用于减少RNAi中的脱靶表型效应的siRNA的不依赖于序列的修饰形式和其稳定形式的制作方法

专利名称：用于减少RNAi中的脱靶表型效应的siRNA的不依赖于序列的修饰形式和其稳定形式的制作方法
用于减少RNAi中的脱靶表型效应的s i RNA的不依赖于序列 的修饰形式和其稳定形式领域本教导总地来说涉及用于减少RNA干扰中不依赖于序列的脱靶表型效应 (off-target phenotypic effect)的组合物、方法和试剂盒。引言短干扰RNA (siRNA)有效地诱导互补mRNA的切割，从而使mRNA无功能，且在细胞 中导致功能性蛋白质的丧失。此类分子借以发挥作用的机制已得到部分表征。简而言之， siRNA的2条RNA链中的一条被整合入称为RISC的酶复合物中，然后该复合物能够结合并 且切割含有互补序列的mRNA，从而消除成熟mRNA使之不能翻译成蛋白质。siRNA的两条链 中的每一条都可被整合入R I SC复合物。然而，在其5'末端具有较弱的碱基配对的链优 先用于整合。因此，任何siRNA都将导致产生激活的RISC复合物的混合物(其可切割预期 的靶RNA和非靶向的RNA)。在生物学应用中，期望绝大部分，优选所有的激活的RISC复合 物包含与期望的靶互补的siRNA链。本教导提供了不仅可用于减少mRNA被非期望的siRNA 链切割而且还可用于减少内源基因的干扰的脱靶效应的方法、组合物和试剂盒。概述出人意料地，增加或维持链偏向性(strand bias)，虽然是维持内源RNA干扰的 效力所必需的，但不足以在细胞生物学测定中减少脱靶效应。本文中研究了在其中外源提 供靶mRNA以及其中靶mRNA是内源mRNA的条件下，在其中将不同类型的修饰核苷酸引入 siRNA的条件下以及在其中将不同修饰形式引入siRNA的条件下，减少或使脱靶效应降至 最低同时维持效力的能力。此外，针对许多靶RNA中的每一个靶RNA，研究了多种siRNA修 饰形式。因此，减少或使脱靶事件降至最低并且维持高效siRNA的效力(如在表型和细胞 生物学水平上观察到的)的修饰的核苷酸和修饰形式可用于任何siRNA序列，并且不依赖 于siRNA的碱基序列。即，本文中提供的修饰形式是不依赖于序列的修饰。在一些实施方案中，提供了化学合成的过客(passenger)(有义)寡核苷酸，其具 有15至30个核苷酸的长度并且包含如下的不依赖于序列的修饰形式(1)、不依赖于序列的 修饰形式(2)和不依 赖于序列的修饰形式(3)中的一个(1)5' Np-m-m-Nx-m-m-Nq-nr3'，其中 ρ 为 0 或 1 ;x 为 7、8、9、10 或 11 ;r 为 0、1 或 2 ；以及q是表示过客链的长度减去(p+x+r+4)的整数；(2) 5 ‘ Np-m-m-Ny-m-Nz-m-Nq-nr3 ‘，其中 ρ 为 0或 l;y 为 7、8 或 9 并且 ζ 为 1 ；或 y为7并且ζ为2或3 为0、1或2 ；以及q是表示过客链的长度减去(p+y+z+r+4)的整 数；(3)5' m-Nfm-Nx-m-m-Nq-nJ'，其中 χ 为 8、9 或 10 ;r 为 0、1 或 2 ；以及 q 为表示 过客链的长度减去(x+r+5)的整数；其中各m独立地是二环核苷酸或三环核苷酸；各η独立地是脱氧核苷酸、修饰的核 苷酸或核糖核苷酸；当m是二环核苷酸时，各N独立地是除了二环核苷酸外的核苷酸，以及 当m是三环核苷酸时，各N独立地是除了三环核苷酸外的核苷酸。
在一些实施方案中，提供了化学合成的短干扰RNA，其包含上述过客(有义)寡核苷酸和引导(反义)寡核苷酸，所述引导寡核苷酸具有15至30个核苷酸，与至少12个核 苷酸的过客(有义)寡核苷酸连续互补的区域；引导链还与靶mRNA的至少一部分具有互补 性。在一些实施方案中，提供了短干扰RNA，其包含过客(有义)寡核苷酸和引导(反 义)寡核苷酸，所述过客寡核苷酸具有17至30个核苷酸的长度并且包含不依赖于序列的 修饰形式(4)、形式(5)和形式(6)中的一个，所述引导寡核苷酸具有17至30个核苷酸，与 至少12个核苷酸的过客(有义)寡核苷酸连续互补的的区域；引导链还与靶mRNA的至少 一部分具有互补性，(4)5' mp-Nx-m-m-Nq-nr3'，其中当 ρ 为 0 时，χ 为 12 ；当 ρ 为 1 时，χ 为 11 ；当 ρ 为 2时，χ为10 ；当ρ为3时，χ为9 ；当ρ为4时，χ为8 ;r为0、1或2 ；以及q是表示过客链 的长度减去(p+x+r+2)的整数；(5)5' m-m-Nx-m-Nq-n，，其中χ为ll;r为0、1或2;以及q是表示过客链的长 度减去(x+r+3)的整数；(6)5' mp-Ny-m-Nz-m-Nrnr3'，其中ρ为 3 ;y 为9并且ζ 为 1 ;r 为0、1 或2 ；以及 q为表示过客链的长度减去(p+y+z+r+2)的整数；其中各m独立地是二环核苷酸、三环核苷酸或2' _修饰的核苷酸；各η独立地是 脱氧核苷酸、修饰的核苷酸或核糖核苷酸并且为悬突核苷酸；当m是二环核苷酸时，各N独 立地是除了二环核苷酸外的核苷酸，当m是三环核苷酸时，各N独立地是除了三环核苷酸外 的核苷酸，以及当m是2'-修饰的核苷酸时，各N独立地是除了 2'-修饰的核苷酸外的 核苷酸。在短干扰RNA的实施方案中，过客(有义)寡核苷酸具有不依赖于序列的修饰形 式(4)，ρ为2，χ为10，r为2，各η是悬突核苷酸，并且各η独立地是修饰的核苷酸；引导 (反义)寡核苷酸包含2个3' _悬突修饰的核苷酸；并且各修饰的核苷酸独立地是二环 核苷酸、三环核苷酸或2'-修饰的核苷酸。在一个实施方案中，过客寡核苷酸的3'倒数 第三个位点和3'倒数第四个位点中的至少一个是修饰的核苷酸。3'倒数第三个位点是 从最后一个位点算起的第三个位点，即在倒数第二个位点之前的位点(例如，图IH的形式 DH47)。3'倒数第四个位点是从最后一个位点算起的第四个位点，即，倒数第三个位点之前 的位点(例如，图IH的形式DH29)。这样的siRNA例如在血清或血浆存在的情况下对于核 酸酶是特别稳定的。在短干扰RNA的一些实施方案中，当长度为17个核苷酸时，引导寡核苷酸的位点2 和3中的至少一个是修饰的核苷酸；当长度为18个核苷酸时，引导寡核苷酸的位点2、3和 4中的至少一个是修饰的核苷酸；当长度为19个核苷酸时，引导寡核苷酸的位点2、3、4和5 中的至少一个是修饰的核苷酸；当长度为20个核苷酸时，引导寡核苷酸的位点2、3、4、5和 6中的至少一个是修饰的核苷酸；以及当长度为21至30个核苷酸时，引导寡核苷酸的位点 2、3、4、5、6和7中的至少一个是修饰的核苷酸。图IK的形式DHl和形式DH39-DH43提供了 具有21个核苷酸的长度并且引导寡核苷酸的位点2、3、4、5、6和7中的至少一个是修饰的 核苷酸的siRNA修饰形式的实例。在一些实施方案中，引导寡核苷酸的位点2、3、4、5、6和 7(取决于上文引述的长度)中只有一个是修饰的核苷酸。这样的siRNA例如在血清存在的情况下对核酸酶也是特别稳定的。提供了减少或使关于通过RNA干扰抑制靶基因的表达的脱靶事件减少至最少的 方法，该方法包括将含有靶基因的细胞与足以减少脱靶事件同时保持效力的量的上述化学 合成的短干扰RNA接触，其中各m独立地是二环核苷酸或三环核苷酸。短语“同时保持效 力”在本文中用于使用足够量的siRNA以减少脱靶事件同时保持效力的背景中。在该背景 中，所述短语是指减少脱靶事件时对于减少siRNA的抑制(knockdown)活性的耐受性，其由 减少的抑制活性是否引起基因相关表型来指示。一般而言，“同时保持效力”是指抑制减少 至正常抑制水平的80%是可接受的。然而，对特定基因的减少的抑制的耐受性可在正常抑 制的50%至95%的范围内。在另外的实施方案中，提供了在通过RNA干扰抑制外源提供的靶基因的表达中减 少或使由过客链导致的切割降至最低的方法，该方法包括将含有靶基因的细胞与足以减少 或使由过客链导致的切割降至最低同时保持引导链的效力的量的化学合成的短干扰RNA 接触，短干扰RNA的过客链包含不依赖于序列的修饰形式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)或(6)中 的一个，其中各m独立地是2 ‘-修饰的核苷酸；各η独立地是脱氧核苷酸、修饰的核苷酸 或核糖核苷酸；并且各N独立地是未修饰的核苷酸。将切割的减少与未修饰的siRNA的切 割的减少相比较。在一些实施方案中，接触是含有细胞的细胞培养物或含有细胞的组织与化学合成 的短干扰RNA的体外接触。在另外的实施方案中，接触是含有细胞的组织、含有细胞的体液 或含有细胞的器官与化学合成的短干扰RNA的离体接触。在其他实施方案中，接触是含有 细胞的器官或动物与化学合成的短干扰RNA的体内接触。在一些实施方案中，接触是具有 赋予其核酸酶稳定性的修饰形式的短干扰RNA至有此需要的受试者的体内血管内施用。如 实施例8的数据所显示的，当与在相同的施用后时间点上存在于体内的缺乏修饰核苷酸的 对照短干扰RNA的量相比时，在施用后体内存在更大量的稳定的短干扰RNA。由本文中的实施方案提供的和在外源提供的基因上进行的RNA干扰测定显示不 同修饰形式中许多类型的修饰核苷酸提供了增强的链偏向性同时保持效力。参见图4Α和 图4Β中关于使用二环核苷酸的形式Η、Κ和0的数据以及图6Α和图6Β中关于使用2 ‘ -0-甲 基核苷酸的形式H、K和0的数据。出人意料地，此类修饰的核苷酸和修饰形式在内源基因的RNA干扰中减少或使脱 靶事件减少至最少的能力不同。进行微阵列分析以测定差异表达的基因的数目，其是由引 入的siRNA导致的脱靶效应的量度。差异表达的基因定义为由于RNA干扰而具有至少2倍 变化(P值小于0.001)的基因。与由具有相同siRNA序列的未修饰形式A siRNA导致的差 异表达的基因的数目相比，LNA 核苷酸修饰形式H siRNA产生减少38%至68%的差异表 达的基因。相比之下，当与未修饰形式AsiRNA比较时，2' -0-甲基修饰形式HsiRNA产生 减少0%至22%的差异表达的基因。因此，LNA 核苷酸修饰的siRNA在减少脱靶效应上 比2' -0-甲基修饰的siRNA更有效，如通过全基因特征 谱分析所确定的。参见图9Α至图 9C。使用实施例6举例说明的细胞生物学研究确认这些出人意料的发现。当就内源基 因的siRNA干扰分析结果的集合时，很明显，图IlC中显示的各种修饰形式中2' -0-甲基 修饰的核苷酸与未修饰形式相比，未将“脱靶”表型消除至统计学上显著的程度。这些结果与图IOE的结果相反，这显示具有形式H的siRNA消除脱靶效应的统计学上显著的能力，如通过与未修饰形式A相比更低的细胞凋亡信号所证明的。在一些实施方案中，化学合成的短干扰RNA还与下文中进一步描述的靶向细胞的 ΚΙΦ (cell-targeting ligand)结本文中的实施方案涉及包含过客寡核苷酸、引导寡核苷酸或化学合成的短干扰 RNA以及生物学上可接受的载体的组合物。此外，本文中的实施方案还涉及例如包含过客寡 核苷酸、引导寡核苷酸或化学合成的短干扰RNA以及转染剂的试剂盒。实施方案的具有含 有修饰核苷酸的修饰形式的短干扰RNA提供了提高的功效从而节省了设计和测试siRNA的 时间，提供了提高的特异性从而节省了花费在虚假结果上的时间和金钱，提供了提高的效 力从而允许使用更少的材料获得期望的效果。提高的功效和特异性还允许每基因使用更少 的siRNA进行单个基因和文库筛选研究。在另一个实施方案中，减少RNA干扰的脱靶效应的方法包括获得具有过客有义链 (其包含与靶转录的RNA同源的区域)且具有与所述有义链互补的引导反义链的siRNA，所 述 siRNA 具有修饰形式 H、Q、V-2、Y、Y+l、JB1、JB2、JB 3、JB4 或 JB5，和将所述 siRNA 与细 胞接触。通过与由未修饰的siRNA(其具有与修饰形式化的(modificat ion-formatted) siRNA相同的序列)引起的脱靶效应相比，测量脱靶效应的降低。在另外的实施方案中，增加SiRNA在富含核酸酶的环境中的稳定性的方法包括获 得具有过客有义链(其包含与靶转录的RNA同源的区域)、具有与所述有义链互补的引导 反义链且具有3'悬突核苷酸的siRNA，所述siRNA具有修饰形式DH47、DH29、DHl、DH 39、 DH40、DH41、DH42或DH43，和将所述siRNA与富含核酸酶的环境相接触。通过与具有形式 F，具有相同类型的修饰核苷酸并且具有相同序列的siRNA的稳定性相比，测量siRNA的增 加的稳定性。另外的实施方案包括具有本文中提供的修饰形式的siRNA，其在体外、离体或体内 应用中用于RNA干扰以抑制靶基因的表达。当已知靶基因的表达与疾病相关时，本文中的 siRNA可用于所述疾病的筛查、诊断或治疗。本文中描述的SiRNA性能研究的出人意料的方面是，基于报告子的链型测定 (reporter-based strandedness assay)不能在细胞表型水平上预测修饰形式化的siRNA 的性能。使用下文中描述的微阵列全基因特征谱或基于细胞的测定来观察表型水平上的性 能的差异。根据本文中的描述，本教导的这些和其他特征将变得更显然。附图本领域技术人员将理解，下述附图仅用于举例说明的目的。附图无意以任何方式 限定本教导的范围。图IA至图IK提供了用于siRNA研究的修饰形式。位于核苷酸上面的数字表示核 苷酸在siRNA中相对于形式的5'末端的位置。m=修饰的核苷酸，N=核苷酸或具有除了 m的修饰外的修饰的修饰的核苷酸，η =核苷酸或修饰的核苷酸，P =磷酸基团。图2Α至图2Β提供了用于不同工作实例的表达报告载体的示意图。图2Α显示 包含萤火虫萤光素酶报告基因的pMIR-REPORT miRNA表达报告载体(Ambion/Applied Biosystems)的图谱。将不同目的基因(GOI)的编码区插入位于萤光素酶基因的3'末端的多克隆位点(MCS)中的HindIII (核苷酸位点463)与SpeI (核苷酸位点525)限制性内 切核酸酶位点之间。图2B显示包含β -半乳糖苷酶报告基因的pMIR-REP0RT i3 -gal对 照载体(Ambion/Applied Biosystems)的图谱。将对照载体与携带GOI的pMIR-REPORT miRNA表达报告载体进行共转染，所述对照载体用作转染标准化对照。图3A至图3B提供了描述pMI R-REP0RT mi RNA表达载体中克隆的GOI的mi RNA与萤光素酶基因的mRNA之间的方向关系的示意图。图3A提供了正向定向(forward orientation)，即GOI mRNA的5'-末端与fLuc mRNA的3'-末端紧邻。图3B提供了反 向定向，即GOI mRNA的5 ‘-末端远离fLuc mRNA的3 ‘-末端。图4A至图4E提供了针对具有未修饰形式A和指定的修饰形式的siRNA进行的实 施例2和3中描述的链测定的结果。图4A提供了在进行具有指定的修饰形式的siRNA的RNAi研究后存在的标准化的 报告蛋白的量。深色条块表示引导链的抑制活性，浅色条块表示过客链的抑制活性。