日
发明者张伟明, 曹广力, 贺 杨, 沈卫德, 薛仁宇, 贡成良, 顾金寿, 魏育红 申请人:苏州大学