为了 展示修饰的siRNA链的链型结果的分布，以箱线图(box plot)形式(也称为“箱须”图)提 供图4B至图4E的数据。“箱须”图的深色水平条表示数据集的中值，箱表示数据在数据集 的下四分位数和上四分位数上的分布，虚线(须)表示数据集的最小和最大值，椭圆形表示 各修饰形式的数据集中的异常值。图4B提供了通过下式测量的siRNA过客链的抑制活性过客链活性P =(来 自用测试siRNA处理的反向克隆的剩余的fLUC活性/ β gal活性)/(来自用Neg对照 siRNA处理的反向克隆的剩余的fLUC活性/ β gal活性)。将各修饰形式与未修饰形式进 行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式E，0. 1434 ；形式F，0. 1011 ；形式G， 0. 0002052 ；形式 H, 0. 0001755 ；形式 J, 0. 0002052 ；形式 K, 0. 006516 ；形式 M, 0. 002246 ；形 式 0,0.0009626。图4C提供了通过下式测量的引导链的抑制活性引导链活性G =(来自用测 试siRNA处理的正向克隆的剩余的fLUC活性/β gal活性)/(来自用Neg对照siRNA处 理的正向克隆的剩余的fLUC活性/iigal活性)。将各修饰形式与未修饰形式进行比 较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式E，0. 0001271 ；形式F，0. 8774 ；形式G， 0. 0006498 ；形式 H，0.8115 ；形式 J，0. 000006557 ；形式 K，0.01051 ；形式 M，0. 7898 ；形式 0， 0.8774。图4D提供了图4B和图4C的siRNA的过客链与弓|导链之间的fLUC活性的差异。通 过将标准化的正向fLUC活性减去标准化的反向fLUC活性来计算活性差异，或差异=P-G。 因此，如果过客链活性小于(较低的抑制，即，较高的萤光素酶活性)引导链(较高的抑制， 艮口，较低的萤光素酶活性)，则活性差异的值预期大于0。低于0的值表示过客链比引导链 更具活性。将各修饰形式与未修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下 形式 E, 0. 00792 ；形式 F, 0. 06043 ；形式 G, 0. 9664 ；形式 H, 0. 0014 ；形式 J, 0. 008715 ；形式， 0. 6634 ；形式 M, 0. 002516 ；形式 0，0. 0006498。图4E显示计算为(10&(P)-10&(G))的活性倍数变化，其提供了与修饰形式对图 4D的s i RNA的过客链的影响相比，所述修饰形式对引导链的影响的量度。因此，活性倍数 变化越大，siRNA的引导 链偏向性越大。将各修饰形式与未修饰形式进行比较的Wilcoxon 检验(成对的)的结果如下形式E，0.0002781 ；形式F，0.08937 ；形式G，0.2076 ；形式H，0. 01944 ；形式 J, 0. 0003223 ；形式 K, 0. 8553 ；形式 Μ, 0.002516 ；形式 0，0. 003504。图5Α至图5C提供了实施例3中描述的关于其中修饰形式进行链转换(与图4Α 至图4Ε的研究相比)的研究的结果。即，例如对于修饰F，将过客(有义)链的1、20、21修 饰引入引导(反义)链并且将引导(反义)链的20、21修饰引入过客(有义)链。图5Α提供了在对12个不同的具有链转换修饰的SiRNA进行RNAi研究后存在的 标准化的报告蛋白的量。深色条块表示引导链的抑制活性，浅色条块表示过客链的抑制活 性。图5Β以箱线图形式提供了图5Α的siRNA的过客链与引导链之间的活性的差异。 将各修饰形式与未修饰形式进行比较的Wilc0x0n检验(成对的)的结果对于所有形式都 是相同的，0. 03125。图5C提供了图5B的siRNA的过客链与引导链之间的活性的倍数变化。将各修饰 形式与未修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果对于所有形式都是相同的， 0.03125。图6A至图6C提供了实施例3中描述的关于其中修饰形式的修饰核苷酸被2‘ _0 甲基化的研究的链测定的结果。图6A提供了在对6个不同的具有指定的修饰形式的siRNA进行RNAi研究后存在 的标准化的报告蛋白的量。深色条块表示引导链的抑制活性，浅色条块表示过客链的抑制 活性。图6B以箱线图形式提供了图6A的siRNA组和实施例3中描述的额外的18个不 同siRNA的组的过客链与引导链之间的fLUC活性的差异。将各修饰形式与未修饰形式进 行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式H-1，0.001918 ；形式H，0. 00001574 ； 形式 H+1,0. 001091 ；形式 V-2,0. 0002131 ；形式 Κ，0· 0003619 ；形式 0,0. 406。图6C提供了图6Β的siRNA的过客链与引导链之间的活性的倍数变化。将各修饰 形式与未修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式Η-1，0. 02514; 形式 Η，0· 00001574 ；形式 Η+1，0. 007443 ；形式 V_2，0. 0001464 ；形式 K，0. 0003619 ；形式 0， 0.5446。图7Α至图7Β提供了实施例3中描述的关于其中修饰形式的修饰核苷酸是2‘， 5'-连接的核苷酸的研究的链测定的结果。图7Α提供了具有未修饰形式A的siRNA和具有修饰形式H_l、H、H+l、V_2、K和 0的siRNA的引导链与过客链的抑制活性的差异。将各修饰形式与未修饰形式进行比较 的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式H-1，0. 3594 ；形式H，0. 07422 ；形式H+1， 0. 5703 ；形式 V-2，0. 4258 ；形式 K，0. 2031 ；形式 0，0. 01953。图7Β提供了图7Α的siRNA的过客链与引导链之间的抑制活性的倍数变化。将 各修饰形式与未修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式H-1， 0. 3008 ；形式 H，0. 01953 ；形式 H+1，0. 2031 ；形式 V_2，0. 4961 ；形式 K，0. 1921 ；形式 0， 0.00909。图8提供了 8个内源靶的每一个的6个siRNA的抑制活性数据。48个siRNA 中的每一个具有指定的修饰形式，所述修饰形式掺入了实施例4中描述的二环修饰的核 苷酸。将各修饰形式与未修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式 E，O. 000000008657 ；形式 F，0. 4631 ；形式 G，0.000009698 ；形式 H，0.5569 ；形式 J， 0. 00000000191 ；形式 K, 0. 00001336 ；形式 M, 0. 7269 ；形式 0，0. 0593。图9A至图9C提供了通过微阵列分析确定的和实施例5描述的未修饰的siRNA、 2' -0-甲基-siRNA或二环修饰的siRNA之间的2倍差异表达的基因的交集的维恩图。对 于各图，左下组(如果有颜色的话为红色)表示在未修饰的siRNA处理的样品中变化2倍 或更大倍数的基因，上方组(如果有颜色的话为蓝色)表示在2' -0-甲基形式H修饰的 siRNA处理的样品中变化2倍或更大倍数的基因，右下组(如果有颜色的话为绿色)表示在 二环修饰的核苷酸(LNA )形式H修饰的siRNA处理的样品中变化2倍或更大倍数的基因。 图IOA至图IOE提供关于LNA 修饰形式在细胞生物学研究中对中靶(on-target)和脱靶 表型的影响的数据。阴性对照(Neg)是混杂的(scrambled)非靶向性siRNA，对于所述混 杂的非靶向性siRNA，有丝分裂或细胞凋亡的定量被标准化为1.0的值。参见实施例6。图 IOA提供了由于具有LNA 修饰形式E、F、G、H、J、K、M和0的siRNA沉默一组基因靶而引 起的标准化的有丝分裂细胞的箱线图，所述基因靶的一个亚组的抑制预期增加有丝分裂， 所述基因靶的一个亚组的抑制预期对有丝分裂没有作用，以及所述基因靶的一个亚组的抑 制预期减少有丝分裂，如实施例6所描述的。将各修饰形式与未修饰siRNA形式进行比较 的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式E，0.805 ；形式F，0. 5483 ；形式G，0. 3215 ；形 式 H, 0. 004561 ；形式 J, 0. 000952 ；形式 K, 0. 01974 ；形式 M, 0. 1007 ；形式 0，0. 9438。图IOB如图IOA —样提供了基因的亚组的箱线图，所述基因亚组的抑制预期减少 有丝分裂。将各修饰形式与未修饰siRNA形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结 果如下形式 E，0. 3247 ；形式 F，0. 4683 ；形式 G，0. 1815 ；形式 H，0. 03423 ；形式 J，0. 01387 ； 形式 K, 0. 09874 ；形式 M, 0. 5509 ；形式 0，0. 6705。图IOC提供了由于具有LNA 修饰形式E、F、G、H、J、K、M和0的siRNA沉默一组 基因靶而引起的标准化的细胞凋亡片段的箱线图，所述基因靶的一个亚组的抑制预期增加 细胞凋亡，所述基因靶的一个亚组的抑制预期对细胞凋亡没有作用，如实施例6中所描述 的。将各修饰形式与未修饰siRNA形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下 形式 Ε，0· 2641 ；形式 F，0. 5366 ；形式 G，0. 0001888 ；形式 H，0. 0000102 ；形式 J，0. 00000263 ； 形式 K, 0. 000000553 ；形式 M, 0. 5366 ；形式 0，0. 05753。图IOD如图IOC —样提供了基因的亚组的箱线图，所述基因亚组的抑制预期增加 细胞凋亡，如实施例6中所描述的。将各修饰形式与未修饰siRNA形式进行比较的Wilcoxon 检验(成对的)的结果如下形式E，0. 2188 ；形式F，0. 4375 ；形式G，0. 3125 ；形式H， 0.2188 ；形式 J，0. 03125 ；形式 K，0. 03125 ；形式 M，1 ；形式 0，0.2188。图IOE如图IOC —样提供了基因的亚组的箱线图，所述基因亚组的抑制预期对细 胞凋亡没有作用，如实施例6中所描述的。然而，特别地选择已在经验上证实细胞凋亡脱靶 效应的siRNA来进行研究以确定这样的siRNA，当被修饰形式化时，是否消除或减少脱靶效 应。siRNA具有脱靶效应可通过未修饰形式A的箱线图(与Neg对照相比，其具有增加的中 值和更大的数据分布)来证明。将各修饰形式与未修饰siRNA形式进行比较的Wilcoxon 检验(成对的)的结果如下形式E，0. 5303 ；形式F，0. 804 ；形式G，0. 00005488 ；形式H， 0. 00001347 ；形式 J，0. 0001253 ；形式 Κ，0· 00003023 ；形式 Μ，0. 441 ；形式 0,0. 1551。图IlA至图IlF提供了关于2' _0_甲基化修饰形式在细胞生物学研究中对中靶和脱靶表型的影响的数据。阴性对照(Neg)是混杂的非靶向性siRNA，对于所述混杂的非靶 向性siRNA，有丝分裂或细胞凋亡的定量被标准化为1. O的值。参见实施例6。图IlA提供了由于具有未修饰形式A和具有2' _0_甲基修饰形式H和K的siRNA 沉默一组基因靶而引起的标准化的有丝分裂细胞的箱线图，所述基因靶的一个亚组的抑制 预期增加有丝分裂，所述基因靶的一个亚组的抑制预期对有丝分裂没有作用，如实施例6 所描述的。将各修饰形式与未修饰siRNA形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结 果如下形式Η，0· 3529 ；形式Κ，0· 3289。图IlB如图IlA —样提供了基因的亚组的箱线图，所述基因亚组的抑制预期增加 有丝分裂。将各修饰形式与未修饰siRNA形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结 果如下形式Η，0. 3125 ；形式Κ，0. 5469。图IlC如图IlA —样提供了基因的亚组的箱线图，所述基因亚组的抑制预期对有 丝分裂没有作用。然而，特别地选择已在经验上证实有丝分裂脱靶效应的siRNA来进行研 究以确定这样的siRNA，当被修饰形式化时，是否消除或减少脱靶效应。siRNA具有脱靶效 可应通过未修饰形式A的箱线图(与Neg对照相比，其具有更大的数据分布)来证明。将 各修饰形式与未修饰siRNA形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式H， 0. 9102 ；形式 Κ，0· 4961.图IlD提供了由于具有2' -0-甲基修饰形式H和K的siRNA沉默一组基因靶 而引起的标准化的细胞凋亡片段的箱线图，所述基因靶的一个亚组的抑制预期增加细胞凋 亡，所述基因靶的一个亚组预期对细胞凋亡没有作用，如实施例6所描述的。将各修饰形式 与未修饰siRNA形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式H，0.3529 ；形 式 Κ，0· 3529。图IlE如图IlD —样提供了基因的亚组的箱线图，所述基因亚组的抑制预期增加 细胞凋亡，如实施例6中所描述的。将各修饰形式与未修饰siRNA形式进行比较的Wilcoxon 检验(成对的)的结果如下形式H，0.3125 ；形式K，0.5469。图IlF如图IlD —样提供了基因的亚组的箱线图，所述基因亚组的抑制预期对细 胞凋亡没有作用，如实施例6所描述的。然而，特别地选择已在经验上证实细胞凋亡脱靶 效应的siRNA来进行研究以确定这样的siRNA，当被修饰形式化时，是否消除或减少脱靶效 应。将各修饰形式与未修饰siRNA形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下 形式 Η，0. 9102 ；形式 Κ，0. 7344。图12Α-1提供了计算为P-G的过客链与引导链之间的活性的差异，其中如图4Β和 图4C 一样针对未修饰形式A和针对测试形式H、H+l、H-l、Η-2、V、V_l、V_2、K和Q (其中修 饰是LNA 残基)定义P和G。将各修饰形式与未修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成 对的)的结果如下形式H，0.04199 ；形式Η+1，0. 123 ；形式Η_1，0. 1748 ；形式Η_2，0. 2402 ； 形式 V，0. 06738 ；形式 V-1，0. 05371 ；形式 V_2，0. 5771 ；形式 K，0. 4648 ；形式 Q，0. 1016。图12A-2提供了图12A-1的siRNA的过客链 和引导链之间的活性的倍数变化。 将各修饰形式与未修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式H， 0. 3652 ；形式 H+1,0. 2783 ；形式 Η_1，0· 2402 ；形式 Η_2，0· 4131 ；形式 V,0. 2061 ；形式 V-I, 0. 1016 ；形式 V-2,0. 7002 ；形式 K, 0. 6377 ；形式 Q, 0. 7002。图12B提供了具有未修饰形式A的siRNA和具有LNA 修饰形式H、H_2、H_l、H+l、Q、K、V、V-I和V-2的siRNA对内源靶的抑制活性的数据，如实施例6中所描述的。 将各修饰形式与未修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式H， 0. 029598160 ；形式 Η_2，0· 004296849 ；形式 Η_1，0· 000833165 ；形式 Η+1,0. 052779900 ；形 式 Q，0. 011454170 ；形式 Κ，0· 745852000 ；形式 V，0. 005660834 ；形式 V-1,0. 998100800 ；形 式 V-2,0. 374661100。图12(提供了由于具有未修饰形式々和具有1^人 修饰形式11、!1+1、！1-1、!1-2、 K、Q、V、V-I和V-2的SiRNA沉默一组基因靶而引起的标准化的有丝分裂细胞的箱线图，所 述基因靶的抑制预期增加有丝分裂，如实施例6所描述的。阴性对照(Neg)是混杂的非靶 向性siRNA，对于所述混杂的非靶向性siRNA，有丝分裂的定量被标准化为1. 0的值。将各 修饰形式与未修饰siRNA形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式H， 0. 01563 ；形式 Η+1,0. 1953 ；形式 Η_1，0· 07813 ；形式 Η_2，0· 07813 ；形式 V,0. 05469 ；形式 V-1,0. 1953 ；形式 V-2，l ；形式 K，0. 1953 ；形式 Q，0. 1953。图120提供了由于具有未修饰形式々和具有1^人<^修饰形式11、!1+1、!1-1、!1-2、1(、 Q、V、V-I和V-2的siRNA沉默一组基因靶而引起的标准化的细胞凋亡片段的箱线图，所述 基因靶的抑制预期对细胞凋亡没有作用。阴性对照(Neg)是混杂的非靶向性siRNA，对于所 述混杂的非靶向性siRNA，细胞凋亡的定量被标准化为1. 0的值。然而，特别地选择已在经 验上证实细胞凋亡脱靶效应的siRNA来进行研究以确定这样的siRNA，当被修饰形式化时， 是否消除或减少脱靶效应。siRNA具有脱靶效应可通过未修饰形式A的箱线图(与Neg对 照相比，其具有增加的中值和更大的数据分布)来证明。比较未修饰形式A对照与各个修 饰形式的Wilcoxon检验(成对的)的统计学显著性的计算结果(针对标准化的细胞凋亡 片段计算为对照的百分比)是形式Η，0· 04199 ；形式H+l，0. 2061 ；形式Η_1，0. 2783 ；形式 Η-2,0. 6377 ；形式 V，0. 05371 ；形式 V_1，0. 4648 ；形式 V_2，0. 006836 ；形式K，0. 01855 ；形式 Q，0. 024。图13A-1提供了计算为P-G的过客链与引导链之间的活性的差异，其中如图4B和图4C 一样针对具有未修饰形式A和修饰形式H、H+1、H-1、V-2、K和0 (其中修饰是2 ‘ -0-甲 基修饰核苷酸)的siRNA定义P和G。将各修饰形式与未修饰形式进行比较的Wilcoxon检 验(成对的)的结果如下形式Η，0. 00001574 ；形式Η+1，0. 001091 ；形式Η_1，0. 001918 ；形 式 V-2，0. 0002131 ；形式 Κ，0. 0003619 ；形式 0，0. 406。图13Α-2提供了图13Α-1的siRNA的过客链与引导链之间的活性的倍数变 化。将各修饰形式与未修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形 式 Η，0· 00001574 ；形式 Η+1，0. 007443 ；形式 Η_1，0. 02514 ；形式 V-2,0. 0001464 ；形式 K, 0. 0003619 ；形式 0,0. 5446。图13B提供了具有未修饰形式A和修饰形式H、H+l、H_l、K、V-2和0(其中修饰 是2' -0-甲基修饰的核苷酸)的siRNA对内源靶的抑制活性的数据。将各修饰形式与未 修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式H，3.47E-06 ；形式H+1， 0. 001957517 ；形式 H_l，8. 79E-09 ；形式 K，0. 005446013 ；形式 V-2，1. 95Ε-09 ；和形式 0， 0.9972392。图13C提供了由于具有未修饰形式A和具有修饰形式H、H-l、K和V(具有 2' -0-甲基修饰核苷酸)的siRNA沉默一组基因靶而产生的标准化的有丝分裂细胞的箱线图，所述基因靶的抑制预期增加有丝分裂，如实施例6所描述的。将各修饰形式与未修饰 形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式H，0. 1953 ；形式H-1，0.6406 ； 形式 V，0. 1953 ；形式 K, 0. 6406。图13D提供由于具有未修饰形式A和具有修饰形式H、H_1、V和K (具有2 ‘ _0_甲 基修饰核苷酸)的siRNA沉默一组基因靶而产生的标准化的细胞凋亡片段的箱线图，所述 基因靶的抑制预期对细胞凋亡没有作用，如实施例6中所描述的。然而，特别地选择已在经 验上证实细胞凋亡脱靶效应的siRNA来进行研究以确定这样的siRNA，当被修饰形式化时， 是否消除或减少脱靶效应。siRNA具有脱靶效应可通过未修饰形式A的箱线图(与Neg对照 相比，其具有更大的数据分布)来证明。将未修饰形式A与各修饰形式进行比较的Wi 1 coxon 检验(成对的)的结果是形式H，0.9102 ；形式H-1，0. 25 ；形式V，0.6523 ；形式K，0. 7344。图14Α提供了具有未修饰形式A和具有LNΑ 修饰形式H、Μ、W、W+l、W-1、Y、Υ+1 和Y-I的SiRNA对内源靶的mRNA抑制活性的箱线图。将未修饰形式A与各修饰形式进行 比较的Wilcoxon检验(成对的)的统计学显著性的计算结果是形式H，0. 005302 ；形式Μ， 0. 02475 ；形式 W，1 ；形式 W+1，0. 8423 ；形式 W_1，0. 5096 ；形式 Y，0. 932 ；形式 Υ+1，0. 887 ；形 式 Υ-Ι,ο. 5891。图14Β提供了具有未修饰形式A和具有LNA 修饰形式H、M、JBU JB2、JB3、JB4 和JB5的siRNA对内源靶的mRNA抑制活性的箱线图。将未修饰形式A与各修饰形式进行 比较的Wilcoxon检验(成对的)的统计学显著性的计算结果是形式Η，0. 005302 ；形式Μ， 0. 02475 ；形式 JBl,0. 009613 ；形式 JB2，0. 7259 ；形式 JB 3,0. 4213 ；形式 JB4，0. 04904 ；形 式 JB5，0. 972。图15A至图15D提供了关于具有未修饰形式A和具有LNA 修饰形式H、M、W、W+1、 W-1、Y、Y+1和Y-I的SiRNA在细胞生物学研究中对中靶和脱靶表型的影响的数据。参见实 施例6。图15A提供了实施例6中描述的关于一组基因靶的标准化的有丝分裂细胞的箱线 图，所述基因靶的抑制预期减少有丝分裂，如实施例6中所描述的。阴性对照(Neg)是混 杂的非靶向性siRNA，对于所述混杂的非靶向性siRNA，有丝分裂的定量被标准化为1. 0的 值。将各修饰形式与未修饰siRNA形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下 形式 Η，0· 4961 ；形式 M，1 ；形式 W，0. 01953 ；形式 W+1，0. 5703 ；形式 W_1，0. 07422 ；形式 Y， 0. 03906 ；形式 Y+1，0. 4961 ；形式 Υ_1，0. 09766。图15Β如图15Α —样提供了一组基因靶的箱线图，所述基因靶的抑制预期不影响 有丝分裂。然而，特别地选择已在经验上证实有丝分裂脱靶效应的siRNA来进行研究以确 定这样的siRNA，当被修饰形式化时，是否消除或减少脱靶效应。siRNA具有脱靶效应可通 过未修饰形式A的箱线图(与Neg对照相比，其具有大约0.7的中值)来证明。将未修饰 形式A对照与各修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的统计学显著性的计算结 果是形式 H，0. 5 ；形式 M，0. 75 ；形式 W，0. 25 ；形式 W+1，0. 25 ；形式 W_1，0. 25 ；形式 Y，0. 25 ； 形式 Υ+1，0. 25 ；形式 Y-l，l。图15C提供了关于一组基因靶的标准化的细胞凋亡片段的箱线图，所述基因靶的 抑制预期增加细胞凋亡，如实施例6中所描述的。将各修饰形式与未修饰siRNA形式进行 比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式H，0.75 ；形式Μ，0.25 ；形式W，0.25 ；形式 w-l,l ；形式 W+1，0. 25 ；形式 Y，0. 25 ；形式 Υ_1，0. 25 ；形式 Υ+1，0. 25。图15D如图15C —样提供了基因靶的亚组的箱线图，所述基因靶亚组的抑制预期 对细胞凋亡没有作用。然而，特别地选择已在经验上证实细胞凋亡脱靶效应的siRNA来进 行研究以确定这样的siRNA，当被修饰形式化时，是否消除或减少脱靶效应。siRNA具有脱 靶效应可通过未修饰形式A的箱线图(与Neg对照相比，其具有大于3. 5的中值和更大的 数据分布)来证明。将各修饰形式与未修饰siRNA形式进行比较的Wilcoxon检验(成对 的)的结果如下形式H，0. 01221 ；形式M，0. 8501 ；形式W，0. 07715 ；形式W+1，0. 06396 ；形 式 W-1，0. 1763 ；形式 Y，0. 03418 ；形式 Υ+1，0. 021 ；形式 Υ_1，0. 2036。图16Α至图16D提供了关于具有未修饰形式A和具有LNA 修饰形式H、M、JBl、 JB2、JB 3、JB4和JB5的siRNA在细胞生物学研究中对中靶和脱靶表型的影响的数据。参 见实施例6。图16A提供了关于一组基因靶的标准化的有丝分裂细胞的箱线图，所述基因靶的 抑制预期减少有丝分裂。将各修饰形式与未修饰siRNA形式进行比较的Wilcoxon检验(成 对的)的结果如下形式H，0.4961 ；形式M，1 ；形式JB 1，0.3594 ；形式JB2，0. 6523 ；形式 JB3，0. 02734 ；形式 JB4，0. 1641 ；形式 JB5，0. 2031。图16B如图16A —样提供了一组基因靶的箱线图，所述基因靶的抑制预期不影响 有丝分裂。然而，特别地选择已在经验上证实有丝分裂脱靶效应的siRNA来进行研究以确 定这样的siRNA，当被修饰形式化时，是否消除或减少脱靶效应。siRNA具有脱靶效应可通 过未修饰形式A的箱线图(与Neg对照相比，其具有大约0. 65的中值，从而展示有丝分裂 的减少)来证明。将未修饰形式A对照与各修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的) 的结果如下形式H，0. 5 ；形式M，0. 75 ；形式JB1，0. 25 ；形式JB2，0. 25 ；形式JB 3,0. 75 ；形 式 JB4，0. 25 ；形式 JB5，0. 25。图16C提供了由于沉默一组基因靶而引起的标准化的细胞凋亡片段的箱线图，所 述基因靶的抑制预期增加细胞凋亡，如实施例6中所描述的。将各修饰形式与未修饰siRNA 形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的结果如下形式H，0.75 ；形式M，0.25 ；形式 JBl, 0. 25 ；形式 JB2，0.25 ；形式 JB 3，0.25 ；形式 JB4，0. 5 ；形式 JB5，0.75。图16D如图16C —样提供了一组基因靶的箱线图，所述基因靶的抑制预期对细胞 凋亡没有作用。然而，特别地选择已在经验上证实细胞凋亡脱靶效应的siRNA来进行研究 以确定这样的siRNA，当被修饰形式化时，是否消除或减少脱靶效应。siRNA具有脱靶效应 可通过未修饰形式A的箱线图(与Neg对照处理的样品相比，其具有增加的大于3的中值 和更大的数据分布)来证明。将各修饰形式与未修饰siRNA形式进行比较的Wilcoxon检 验(成对的)的结果如下形式H，0. 01221 ；形式M，0. 8501 ；形式JB1，0. 0009766 ；形式JB2， 0. 0004883 ；形式 JB 3,0. 0004883 ；形式 JB4，0. 003418 ；形式 JB5，0. 003418。图17提供了作为未修饰siRNA在37°C下于90%血清中的时间的函数的血清稳定 性的测定。显示了在0、5、10、15、30、60、120分钟的温育时8个不同siRNA的剩余全长siRNA 双链体的百分比。图18A提供了当在实施例7中描述的条件下用90%的 血清处理时，保持全长的 siRNA的百分比的箱线图。提供了关于未修饰形式AsiRNA、siRNA修饰形式F(该形式被 Elmen 等人(Nucleic AcidsResearch 33 1，439-447，2005)引述为 siLNA5 并且在本文中用作稳定性的参照对照)和具有修饰形式H、DH21、DH20、DH3、DH30、DH35、DH6、DH34和DH2的siRNA(其中修饰是LNA 残基)的数据。将形式F与各修饰形式进行比较的Wilcoxon检 验(成对的)的结果是形式H，0. 007813 ；形式DH21，0. 007813 ；形式DH20，0. 007813 ；形式 DH3，0. 007813 ；形式 DH30，0. 007813 ；形式 DH35，0. 01563 ；形式 DH6，0. 007813 ；形式 DH34， 0. 02488 ；形式 DH2，0. 2049。图 18B 提供了相对于 Neg 对照 siRNA，由以形式 A、F、H、DH21、DH20、DH3、DH30、 DH35、DH6、DH34、DH2 (如实施例7中所描述的)存在的LNA 修饰的siRNA产生的mRNA抑 制的分数的箱线图。将未修饰形式A对照与各修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对 的)的统计学显著性的计算结果是形式F，0. 05469 ；形式H，0. 3828 ；形式DH21，0. 007813 ； 形式 DH20，0. 007813 ；形式 DH 3,0. 007813 ；形式 DH30，0. 007813 ；形式 DH 35，0.01563 ；形 式 DH6，0. 007813 ；形式 DH34，0. 03906 ；形式 DH2，0. 6406。图19A提供了当在实施例7中描述的条件下用90%的血清处理时，保持全长的 siRNA的百分比的箱线图。提供了关于修饰形式F、DH2、DH19、DH4、DH31、DH27和DH25的数 据，其中修饰是LNA 残基。将形式F与各修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的) 的统计学显著性的计算结果是形式DH2，0. 2049 ；形式DH 19，0. 1953 ；形式DH4，0. 02249 ； 形式 DH31，0. 01563 ；形式 DH27，0. 1094 ；形式 DH25，0. 1094。图 19B 提供了相对于 Neg 对照 siRNA，由以形式 F、DH2、DH19、DH4、DH31、DH27 禾口 DH25(如由实施例7所描述的)存在的LNA 修饰的siRNA产生的mRNA抑制的分数的箱 线图。将未修饰形式A对照与各修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的统计学 显著性的计算结果是形式F，0. 05469 ；形式DH2，0. 6406 ；形式DH19，0. 01563 ；形式DH4， 0. 007813 ；形式 DH31,0. 01563 ；形式 DH27，0. 01563 ；形式 DH25，0. 007813。图20A提供了当在实施例7描述的条件下用血清处理时，保持全长的siRNA的百 分比的箱线图。提供了关于修饰形式F、DH2、DH47、DH29、DH28和DH18的数据，其中修饰 是LNA 残基。将形式F与各修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的统计学显 著性的计算结果是形式DH2，0. 2049 ；形式DH47，0. 03906 ；形式DH29，0. 07813 ；形式DH28， 0. 01415 ；形式 DH18，0. 06836。图 20B提供了相对于Neg对照 siRNA，由以形式F、DH2、DH47、DH29、DH28和 DH18(如 实施例7所描述的)存在的LNA 修饰的siRNA产生的mRNA抑制的分数的箱线图。将未修 饰形式A对照与各修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的统计学显著性的计算 结果是:F,0. 05469 ；形式 DH2，0. 6406 ；形式 DH47，0. 3125 ；形式 DH29，0. 02249 ；形式 DH28, 0. 01563 ；形式 DH18，0. 01563。)图21A提供了当在实施例7中描述的条件下用血清处理时，保持全长的siRNA的 百分比的箱线图。提供了关于修饰形式F、DH 36、DH2、DH9、DH46、DH 33和DHlO的数据，其 中所述修饰是LNA 残基。将形式F与各修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的) 的统计学显著性的计算结果是形式DH36，0. 1609 ；形式DH2，0. 2049 ；形式DH9，0. 5534 ；形 式 DH46，0. 02071 ；形式 DH33，0. 1508 ；形式 DH10，0. 05469。图 21B 提供了相对于 Neg 对照 siRNA，由以形式 F、DH 36、DH2、DH9、DH46、DH33 和 DHlO (如实施例7所描述的)存在的LNA 修饰的SiRNA产生的mRNA抑制的分数的箱线图。 将未修饰形式A对照与各修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的统计学显著性的计算结果是形式 F, 0. 05469 ；形式 DH 36，0. 01563 ；形式 DH2，0. 6406 ；形式 DH9，0. 1484 ； 形式 DH46，0. 1484 ；形式 DH 33,0. 007813 ；形式 DH10，0. 007813。
图22A提供了当在实施例7中描述的条件下用血清处理时，保持全长的siRNA的 百分比的箱线图。提供了关于修饰形式F、DH2、DH7、DH23、DH1、DH48、DH49、DH44和DH45的 数据，其中修饰是LNA 残基。将形式F与各修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的) 的统计学显著性的计算结果是形式DH2，0. 2049 ；形式DH7，0. 3828 ；形式DH23，0. 03461 ； 形式 DHl,0. 1484 ；形式 DH48，0. 6406 ；形式 DH49，0. 1410 ；形式 DH44，0. 3125 ；形式 DH45, 0.1052。图 22B 提供了相对于 Neg 对照 siRNA，由以形式 F、DH2、DH7、DH23、DHU DH48、 DH49、DH44和DH45 (如实施例7所描述的)存在的LNA 修饰的siRNA产生的mRNA抑制 的分数的箱线图。将未修饰形式A与各修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)的 统计学显著性的计算结果是形式F，0. 05469 ；形式DH2，0. 6406 ；形式DH7，0. 05469 ；形式 DH23，0. 007813 ；形式 DHl，0. 007813 ；形式 DH48，0. 1953 ；形式 DH49，0. 4609 ；形式 DH44， 0. 007813 ；形式 DH45，0. 01563。图23A提供了当在实施例7中描述的条件下用血清处理时，保持全长的siRNA的 百分比的箱线图。提供了关于修饰形式F、DH2、DH38、DH1、DH39、DH40、DH41、DH42和DH43 的数据，其中修饰是LNA 残基。将形式F与各修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成 对的)的统计学显著性的计算结果是形式DH2，0.2049 ；形式DH 38，0. 04206 ；形式DH1， 0. 1484 ；形式DH 39,0. 07813 ；形式DH40，0. 2500 ；形式DH41，0. 2620 ；形式DH42，0. 1094 ；形 式 DH43，0. 3621。图 23B 提供了相对于 Neg 对照 siRNA，由以形式 F、DH2、DH38、DHU DH 39、DH40、 DH41、DH42和DH43 (如实施例7所描述的)存在的LNA 修饰的siRNA产生的mRNA抑制 的分数的箱线图。将未修饰形式A与各修饰形式进行比较的Wilcoxon检验(成对的)统 计学显著性的计算结果是形式F，0. 05469 ；形式DH2，0. 6406 ；形式DH38，0. 007813 ；形式 DHl, 0. 007813 ；形式 DH39，0. 007813 ；形式 DH40，0. 01563 ；形式 DH41，0. 007813 ；形式 DH42， 0. 007813 ；形式 DH43，0. 02344。图24提供了体内存在的稳定的siRNA的定量。比较存在于加料的对照动物 (spiked control animal)的肝中的siRNA的量与存在于注射了未修饰形式A siRNA和具 有形式DHl或形式DH47的LNA⑩修饰形式化的稳定的siRNA的测试动物的肝中的siRNA 的量。CT是循环阈值。各种实施方案的描述应理解，上述一般描述和下列详细描述只是示例性和说明性的，无意限定本教导 的范围。在本申请中，除非明确地指出，否则使用的单数包括复数。例如“至少一个”意指 可存在一个以上。同样，使用的“包含”、“含有”和“包括”，或此类根词的变体例如但不限于 “包含(comprises)”、“含有(contained) ”和“包括(including) ”无意是限定性的，其是指
“包括下列元素但不排除其他元素”。术语“基本上由......组成”或“基本上由......组
成的”，如本文中所使用的，不包括对组合具有任何实质意义的其他元素。除非另外指出，否 则使用的“或”是指“和/或”。术语“和/或”是指其之前和之后的项可合在一起或分开。 为了举例说明的目的，而非作为限制，“X和/或Y”可表示“X”或“Y”或“X和Y”。
当本文中提供值的范围时，除非另外明确地指出，否则范围包括起始值和终值以 及其间的任何值或值的范围。例如，“0. 2至0. 5”是指0. 2,0. 3,0. 4,0. 5 ；其间的范围例如 0. 2 至 0. 3、0· 3 至 0. 4、0· 2 至 0. 4 ；其间的增量(increment)例如 0. 25,0. 35,0. 225,0. 335、 0. 49 ；其间的增量范围例如0. 26至0. 39等。本申请中引用的所有文献和相似材料包括但不限于专利、专利申请、论文、书、专题论文(treatise)和国际互联网网页，无论此类文献和相似材料的形式，明确地以其全文 通过引用合并入本文用于任何目的。在一个或多个合并的文献和相似材料以与本申请中的 术语的定义矛盾的方式定义或使用该术语时，以本申请的定义为准。当结合不同实施方案 描述本教导时，本教导不意欲限定于此类实施方案。相反，本教导包括各种改变、修饰和等 价物，如本领域技术人员所理解的。术语“或其组合”，如本文中所使用的，是指该术语前面所列项的所有排列和组合。 例如“A、B、C或其组合”意欲包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一个，并且如果顺序在 特定背景中是重要的话，还包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。对于该示例，明确包 括的是含有一个或多个项目或项的重复的组合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA, CABABB等。本领域技术人员将理解，除非根据上下文明显地表现出来，否则通常对任何组合 中的项目或项的数目没有限制。术语“替代物”，如本文中所使用的，意指表示另一种产物的 存在的产物。例如，扩增产物是已被扩增的核酸的替代物。如本文中所使用的，siRNA的“修饰形式(modification format) ”是指修饰的核 苷酸和“除了修饰的之外的(other-than modified) ”核苷酸的模式，如由图IA至图IK所 示的模式或形式举例说明的。下面描述修饰的核苷酸。“除了修饰的之外的”是指未修饰的 核苷酸或具有除了特定形式中的修饰核苷酸的修饰之外的修饰的修饰核苷酸。如本文中所使用的，“不依赖于序列的修饰”是指实施方案提供的修饰核苷酸和修 饰形式可用于任何SiRNA序列而不考虑该SiRNA的具体序列。“中靶(on-target)，，事件，如本文中所使用的，是指靶基因的mRNA受经设计靶向 该基因的siRNA影响(即，抑制)，如通过减少的表达、降低的mRNA水平或特定表型的丧失 或获得所证明的。例如，“中靶”事件可通过另一种方法例如使用已知影响该靶的药物，或例 如通过引入来自直向同源物的靶mRNA拯救丧失的表型来验证。“脱靶事件”，如本文中所使用的，意指RNA干扰中除了期望的事件外的任何事件。 脱靶事件的实例是不被靶向的基因的mRNA受siRNA影响(S卩，抑制)。这样的“脱靶事件” 不能通过提供来自适当的相关直向同源物的靶mRNA来拯救。“脱靶事件”可归因于以改变 非靶的表达的方式与另一种mRNA、内源RNA、DNA或蛋白质的相互作用。这样的脱靶事件可 归因于例如整合入RI SC的核苷酸序列与非靶mRNA之间的错配碱基配对或细胞环境中的 非特异性相互作用。不恰当的RISC结合、不恰当的RISC介导的相互作用和不恰当的RISC 介导的切割可促成脱靶事件。脱靶事件还可归因于细胞毒性应答、干扰素应答、microRNA作 用或与非编码RNA的相互作用。最常见的脱靶事件可能是不期望的过客(有义)链至RISC 复合物内的整合。然而，受siRNA影响的脱靶事件并非完全可预测的并且倾向于是非特异 性的。脱靶事件产生脱靶效应，所述术语在本文中可互换使用。术语“效力”，如本文中所使用的，是将其靶mRNA抑制至起始mRNA水平的50 %所 需的单个siRNA或siRNA的混合物的浓度的量度。通常，用IC50 (半最大(50% )mRNA抑制所需的siRNA的浓度)来描述效力。在本文中通过转染一系列siRNA浓度(例如，在IOOnM 至IOpm范围中的至少6个浓度)，然后对样品进行qRT-PCR分析来测定效力。将结果作图， 通过外推获得50%的mRNA抑制时的浓度来测定IC50。使用曲线拟合程序来测定获得50% 的mRNA靶的抑制所需的siRNA的浓度。如本文中所使用的，术语“效力”可与术语“抑制活 性”(其是与暴露于阴性对照siRNA后存在的mRNA的量相比，暴露于测试siRNA后mRNA的 减少的量的量度)互换使用。术语“功效”，如本文中所使用的，是产生最小阈值的mRNA抑制的siRNA的百分比。 术语功效通常用于siRNA的集合或用于siRNA设计算法的预测力。通过qRT-PCR或靶mRNA 的siRNA抑制的基于载体的测量来测量功效，其结果表示为产生最小阈值的抑制的siRNA 的百分比，例如，产生70%或更高水平的抑制的siRNA的百分比。术语“特异性”，如本文中所使用的，是siRNA在mRNA水平或蛋白质水平上影响基 因调控的精确性的量度，或由于靶基因功能的抑制而展示的真实表型。通过测定作为siRNA 转染的结果相对于某个阈值发生变化的基因的数目来测量特异性，所述基因不是期望的靶 并且已知不处于靶基因的信号转导途径中。工业标准阈值是2倍变化。在细胞生物学研究 中，针对特定靶的高特异性siRNA导致具有极少或没有预料之外的表型的重叠表型。特异 性较差的siRNA导致由于脱靶效应而引起的表型。“提高的”效力是指在相同的浓度下与另一种siRNA相比具有更低的IC50或更 高的百分比抑制的siRNA，“提高的”特异性是指与另一种siRNA相比影响更少的基因的 siRNA，“提高的”功效是指使用算法产生的一组siRNA，其中与使用不同算法产生的另一 siRNA组相比，该siRNA组中更大百分比的siRNA产生最小指定量的抑制。为了进行本文中的研究，将测试结果与对照结果相比，并且将所有结果针对设计 为非靶向性的无义siRNA进行标准化。用于成对样品的Wilc0x0n检验是成对样品t检验 的非参数等价检验。Wilc0x0n检验排列样品1和样品2中的成对数据之间的差的绝对值并 且计算关于正差和负差(差计算为样品2-样品1)的数目的统计值。所使用的软件是可免 费从 cran. org 获得的"R Package，，。术语“核苷酸”通常指以单体形式存在的或存在于二核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸 中的核苷的磷酸酯。核苷通常是与核糖(核糖核苷)或脱氧核糖(脱氧核糖核苷)的C-I' 碳连接的嘌呤碱基或嘧啶碱基。天然发生的嘌呤碱基通常包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)。 天然发生的嘧啶碱基通常包括胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T)。当核苷碱基是嘌呤 时，核糖或脱氧核糖在嘌呤的9位上连接至核碱基(nucleobase)，当核碱基是嘧啶时，核糖 或脱氧核糖在嘧啶的1位上连接至核碱基。核糖核苷酸是核糖核苷的磷酸酯，脱氧核糖核 苷酸是脱氧核糖核苷的磷酸酯。术语“核苷酸”是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的统称。二 核苷酸通常具有通过3' -5'磷酸二酯连接共价键合的两个核苷酸。寡核苷酸通常具有2 个以上的核苷酸，多核苷酸通常是指核苷酸单体的聚合物。本申请者为了方便起见在本文 中可互换地使用术语“核苷酸”和“核苷”，尽管本领域技术人员根据术语出现的上下文，易 于理解可使用哪个术语。核苷酸单体通过“核苷间或核苷酸间的连接”例如 磷酸二酯连接(phosphodiester linkage)连接，其中，如本文中所用的，术语“磷酸二酯连接”是指磷酸二酯键 (phosphodiester bond)或包含其磷酸盐/酯类似物(包括结合的抗衡离子例如H+、NH4\Na+，如果此类抗衡离子存在的话)的键。下文描述另外的核苷间或核苷酸间的连接。当寡 核苷酸由字母序列表示时，应理解，除非另外指出或根据上下文期望相反方向对于本领域 技术人员来说是显然的，否则核苷酸以5'至3'的顺序从左至右排列。合成寡核苷酸的方 法的描述尤其可见于美国专利 4，373，071,4, 401，796,4, 415，732,4, 458，066,4, 500，707、 4，668，777,4, 973，679,5, 047，524,5, 132，418,5, 153，319 和 5，262，530。寡核苷酸可以是 任何长度。“碱基配对”，如本文中所使用的，是指标准Watson-Crick碱基配对。常见于双链 (双链体)核酸中的碱基配对是G:C、A:T和A:U。此类碱基对称为互补碱基对，一个碱基与 其配对的碱基互补。当与互补核苷酸或核苷酸类似物配对时，下文中描述的核苷酸类似物 也能够形成氢键。如本文中所使用的，术语“互补”或“互补性，，不仅用于指碱基对而且还用于指通 过Watson-Crick碱基配对法则产生联系的寡核苷酸的反向平行链，能够按照标准互补法 则进行碱基配对的或能够在相对严格条件下与特定核酸区段杂交的核酸序列。例如，序列 5' -AGTTC-3'与序列5' -GAACT-3'互补。术语“完全互补”或“100%互补”等是指反向 平行链之间的碱基完全配对(多核苷酸双链体中无错配)的互补序列。核酸聚合物可以只 在它们的完整序列的一部分上互补。术语“部分互补性”、“部分互补”、“不完全互补性”或 “不完全互补”等是指低于100%完全配对(例如在多核苷酸双链体中存在至少一个错配) 的反向平行多核苷酸链之间的碱基的任何比对。此外，两个序列，如果在它们的比对中存在 一个或多个错配、缺口或插入，那么它们被认为在它们的长度的一部分上是互补的。此外，靶多核苷酸的“互补物”是指可在反向平行缔合中与靶多核苷酸的至少一部 分结合的多核苷酸。反向平行缔合可以是分子内的，例如以核酸分子内的发夹环的形式存 在，或分子间的，例如当两个或多个单链核酸分子彼此杂交时。术语“相应于”，当指核酸时， 意指特定序列足以与反向平行序列互补，这样两个序列在适当的条件下将退火并且形成双 链体。如本文中所使用的，“过客(有义)”链、区域或寡核苷酸是指具有与DNA的有义链 的至少一部分或mRNA的至少一部分的核苷酸序列相同的核苷酸序列的核苷酸序列。“过客 (有义)链”包括与另一个多核苷酸的互补引导(反义)区形成双链体的多核苷酸的有义 区域。发夹单链寡核苷酸(shRNA)还可在相同分子内包含过客(有义)区和引导(反义) 区，所述区域形成通过环序列或环连接体部分连接的双链体结构，如下面进一步描述的。发 夹可以为左手方向(即，5'-反义-环-有义-3')或右手方向(即，5'-有义-环-反 义-3')。如本文中所使用的，“siRNA”是指通过RNA干扰(RNAi)途径诱导基因沉默的短干 扰RNA双链体。短干扰RNA的长度可以变化，并且可在反义与有义区域之间以及反义区域 与靶mRNA序列之间包含至多一个或两个错配碱基对。各siRNA可包含15至30个碱基对， 或18至25个碱基对，或19至22个碱基对或21个碱基对或19个碱基对。在一些实施方案 中，siRNA在5'末端、3'末端或5'末端和3'末端上独立地具有1、2、3、4或5个未配对 的悬突核苷酸。在一些实施方案中，siRNA具有平末端。此外，术语“siRNA”包括两条分开 的链的双链体以及可形成发夹结构的单链(shRNA)。shRNA可具有例如4至30个或6至20 个或7至15个核苷酸的核苷酸环序列，或可包含非核苷酸部分例如烃连接区(hydrocarbon
22linking region)，或其组合。shRNA可包含错配或凸出(bulge)。在一些实施方案中，本教导包括修饰的核苷酸，其与非修饰的核苷酸相比具有增强的碱基配对的亲和力或赋予核苷酸序列(所述修饰的核苷酸是该核苷酸序列的一部分) 增强的亲和力。修饰的核苷酸，如本文中所涉及的，使RNA的构象平衡移向与RNA双链体的 A 型几何形状(A-form geometry) 一致的 nor thern (C3' -endo)构象。DNA:RNA 双链体也 可藉此来稳定。在一些实施方案中，通过构建具有二环核苷酸、三环核苷酸或2'-修饰的 核苷酸的过客(有义)寡核苷酸来获得增强的碱基配对的亲和力。在一些实施方案中，siRNA的修饰核苷酸独立地包括修饰的糖部分、修饰的碱基部 分、修饰的核苷间部分或任何这些修饰部分的组合。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括修饰的糖部分，包括但不限于，2'-卤代 (其中卤代是氯代、氟代、溴代或碘代)；阿拉伯糖构象中的阿糖基(arabino)或2'-氟代 (FANA) ；2' -H，-SH、_NH2、_CN、叠氮化合物；或-OR、-R、_SR、-NHR 或 _N(R)2，其中 R 是烷 基、烯基、炔基、烷氧基(alkoxy)、氧烷基(oxyalkyl)、烷氧基烷基、烷基胺，其中烷基部分 是 C1-C6。另外的2 ‘ 修饰包括2 ‘ -0-(CH2)4NH2 ； 2 ‘ -0-蒽醌基烷基 (anthraquinolylalkyl)，其中烧基包括甲基或乙基；2' _0_(CH2)2_0CH3、2‘ -0_(CH2CH20) n-CH3，其中 n 是 1-4 ;2‘ -0-CH2-CHR-X，其中 X = OH、F、CF3 或 0CH3 以及 R = H、CH3、CH20H 或CH20CH3Jt核酸单体或其衍生物(PNA) ;2'修饰，其中2'-位是烷氧基，例如，甲氧基、
乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基和苯氧基等。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括修饰的糖部分或假糖(pseudosugar)，包括 但不限于二环核苷酸结构(a)、三环核苷酸结构(b)或二环核苷酸结构(c) 其中R1和R2独立地是0、S、CH2或NR，其中R是氢或C"-烷基；R3是CH2、CH2_0、 CH2-S、CH2-CH2、CH2-CH2-CH2、CH = CH 或 CH2-NR，其中 R 是氢或 Ch-烷基；R4 和 R5 独立地 是核苷间的连接、末端基团或保护基团；R4和R5中至少一个是核苷间的连接；B是核碱基、 核碱基衍生物或核碱基类似物。在一些实施方案中，R4和R5独立地是H、0H、磷酸盐/酯、 -烷基胺、q
-12 -烯基、-12
-炔基、Q
-12
-环烷基、q —12_方焼基、方基、 酰基、 甲硅烷基、寡核苷酸、通过核苷间的连接键合的核苷、或其组合；以及R4和R5中至少一个 是寡核苷酸，或通过核苷间的连接键合的核苷。可利用取代基例如磷酸盐/酯、(V12-烷基、 (V12-烷基胺、(V12-烯基、Ci_12-炔基、Ci_12-环烷基、Ci_12-芳烷基、芳基、酰基或甲硅烷基进 一步衍生5'末端。在一些实施方案中，例如利用(12或(6取代基或利用磷酸盐/酯衍生 5'末端。
二环核苷酸包括上文中对于结构(a)和(C)所描述的二环核苷酸。结构(a)的二 环核苷酸也称为锁核酸(locked nucleic acid)或LNA ,包括例如β-D，和α-L 二环核 苷酸、二环核苷酸例如木糖-锁核酸(xylo-locked nucleic acid)(美国专利7，084，125)、 L-核糖-锁核酸(美国专利7，053，207)、1' -2'锁核酸(美国专利6，734，291和 6，639，059)以及3' -5'锁核酸(美国专利6，083，482)。结构(c)的二环核苷酸和含有此 类二环核苷酸的寡核苷酸的合成描述于例如Ma ier等人(Nucleic Acids Research 2004， 32 12，3642-3650)和Maderia等人(Nucleic Acids Research 2007，35 :6，1978-1991)中。 结构(b)的三环核苷酸和含有此类三环核苷酸的寡核苷酸的合成描述于例如Ittig等人 (Nucleic Acids Research 2004，32 :1，346-353)中。 在一些实施方案中，核苷酸包括修饰的核苷间连接体部分，包括但不限 于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯 (phosphorodiselenoate) > phosphoroaniIothioate> phosphorani 1 idate> 氛基憐酸酉旨 (phosphoramidate)、boronophosphate> thioformacetal (-S-CH2-O-CH2-)、亚甲基(甲基 亚氨基)、二甲基胼基、磷酰基连接的吗啉代、-CH2-CO-NH-CH2-, -CH2-NH-CO-CH2-和磷酸酯 的任何类似物，其中磷原子为+5价氧化状态，并且一个或多个氧原子用非氧部分例如硫取 代。肽核酸是其中主链包含合成的肽样连接(酰胺键)(通常从N-(2-氨基-乙基)-甘氨 酸单位形成，导致无手性和不带电荷的分子)的核酸类似物。示例性磷酸酯/盐类似物包 含结合的抗衡离子例如H+、NH4\ Na+(如果此类抗衡离子存在的话)。在一些实施方案中，核苷酸包括修饰的碱基部分，包括但不限于嘧啶核碱基和嘌 呤核碱基以及其衍生物和类似物，包括但不限于用烷基、羧基烷基、氨基、羟基、卤素(即， 氟、氯、溴或碘)、巯基或烷基巯基部分中的一个或多个取代的嘧啶和嘌呤。烷基(例如， 烷基、羧基烷基等)部分包含1至6个碳原子。本文中涉及的另外的修饰的核苷酸包括氧 杂环丁烷修饰的碱基(关于包含氧杂环丁烷修饰的碱基的论述，参见美国公开专利申请案 20040142946)。嘧啶、嘧啶衍生物和嘧啶类似物包括但不限于溴乙胺(bromothyminehl-甲基假 尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、2-硫嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三 唑吡啶、3-甲基胞嘧啶、3-(3_氨基-3-羧基-丙基)尿嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、4-硫代尿嘧 啶、N4, N4-乙烯基胞嘧啶(ethanocytosine)、4-(6-氨基己基胞嘧啶)、5_甲基胞嘧啶、 5_乙基胞嘧啶、5-(C3，C6)_炔基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧 基甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、 5_丙基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、硫代尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲基氨基甲 基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧 啶、尿嘧啶-5-羟乙酸-甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-碘-2'-脱 氧尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、基于三环咔唑的嘧啶类似物、基于三环吩噁嗪的嘧 啶类似物、异胞嘧啶(isocytosine)、假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、二氢尿嘧啶、假尿 嘧啶和通用核苷酸(universal nucleotide)。在一些实施方案中，嘌呤、嘌呤衍生物和嘌呤类似物包括但不限于氮杂嘌呤、氮 杂鸟嘌呤、氮杂腺嘌呤、脱氮嘌呤(deazapurine)、脱氮鸟嘌呤、脱氮腺嘌呤、1-甲基鸟嘌 呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基肌苷、2-氨基嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤、2，2_ 二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、6-硫代腺嘌呤、6-硫代嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、 N，N-二甲基腺嘌呤、N6-异戊烯基腺嘌呤、N6，N6-桥亚乙基-2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮 黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤，7-卤代-7-脱氮嘌呤，其中卤代是溴代、氟代、碘 代或氯代、7-丙炔-7-脱氮嘌呤，8-溴腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、 8_氨基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤，8-硫代鸟嘌呤，8-氧-N6-甲基腺嘌呤、 N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)_氨甲酰基)苏氨酸、甲硫基腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌 呤、肌苷、wybutoxosine、wybutosine、异鸟嘌呤、Q 核苷(queuosine)、β -D-甘露糖基 Q 核 苷、β -D-半乳糖基Q核苷和通用核苷酸。通用碱基可以与一种类型以上的特定碱基或任何特定碱基碱基配对。在其他实 施方案中，通用碱基不与任何碱基特异性形成氢键而通过疏水堆积与相同核酸链上的相邻 碱基相互作用。通用碱基包括但不限于吲哚例如7-氮杂吲哚、6-甲基-7-氮杂吲哚、丙炔 基-7-氮杂-吲哚、联烯基-7-氮杂吲哚、异喹诺酮(isocarbostyril)、丙炔基异喹诺酮、咪 唑并口比唆(imidizopyridine)禾口 pyrrollpyrizine。在一些实施方案中，修饰的核苷酸以特定模式(在本文中称为“形式”)存在于 siRNA中，如图IA至图IK所示的模式或形式所举例说明的。在一些实施方案中，化学合成 的过客(有义)寡核苷酸具有15至30个核苷酸的长度并且包含不依赖于序列的修饰形式 (1)、不依赖于序列的修饰形式(2)和不依赖于序列的修饰形式(3)中的一个(1)5' Np-m-m-Nx-m-m-Nq-nr3'，其中 ρ 为 0 或 1 ;x 为 7、8、9、10 或 11 ;r 为 0、1 或 2 ；以及q是表示过客链的长度减去(p+x+r+4)的整数；(2) 5 ‘ Np-m-m-Ny-m-Nz-m-Nq-nr 3'，其中 ρ为 0或 l;y 为 7、8或 9 并且 ζ 为 1 ；或 y为7并且ζ为2或3 为0、1或2 ；以及q是表示过客链的长度减去(p+y+z+r+4)的整 数；(3)5' m-Nfm-Nx-m-m-Nq-nJ'，其中 χ 为 8、9 或 10 ;r 为 0、1 或 2 ；以及 q 为表示 过客链的长度减去(x+r+5)的整数；其中各m独立地是二环核苷酸或三环核苷酸；各η独立地是脱氧核苷酸、修饰的核 苷酸或核糖核苷酸；且当m是二环核苷酸时，各N独立地是除了二环核苷酸外的核苷酸；以 及当m是三环核苷酸时，各N独立地是除了三环核苷酸外的核苷酸。在一些实施方案中，提供了化学合成的过客(有义)寡核苷酸，所述寡核苷酸基本 上由15至30个核苷酸的长度组成并且基本上由如下的不依赖于序列的修饰形式(1)、不依 赖于序列的修饰形式(2)和不依赖于序列的修饰形式(3)中的一个组成(1)5' Np-m-m-Nx-m-m-Nq-nr3'，其中 ρ 为 0 或 1 ;x 为 7、8、9、10 或 11 ;r 为 0、1 或 2 ；以及q是表示过客链的长度减去(p+x+r+4)的整数；(2) 5 ‘ Np-m-m-Ny-m-Nz-m-Nq-nr 3'，其中 ρ为 0或 l;y 为 7、8或 9 并且 ζ 为 1 ；或 y为7并且ζ为2或3 为0、1或2 ；以及q是表示过客链的长度减去(p+y+z+r+4)的整 数；(3)5' m-Nrm-N.-m-m-N,-!!^'，其中 χ 为 8、9 或 10 ;r 为 0、1 或 2 ；以及 q 为表示 过客链的长度减去(x+r+5)的整数；其中各m独立地是二环核苷酸或三环核苷酸；各η独立地是脱氧核苷酸、修饰的核苷酸或核糖核苷酸；当m是二环核苷酸时，各N独立地是除了二环核苷酸外的核苷酸；以及 当m是三环核苷酸时，各N独立地是除了三环核苷酸外的核苷酸。在一些实施方案中，引导(反义)寡核苷酸包含15至30个核苷酸，与至少12个 核苷酸的过客(有义)寡核苷酸连续互补的区域，并且与靶mRNA的至少一部分具有互补 性。在一些实施方案中，引导(反义)寡核苷酸包含与至少13个核苷酸至相应于寡核苷酸 的全长的数目的核苷酸的过客(有义)寡核苷酸连续互补的区域。在一些实施方案中，引 导(反义)寡核苷酸包含与过客(有义)寡核苷酸的全长(除了两个3'核苷酸以外)连 续互补的区域。在一些实施方案中，引导(反义)寡核苷酸与靶mRNA的至少一部分具有至少12个 连续核苷酸的互补性。在一些实施方案中，引导(反义)寡核苷酸与靶mRNA的至少一部分 具有至少13个核苷酸至相应于引导寡核苷酸的全长的数目的核苷酸的互补性。在一些实 施方案中，引导寡核苷酸与靶mRNA的一部分具有完全互补性(除了 2个3'核苷酸以外)。在一些实施方案中，提供了包含过客(有义)寡核苷酸和引导(反义)寡核苷酸 的短干扰RNA，所述过客(有义)寡核苷酸具有17至30个核苷酸的长度并且包含不依赖于 序列的修饰形式(4)、形式(5)和形式(6)中的一个，所述引导(反义)寡核苷酸具有17至 30个核苷酸，与至少12个核苷酸的过客(有义)寡核苷酸连续互补的区域；引导链还与靶 mRNA的至少一部分具有互补性(4)5' mp-Nx-m-m-Nq-nr 3'，其中当 p 为 0 时，x 为 12 ；当 p 为 1 时，x 为 11 ；当 p 为2时，x为10;当p为3时，x为9;当p为4时，x为8;r为0、1或2;以及q是表示过客 链的长度减去(p+x+r+2)的整数；(5)5' m-m-Nx-m-Nq-n;V，其中x为ll;r为0、1或2;以及q是表示过客链的长 度减去(x+r+3)的整数；(6)5' mp-Ny-m-Nz-m-Nq-nr3'，其中p为 3 ;y 为9并且z 为 1 ;r 为0、1 或2 ；以及 q为表示过客链的长度减去(p+y+z+r+2)的整数；其中各m独立地是二环核苷酸、三环核苷酸或2' _修饰的核苷酸；各n独立地是 脱氧核苷酸、修饰的核苷酸或核糖核苷酸，并且是悬突核苷酸；当m是二环核苷酸时，各N独 立地是除了二环核苷酸外的核苷酸，当m是三环核苷酸时，各N独立地是除了三环核苷酸外 的核苷酸，以及当m是2'-修饰的核苷酸时，各N独立地是除了 2'-修饰的核苷酸外的 核苷酸。在短干扰RNA的实施方案中，过客(有义)寡核苷酸具有不依赖于序列的修饰形 式(4)，p为2，x为10，r为2，各n是悬突核苷酸，并且各n独立地是修饰的核苷酸，引导 (反义)寡核苷酸包含2个3'悬突修饰的核苷酸；各修饰的核苷酸独立地是二环核苷酸、 三环核苷酸或2'修饰的核苷酸。在一个实施方案中，过客寡核苷酸的3'倒数第三个位点 和3'倒数第四个位点中的至少一个是修饰的核苷酸。3'倒数第三个位点是从最后一个位 点算起的第三个位点，即在倒数第二个位点之前的位点(例如，图1H的形式DH47)。3'倒 数第四个位点是从最后一个位点算起的第四个位点，即，倒数第三个位点之前的位点(例 如，图1H的形式DH29)。这样的siRNA例如在血清存在的情况下对于核酸酶是特别稳定的。在短干扰RNA的一些实施方案中，当长度为17个核苷酸时，引导寡核苷酸的位点2 和3中的至少一个是修饰的核苷酸；当长度为18个核苷酸时，引导寡核苷酸的位点2、3和4中的至少一个是修饰的核苷酸；当长度为19个核苷酸时，引导寡核苷酸的位点2、3、4和5 中的至少一个是修饰的核苷酸；当长度为20个核苷酸时，引导寡核苷酸的位点2、3、4、5和 6中的至少一个是修饰的核苷酸；以及当长度为21至30个核苷酸时，引导寡核苷酸的位点 2、3、4、5、6和7中的至少一个是修饰的核苷酸。图1K的形式DH1和形式DH39-DH43提供了 具有21个核苷酸的长度并且引导寡核苷酸的位点2、3、4、5、6和7中的至少一个是修饰的 核苷酸的siRNA修饰形式的实例。这样的siRNA例如在血清或血浆存在的情况下对核酸酶 也是特别稳定的。在一些实施方案中，过客(有义)寡核苷酸包含不依赖于序列的修饰形式(1)，其 中P为0，x为10并且r为2 (形式H，具有形式H的21聚体描述于图1A)；或不依赖于序列 的修饰形式(1)，其中P为0，x为9或11，并且r为2 (形式H-1或形式H+1，具有这样的形 式的21聚体描述于图1B)；或不依赖于序列的修饰形式(2)，其中p为0，y为9，并且r为 2 (形式V，具有形式V的21聚体描述于图1C)。在一些实施方案中，过客(有义)寡核苷酸包含不依赖于序列的修饰形式(1)，其 中P为l，x为9或10，r为2，(形式W或形式W+1，具有这样的形式的21聚体描述于图1D)， 并且各m具有结构仏)，其中附是0，1 2是0，并且1 3是012。在一些实施方案中，过客(有 义)寡核苷酸包含不依赖于序列的修饰形式(3)，x为9或10，r为2，(形式Y或形式Y+1， 具有这样的形式的21聚体描述于图1D)，并且各m具有结构(a)，其中R1是0，R2是0，并 且R3是CH2。在另外的实施方案中，引导(反义)链的各N是除了二环核苷酸以外的核苷酸。在 一些实施方案中，引导(反义)链不具有修饰。在一些实施方案中，siRNA过客寡核苷酸具有修饰形式H，其中修饰的核苷酸m在 所述形式的位点1、2、13和14上；各m是LNA ;各n是脱氧核苷酸；并且各N是核糖核苷 酸。在一些实施方案中，siRNA过客寡核苷酸具有修饰形式H，并且各m具有结构(a)，其中 R1是0，R2是0，并且R3是CH2。在一些实施方案中，siRNA过客寡核苷酸具有修饰形式V，其中修饰的核苷酸m在 所述形式的位点1、2、12和14上；各m是LNA ;各n是脱氧核苷酸；并且各N是核糖核苷 酸。在一些实施方案中，siRNA过客寡核苷酸具有修饰形式V，并且各m具有结构(a)，其 中R1是0，R2是0，并且R3是CH2。在一些实施方案中，siRNA过客寡核苷酸具有修饰形式 V-2，其拥有形式(2)，其中p是0并且y是7。在一些实施方案中，siRNA过客寡核苷酸具有修饰形式Q，其中修饰的核苷酸m在 所述形式的位点13和14上；各m是LNA ;各n是脱氧核苷酸；并且各N是核糖核苷酸。在 一些实施方案中，siRNA过客寡核苷酸具有修饰形式Q，并且各m具有结构(a)，其中R1是 0，R2是0，并且R3是CH2。在一些实施方案中，siRNA过客寡核苷酸具有形式(4)，其中当p为0时，x为12(形 式Q)；当P为1时，x为11(形式JB2)；当p为2时，x为10(形式H)；当p为3时，x为 9(形式JB5)，以及当p为4时，x为8(形式JB 3)并且r为2。在一些实施方案中，siRNA 过客寡核苷酸具有形式(5)，其中x为11(形式JB1)并且r为2。在另外的实施方案中， siRNA过客寡核苷酸具有形式(6)，其中p为3，y为9并且z为1 (形式JB4)，并且r为2。在一些实施方案中，化学合成的短干扰RNA包含通过核苷酸环或连接体环共价键合的过客(有义)寡核苷酸和引导(反义)寡核苷酸，其形成短发夹寡核苷酸。在一些实施方案中，siRNA的各3'末端独立地具有1个、2个或3个核苷酸的悬 突，在一些实施方案中，各3'末端具有2个核苷酸的悬突，其中各悬突的核苷酸包括脱氧 核糖核苷酸。在一些实施方案中，至少一个悬突核苷酸是修饰的核苷酸。在一些实施方案 中，siRNA的各3'末端具有2个核苷酸的悬突，并且1、2、3或所有4个悬突核苷酸是修饰 的核苷酸。在一些实施方案中，至少一个核苷间的连接不是磷酸二酯核苷间连接。化学合成按照标准方法进行干扰RNA寡核苷酸合成。合成方法的非限定性实例 包括使用二酯法、三酯法、多核苷酸磷酸化酶法和通过固相化学进行的体外化学合成。在下 面更详细地论述此类方法。例如按照Imanishi在美国专利6，770，748和6，268，490中描述的；按照ffengel 在美国专利 7，084，125,7, 060，809,7, 053，207,7, 034，133,6, 794，499，和 6，670，461 和 美国公开申请案2005/0287566和2003/0224377中描述的；按照Kochkine在美国专利 6，734，291和6，639，059以及美国公开申请案2003/0092905中描述的；和按照Kauppinen 在美国公开申请案2004/0219565中描述的以及按照Srivastava，P.，等人(J.Am. Chem. Soc. 129，8362-8379，2007)合成具有二环核苷酸结构(包括结构(a)的那些)的寡核苷酸。按照例如Ittig，D.等(Nucleic Acids Res. 32 :1，346-353，2004)合成具有三 环核苷酸结构(b)的寡核苷酸。按照例如Maier，M. A.等人(Nucleic Acids Res. 32 :12， 3642-3650,2004)合成具有二环核苷酸结构(c)的寡核苷酸。按照Dowler等人(Nucleic Acids Res. 2006，34 :6，p 1669-1675)合成具有FANA取代基的寡核苷酸。寡核苷酸合成的二酯法是主要由Khorana等人(Science，203，614. 1979)开发成 可用状态的第一个合成方法。基本步骤是将两个适当保护的核苷酸连接起来，以形成包含 磷酸二酯键的二核苷酸。二酯法已良好地建立并且已被用于合成DNA分子。二酯法与三酯法之间的主要差异是在后者中在反应物和产物的磷酸盐(酯)原子 (phosphate atom)上存在额外的保护基团(Itakura 等人，J. Biol. Chem.，250 :45921975)。 磷酸盐(酯)保护基团通常是氯苯基，其使核苷酸和多核苷酸中间物溶解在有机溶剂中。因 此在氯仿溶液中进行纯化。该方法的其他改进包括(i)三聚体或更大的寡聚体的嵌段偶联 (block coupling), (ii)广泛使用高效液相色谱来纯化中间物和终产物，和(iii)固相合 成。利用经开发用于多肽的固相合成的技术，已能够将起始核苷酸连接至固体支持材 料，然后进行核苷酸的逐个加入。简化所有混合和清洗步骤，且该方法易于实现自动化。现 可使用自动化核酸合成仪常规地进行此类合成。亚磷酰胺化学法(Beaucage,S. L.和 Iyer，R. P. Tetrahedron, 1993 (49) 6123 ； Tetrahedr on, 1992 (48) 2223)迄今已成为最广泛使用的用于寡核苷酸的合成的偶联化学 法(coupling chemistry)。如对于本领域技术人员来说是熟知的，寡核苷酸的亚磷酰胺合 成包括通过与活化剂反应来活化核苷亚磷酰胺单体前体以形成活化的中间物，然后将活化 的中间物顺序加至正在生长的寡核苷酸链(通常一端锚定在合适的固体支持物上)以形成 寡核苷酸产物。可在反才目纯化筒(reversed phase purification cartridge)、离子交换 HPLC、 琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、氯化铯离心梯度、含有结合核酸的试剂(例如玻璃纤维)的柱、过滤器或筒上或通过本领域技术人员已知的任何其他方法纯化siRNA。可使用凝胶电 泳来确定单链对双链结构，可使用离子交换HPLC来测定纯度，可使用MALDI-MS来确定身份 (identity)，可使用UV光谱法来定量测定siRNA。含有内源靶基因的细胞可来源于或包含于任何生物体(例如，真核生物例如植 物、动物、真菌；原核生物例如细菌)中。植物可以是单子叶植物、双子叶植物或裸子植物； 动物可以是脊椎动物或无脊椎动物。微生物可用于农业或工业，或对于植物或动物可以是 病原性的。真菌包括以霉菌和酵母形态学形式存在的生物。脊椎动物的实例包括鱼和哺乳 动物(包括牛、山羊、猪、绵羊、仓鼠、小鼠、大鼠和人)；无脊椎动物包括线虫、昆虫、蜘蛛和 其他节肢动物。靶基因可以是来源于细胞的基因、内源基因、转基因或外源基因例如感染后存在 于细胞中的病原体(例如病毒)的基因。具有靶基因的细胞可来自种系或体细胞、全能或 多能细胞、分裂或非分裂细胞、实质或上皮细胞、永生化细胞或转化细胞等。细胞可以是配 子或胚胎；如果是胚胎，其可以是单细胞胚胎或来自多细胞胚胎的组成细胞(constituent cell)。术语“胚胎”因此包括胎儿组织。具有靶基因的细胞可以是未分化的细胞例如 干细胞，或分化的细胞例如来自器官或组织包括胎儿组织的细胞或存在于生物体中的任 何其他细胞。分化的细胞类型包括脂肪细胞、成纤维细胞、肌细胞、心肌细胞、内皮细胞 (endothelium)、神经元、神经胶质细胞、血细胞、巨核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒 细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、白细胞、粒细胞、角质形成细胞、软骨细胞、 成骨细胞、破骨细胞、肝细胞以及内分泌腺或外分泌腺的细胞。在一些实施方案中，靶RNA是转录的RNA，包括编码RNA和非编码RNA。如本文中所使用的，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”包括它们的后代，所 述后代是通过细胞分裂形成的任何和所有后代。应当理解，所有后代由于有意或无意的突 变而可能不完全相同。宿主细胞可以进行“转染”或“转化”，这是指利用其将外源核酸转移 或引入宿主细胞的过程。转化的细胞包括原代受试细胞和其后代。如本文中所使用的，术 语“工程改造的”和“重组”细胞或宿主细胞意欲指已向其中引入了外源核酸序列例如小干 扰RNA或编码此类RNA的模板构建体的细胞。因此，重组细胞与不包含重组引入的核酸的 天然存在的细胞是可区别的。在某些实施方案中，预期可将RNA或蛋白质性质的序列与其他选择的RNA或蛋白 质性质的序列在相同宿主细胞中共表达。可通过用两种或更多种不同的重组载体共转染宿 主细胞来实现共表达。备选地，可构建包含多个不同的RNA编码区的单个重组载体，然后其 在用该单个载体转染的宿主细胞中进行表达。在一些实施方案中，含有内源靶基因的组织是人组织。在某些实施方案中，组织包 括血液，例如但不限于红细胞、白细胞、血小板、血浆、血清或全血。在某些实施方案中，组织 包括实体组织(solidtissue)。在某些实施方案中，组织包括病毒、细菌或真菌。在某些实 施方案中，组织包括离体组织。组织可包含待用核酸递送组合物或另外的试剂转化或接触的宿主细胞。组织可以 是生物体的一部分或可从生物体分离。在某些实施方案中，组织和其组成细胞可包括但不 限于血液(例如，造血细胞(例如人造血祖细胞、人造血干细胞、⑶34+细胞、⑶4+细胞)、淋 巴细胞和其他血液谱系细胞)、骨髓、脑、干细胞、血管、肝、肺、骨、乳腺、软骨、宫颈、结肠、角
29膜、胚胎、子宫内膜、内皮、上皮、食管、颜面(facia)、成纤维细胞、滤泡、神经节细胞、神经胶 质细胞、杯状细胞、肾、淋巴结、肌肉、神经元、卵巢、胰腺、外周血、前列腺、皮肤、皮肤、小肠、 脾、胃、睾丸。在一些实施方案中，提供了对细胞内和细胞外核酸酶稳定的修饰形式化的siRNA。 在本文中证实，此类siRNA在生物学液体存在的情况下保持全长的时间比之已前已知的稳 定的siRNA更长。将对核酸酶稳定的siRNA用于含有特别高浓度的核酸酶的生物学液体和 组织(包括例如血清、血浆和特别血管化的器官和组织)中。可将siRNA与靶向细胞的配体结合。如本文中所使用的，“靶向细胞的配体”是 具有对于被靶向的位点例如细胞表面受体的特异性的细胞导向分子(ce 11-directing molecule)。“对于被靶向的位点的特异性”是指在将靶向细胞的配体与细胞接触后，在离子 强度、温度、PH等的生理条件下，将发生特异性结合。细胞-配体相互作用可因配体的某些 残基与细胞的特定残基的特定静电、疏水或其他相互作用而发生，从而在有效促进相互作 用的条件下形成稳定的复合物。示例性靶向细胞的配体包括但不限于具有对于细胞受体、蛋白质例如抗体、脂肪 酸、维生素、类黄酮、糖、抗原、受体、报告分子、报告酶、螯合剂、P卜啉、嵌入剂、类固醇和类 固醇衍生物、激素例如黄体酮(例如孕酮)、糖皮质激素(例如，皮质醇)、盐皮质激素(例 如，醛固酮)、雄激素(例如，睾酮)和雌激素(例如，雌二醇)、组胺、模拟激素(hormone mimics)例如吗啡和大环化合物的亲和力的多核苷酸、寡核苷酸、聚酰胺、肽。具有对于细胞 受体的亲和力的肽可包括内啡肽、脑啡肽、生长因子例如表皮生长因子、多聚L赖氨酸、激 素、胰岛素、核糖核酸酶、血清白蛋白结合肽、能够通过主动运输或被动运输穿过细胞膜的 蛋白质的肽区域和其他分子。根据实施方案的用于siRNA递送以影响RNAi的适当的方法包括通过其可将siRNA 引入细胞器、细胞、组织或生物体的任何方法，如本文中所描述的或本领域技术人员所已知 的。此类方法包括但不限于，例如通过注射(包括显微注射)进行的siRNA的直接递送、电 穿孔、磷酸钙沉淀、使用DEAE-葡聚糖然后使用聚乙二醇、直接的超声加载(direct sonic loading)、脂质体介导的转染、微粒轰击、使用碳化硅纤维的搅动、农杆菌介导的转化、PEG 介导的转化、干燥/抑制介导的吸收(desiccation/inhibition-mediated uptake)等。通 过使用技术例如此类技术，可稳定地或瞬时地转化细胞器、细胞、组织或生物体。对于核酸 酶降解是稳定的siRNA (本文中提供了其实施方案)特别适合用于直接注射，如实施例8的 数据所显示的，其中血清稳定的修饰形式化的siRNA以未修饰siRNA的400%的水平存在于 体内。用于显现或检测siRNA的技术包括但不限于显微镜法、阵列、荧光测定法、light cycler或其他实时PCR仪、FACS分析、闪烁计数器、磷屏成像仪(phosphoimager)、Geiger 计数器、MRI、CAT、基于抗体的检测方法(Western、免疫荧光、免疫组织化学)、组织化学技 术、HPLC、光谱法，质谱法；放射学技术、毛细管凝胶电泳和质量平衡技术。备选地，可标记核 酸或给核酸加标签以允许它们有效分离。在本发明的其他实施方案中，对核酸进行生物素 化。“标记”或“报告子(r印orter)”是指允许检测与其结合的物质的部分或性质。 可共价或非共价连接标记。标记的实例包括荧光标记(包括例如，猝灭剂或吸收剂)、比色标记(colorimetric label)、化学发光标记、生物发光标记，放射性标记、质量修饰 (mass-modifying)基团、抗体、抗原、生物素、半抗原、酶(包括例如过氧化物酶、磷酸酶 等)等。荧光标记可包括带负电荷的染料，例如荧光素家族的染料，包括例如FAM、HEX、 TET、JOE、NAN和Z0E ；或在电荷上是中性的染料例如罗丹明家族的染料，包括例如Texas Red、ROX、R110、R6G和TAMRA ；或带正电荷的染料，例如青色素家族的染料，包括例如Cy2、 Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy5. 5 和 Cy7。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G 和 TAMRA 可从例如 Perkin-Elmer，Inc. (ffellesley, MA)获得；Texas Red 可从例如 Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR)获得；以及 Cy2、Cy 3、Cy 3. 5、Cy5、Cy5. 5 和 Cy7 可从例如 AmershamBiosciences Corp. (Piscataway,NJ)获得。在某些实施方案中，荧光剂分子是荧 光素染料，猝灭剂分子是罗丹明染料。标记或报告子可包含荧光团和荧光猝灭剂。荧光猝灭剂可以是发荧光的荧光猝灭 剂例如荧光团TAMRA或不发荧光的荧光猝灭剂(NFQ)，例如，组合的NFQ-小沟结合剂(MGB) 例如由 Epoch Biosciences (Bothell,WA)提供并且与 TAQMAN 探针(Applied Biosystems, FosterCity, CA) 一起使用的MGB ECU PSE 小沟结合剂。荧光团可以是可被连接至核酸 的任何荧光团，例如，FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、Texas Red、ROX、R110、R6G、TAMRA、Cy2、 Cy3. 5、Cy5、Cy5. 5 和 Cy7 (如上文引用的)以及 VIC、NED、LIZ、ALEXA、Cy9 和 dR6G。标记的另外的实例包括黑洞猝灭剂(black hole quencher) (BHQ) (Biosearch)、 Iowa Black (DDT)、QSY 猝灭剂(Molecular Probes)以及 Dabsyl 和 Dabcel 磺酸酯(盐)/ 羧酸酯(盐)猝灭剂(Epoch)。标记还可包含荧光素染料的磺酸酯衍生物、荧光素的亚磷 酰胺形式、CY5的亚磷酰胺形式(可例如从Amersham获得)、嵌入标记例如溴化乙锭以及 SYBR Green I 和 PIC0GREEN (Molecular Probes)。在不同实施方案中，荧光的检测可利用本领域技术人员已知的任何方法来进行， 并且可以是定性的或定量的。可以例如借助于荧光计获得定量的结果。在一些实施方案 中，可使用微阵列和相关软件例如使用Applied Biosystems 1700化学发光微阵列分析 仪的AppliedBiosystems Array System和其他可商购获得的阵列系统(特别地，可从 Affymetrix,Agilent, 11 lumina和NimbleGen获得的系统)来进行检测(也参见Gerry等 人，J.Mo 1. Biol. 292 :251-62，1999 ;De Bellis 等人，Minerva Biotec 14 :247_52，2002 ； 和 Stears 等人，Nat. Med. 9 140-45，包括补充材料，2003)。生物学可接受的载体是指提供适当的防腐作用(当需要时)，并且以均一的剂量 递送一种或多种本文的实施方案的干扰RNA的载体。载体的类型可取决于siRNA是以固体、 液体还是气溶胶的形式使用，以及取决于其对于施用途径例如注射是否需要是无菌的。可 以将siRNA组合物以游离碱、中性或盐形式配制入组合物。siRNA的盐形式具有减少脱靶效 应并且维持抑制活性的特性(与本文中描述的siRNA相当)。盐形式的实例包括有机酸加 成盐和碱加成盐。可以以可在细胞内代谢成活性形式的前药形式提供siRNA组合物；此类 前药形式可包括保护基团例如S-乙酰硫代乙基(S-acetylthioethyl)或S_新戊酰硫代乙 基(S-pivaloylthioethyl)基团。在其中组合物以液体形式存在的实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，包括 但不限于不含RNA酶的水、缓冲剂、盐溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二 醇等)、脂质(例如，甘油三酯、植物油、脂质体)、甘氨酸、可接受的防腐剂(例如，抗菌剂、
31抗真菌剂)、助溶剂(co-solvent)、表面活性剂、渗透促进剂(例如，crem印hor和TWEEN 80 (聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(monolaureate)，Sigma Aldrich，St. Louis，Mo.))、 透明质酸、甘露醇、氯化苯甲烃胺、粘度构建剂(viscosity building agent)(例如，羟甲基 纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素)、包衣、表面活性 剂、抗氧化剂、等渗剂、吸收延迟剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、增甜剂、芳香剂、 染料和其组合。当期望时，通过将siRNA与上文列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂， 然后过滤灭菌来制备无菌注射液。制剂包含与生物学可接受的载体混合的按重量计直至 99%的本文实施方案中的干扰RNA或其盐。可以以溶液、悬浮液或乳剂的形式使用实施方 案中的干扰RNA。用于实施方案中的干扰RNA的可接受的载体包括基于脂质的试剂siPORT NeoFX 转染剂(Ambion Cat. #AM4510)、基于多胺的试剂siPORT Amine转染剂 (Ambion Cat. #AM4502)、基于阳离子和中性脂质的试剂siPORT Lipid转染剂(Ambion Cat. #AM4504)、基于阳离子脂质的转染剂Trails IT _TK0(Mirus Corporation,Madison, wis. )>Lipofectin ^ Lipofectamine > 01igofectamine (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)或 Dharmafect (Dharmacon，Lafayette, Colo.)、另外的多聚阳离子例如聚乙烯亚 胺、阳离子肽例如Tat、聚精氨酸或穿透蛋白(penetratin)、或脂质体。例如，脂质体可从标 准的形成小囊泡的脂质和固醇例如胆固醇形成，并且可以包含靶向性分子例如具有对于细 胞表面抗原的结合亲和力的单克隆抗体。此外，脂质体可以是PEG化的脂质体。可在溶液中、悬浮液中或生物可蚀解或生物不可蚀解递送装置中递送干扰RNA。可 单独地递送干扰RNA或将其作为例如与聚乙二醇部分、胆固醇部分或与生长因子(用于受 体介导的内吞作用)的确定的共价缀合物的组分来进行递送。还可将干扰RNA与阳离子脂 质、阳离子肽或阳离子聚合物复合；与具有核酸结合特性的蛋白质、融合蛋白或蛋白质结构 域(例如，鱼精蛋白)复合；或封装在纳米颗粒或脂质体中。可通过包含合适的靶向性部分 例如抗体或抗体片段来实现组织或细胞特异性递送。除非其与siRNA不相容，否则本文中 的实施方案预期任何常规载体可用于组合物中或用作生物学载体。本文的实施方案中的干扰RNA可通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、损伤内 (intralesionally)、颅内、关节内、心室内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴 道内、子宫内、直肠内、局部、瘤内、鞘内、肌内、皮下、结膜下、囊泡内(intravesicularlly)、 经粘膜、心包内、脐带内(intr aumbilically)、眼内、口服、局部(topically)、局部地 (locally)、吸入(例如，气溶胶吸入)、注射、输注、连续输注、直接地局部灌注水浴靶细胞 (bathing targetcell)、通过导管、通过灌洗、在乳膏剂中、在脂质组合物(例如，脂质体) 中，或通过对于本领域技术人员来说是已知的其他方法或上述方法的任何组合来进行施用 (Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 18 版，Mack Publishing Co. 1990)。离体或体内使用的剂量为0. 01 y g至lg/kg的体重，可每天、每周、每月或每年施 用一次或多次。通常，本文的实施方案中的具有修饰的核苷酸和修饰形式的干扰RNA的有 效量是这样的量，其足以减少脱靶效应同时保持效力，并且在靶细胞表面上产生100pM至 1 y M，或InM至100nM，或2nM至大约25nM，或至大约10nM的细胞外浓度。获得该局部浓度 所需的量可视许多因素(包括递送方法、递送位点、递送位点与靶细胞或组织之间细胞层 的数目、递送是局部的还是全身性的等)而变化。递送位点上的浓度可以比靶细胞或组织的表面上的浓度高得多。制剂的pH为大约pH 4-9或pH 4. 5至pH 7. 4。在一些实施方案中，如下体外评估SiRNA抑制内源靶基因表达水平的能力。使用 siPORT NeoFX 转染剂(Ambion/Applied BiosystemsAustin, TX Ca t#AM4510)，利用厂 商描述的“反向”转染方案转染细胞。将未修饰对照或修饰形式化的siRNA涂板入96孔组 织培养板中以获得例如InM或5nM的终浓度。将SiPORT NeoFX 转染剂与siRNA复合，进 行至少10分钟，然后将刚刚经胰蛋白酶处理的细胞(大约4.0X103)覆盖在siRNA/转染 剂复合物上。将板在37°C下在组织培养条件下温育48小时。 在收获转染的细胞后，按照厂商方案，使用MagMAX -96总RNA分离试剂盒 (Ambion, Inc. Austin TX Cat. #AM1830)分离总RNA。在50 μ 1不含核酸酶的水中洗脱 RNA。按照厂商方案，使用 HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Inc.，Foster City CA, Cat. #4368814)在 30 μ 1 反应体积中产生 cDNA。使用 2 μ 1 cDNA 在 10 μ 1 总 PCR 反应体积中进行TaqMan GeneExpression Assay (Applied Biosystems，Inc.，Cat. #4331182)。进行技术重复，计算每一个样品的18S值。通过使用下 式计算ddCT来检查预扩增的均一性ddCT = (siRNA 处理的 CtGQI_siRNA 处理的 Ct18s) - (Neg 对照 Ctroi-Neg 对照 Ct18s)GOI=内源目的基因18S = 18S 核糖体 RNA 标准化者(normalizer)siRNA处理的=用siRNA处理的生物样品Neg对照=用与任何已知的靶mRNA没有同源性的siRNA处理的生物样品使用下式计算剩余物的百分比剩余物％ = 100 X 2_(ddCT)。可以例如通过western印迹在转染后大约72小时(实际时间取决于蛋白质周转 率)估量靶蛋白质水平。用于从培养的细胞分离RNA和/或蛋白质的标准技术对于本领域 技术人员来说是熟知的。用于显现或检测siRNA的技术包括上文中引述的那些。可标记核酸或给核酸加标 签以使能够有效地分离它们。因此，可通过许多本领域检测方法中的任一个来研究任何给 定的siRNA的沉默能力。“试剂盒”，如本文中所使用的，是指用于在RNA干扰中减少脱靶效应的至少一些项 目的组合。试剂盒的实施方案包括例如至少一种在本文实施方案的修饰形式中具有修饰核 苷酸的siRNA。所述至少一种siRNA可以是定制的。在一些实施方案中，试剂盒包括与生 物学上可接受的载体例如缓冲剂一起的至少一种在修饰形式H、Q、V-2、Y、Y+1、JBl、JB2、JB 3、JB4或JB5中具有二环核苷酸的siRNA，和转染剂或其他合适的递送媒介物。试剂盒的实施方案还可包含靶向人、小鼠和大鼠的所有细胞类型中的持家基因的 已验证的阳性对照siRNA。试剂盒的实施方案还可包括已验证的阴性对照siRNA(其为非靶 向性的)。siRNA对照可以预先进行涂板，并且可用可检测标志物进行标记。试剂盒的实施方案还可包括用于估量期望的靶基因的抑制的试剂，例如用于通过 免疫荧光或Western分析在蛋白质水平上监测抑制的抗体、用于估量酶促活性或报告蛋白 的存在的试剂或用于估量细胞活力的试剂。可包括RT-PCR引物和探针以检测靶或报告子 的mRNA。试剂盒的实施方案还可包含RNA酶抑制剂。
试剂盒的容器工具(container means)通常将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他包装工具，可将组分置于所述容器中，以及在一些实施方案中，将组分适 当地等分于所述容器中。在试剂盒中包括一种以上的组分(可将它们包装在一起)的情况 下，试剂盒通常还将包括至少一个可将另外的组分单独置于其中的第二、第三或其他另外 的容器。然而，可将组分的不同组合包装在容器工具中。本教导的试剂盒还通常包括用于 包含在本文所示的修饰形式中具有修饰核苷酸的siRNA的工具和密闭的任何其他试剂容 器(用于商业销售)。此类容器可包括将期望的容器工具保留在其中的注射或吹塑塑料容 器。当以一种和/或多种液体溶液的形式提供试剂盒的组分时，液体溶液包括可以是无菌 水溶液的水溶液。在某些实施方案中，将至少一种试剂盒组分冻干并且以干粉的形式提供。当以干 粉的形式提供试剂和/或组分时，可通过加入合适的溶剂来重构粉剂。在某些实施方案中， 在另一个容器工具中提供溶剂。试剂盒还可包括用于装无菌的生物学上可接受的缓冲剂和 /或其他稀释剂的另外的容器工具。试剂盒还可包括使用试剂盒组分以及使用未包括在试剂盒中的任何其他试剂的 说明书。说明书可包括可以执行的变化。本方法和试剂盒的实施方案可用于高容量筛选(high volumescreening) 0可使 用本文中的实施方案构建siRNA或候选siRNA的文库。然后可将文库用于高通量测定，包 括微阵列。特别预期的是基于芯片的核酸技术，其包括用于快速和精确地分析大量基因的 定量方法。通过使用固定的探针阵列，可以以高密度阵列的方式将芯片技术用于分离靶分 子并且基于杂交筛选这些分子。术语“阵列”，如本文中使用的，是指核酸的系统性排列。例 如，将代表期望的来源(例如，人成年大脑)的核酸群体划分入最小数目的库(其中可使用 期望的筛选方法检测或耗尽靶基因以及其可分配入单个多孔板)。阵列可以是可从期望的 mRNA来源获得的核酸群体的水性悬浮液的阵列，包括包含多个单独的孔的多孔板，各单 独的孔包含核酸群体的不同内容物的水性悬浮液。阵列、其用途和其实施的实例可见于美 国专利 6，329，209,6, 329，140,6, 324，479,6, 322，971,6, 316，193,6,309，823,5,412，087、 5，445，934和5，744，305，其通过引用合并入本文。微阵列在本领域内是已知的并且由表面(序列上相应于基因产物(例如，cDNA、 mRNA、cRNA、多肽和其片段)的探针在已知的位置上与其特异性杂交或结合)组成。在一个 实施方案中，微阵列是其中各位点代表分开的由基因编码的产物(例如蛋白质或RNA)的结 合位点，且其中结合位点针对生物体基因组中大部分或几乎所有基因的产物的阵列(即， 矩阵)。在优选实施方案中，“结合位点”是特定的相关cDNA可与其特异性杂交的核酸或 核酸类似物。结合位点的核酸或类似物可以是例如合成的寡聚物、全长cDNA、比全长短的 cDNA或基因片段。固体支持物可由玻璃、塑料(例如，聚丙烯、尼龙)、聚丙烯酰胺、硝酸纤维素或其 他材料制造。用于将核酸附着至表面的示例性方法包括在玻璃板上进行印制或通过掩蔽 (masking)。原则上，可使用任何类型的阵列，例如尼龙杂交膜上的斑点印迹，然而，如本领 域技术人员所公认的，非常小的阵列是优选的，因为杂交体积将更小。根据下列实施例可进一步理解本教导的实施方案，所述实施例不应当解释为以任 何方式限定本教导的范围。
实施例1siRNA修饰形式 按照 Beaucage, S. L.禾口 Iyer，R. P. (Tet rahedron, 1993(49)6123 ；Tetrahedron, 1992(48)2223)，使用标准的基于亚磷酰胺的核苷单体和已建立的固相寡聚循环来化学合 tt RNA (siRNA) 。 $ BioAutomation MerMade 192 ☆ j^ft (BioAutomation Corp, Piano,TX)上进行寡核苷酸的合成。将活化剂的8个等价物用于LNA 亚磷酰胺的每一个 等价物以提供大于98% (每碱基加入)的令人满意的逐步偶联得率。使用一次性反相纯化 筒或离子交换HPLC进行单个siRNA链的纯化。凝胶电泳用于确定退火样品的单链对双链 的结构，离子交换HPLC用于测定单链的纯度，MALDI质谱法用于测定单链身份，UV光谱法用 于定量测定单链寡核苷酸和siRNA。各siRNA的引导链和过客链的长度都为21个核苷酸， 每一个siRNA经设计在两个3'末端上都具有两个碱基的悬突。各引导(反义)链的位点 1经设计为“A核苷酸”或“U核苷酸”。当将胞嘧啶(C)核苷修饰为二环糖时，经取代的核 碱基为5-甲基化胞嘧啶残基。当尿嘧啶(U)核苷被修饰为二环糖时，经取代的核碱基为胞 腺嘧啶(T)残基。悬突核苷酸如图IA至图IK中所述，并且(独立地)是脱氧核苷酸、修 饰的核苷酸或核糖核苷酸。在形式“O”的情况下，对引导链进行化学磷酸化。合成所有其 他3'末端和5'末端以包含羟基。引入siRNA分子的修饰的核苷酸包括锁核酸(LNA 残基)，特别是具有上述结 构(a)的那些，其中Rl为0，R2为0，R 3为CH2 ；2' -0-甲基核苷酸衍生物；和2' -5' 连接的核苷酸。LNA amidites 购自 Proligo (Boulder，CO)和 Exiqon A/S(Vedbaek, Denmark) ,2 ‘ -O-甲基核苷酸衍生物以及3 ‘-和2 ‘ -TBDMS RNA amidite s购自 ChemgenesCorporation(Wilmington, ΜΑ)。引入siRNA的修饰形式包括图IA (除了未修饰对照形式A以外，形式Ε、F、G、H、 J、K和0)、图让(形式1!1(重复的)、!1(-1)、!1(-2)、!1(+1)和Q)、图IC(形式M(重复的)、 H(重复的)V、V(_1)、V(_2)、V(+1))、图 ID(形式 W、W+1、W-1、Y、Y-1 和 Y+l)、图 IE(形式 JB 1、JB2、JB 3、JB4和JB5)中所示的那些以及实施例7中进一步描述的图IF至图IK中所示 的那些。修饰形式包括只在过客(有义)链上的修饰(形式E、H、K、M、H-1、H_2、H+1、Q、V、 V-1、V-2、V+1、W、W+1、W-1、Y、Y-1、Y+1、JB1、JB2、JB3、JB4、JB5、DH3、DH30 和 DH28 (关于 DH 形式，参见实施例7))或在引导(反义)链和过客(有义)链上的修饰(形式F、G、J、0以 及除了 DH3、DH30和DH28外的所有DH形式(关于DH形式，参见实施例7))。下面进一步 描述图IA至图IE的修饰形式。形式修饰位点(从各链的5'末端开始编号)过客序列引导序列A，对照 无无E1,20,21无F1,20,2120，21G1，2，13，14 9，10，19，20H1，2，13，14 无J1,2,10,14 11,12,19,20
K1，2，10，14 无01,2 2+5'磷酸M1,2 无
H(-l)1，2，12，13 无H(-2)1,2,11,12 无H(+l)1，2，14，15 无Q13，14 无V1，2，12，14 无V(-l)1,2,11,13 无V(-2)1，2，10，12 无V(+l)1,2,13,15 无W2，3，13，14 无W+12，3，14，15 无W-I2，3，12，13 无Y1，3，13，14 无Y-I 1，3，12，13无Y+1 1，3，14，15无JBl 1,2,14无JB2 1,13,14无JB3 1，2，3，4，13，14 无JB4 1,2,3,13,15 无JB5 1,2,3,13,14 无之前Mook等人(Molecular Cancer Therapeut ics March，20076 :3，833—843) 艮 导了形式F。之前E 1 men等人(Nucleic Acids ResearchJanuary 14,2005. 33 1,439-447) 报导了形式 E 和 F。Jackson 等人(RNA May 8，200612 :71197_1205)描述了形式 0。实施例2SiRNA沉默效应的测定方法如下测定由给定的SiRNA的引导(反义)链和过客(有义)链介导的对外源提供 的基因的切割活性。使用DNA连接酶和标准克隆技术将来自目的基因(GOI)的cDNA片段以 正向或反向(相对于基因DNA的编码链的方向)克隆入pMIR-REPORT miRNA表达报告载 体系统(Ambion/Applied Biosystems, Austin TX Cat#AM5795)。对于下列 G0I，全长 cDNA 克隆购自 Open Biosystems (Huntsville, AL)。基因ID符号 描述983CDC2 细胞分裂周期21017CDK2 细胞周期蛋白依赖性激酶2701BUBlB 不受苯并咪唑1同源物β抑制的BUB1 出芽2222FDFTl 法尼基二磷酸法尼基转移酶13156HMGCR 3_羟基_2甲基戊二酰基-辅酶A还原酶
7456 WEElWEEl 同源物(裂殖酵母(S. pombe))5347 PLKlPolo 样激酶 11213 CLTC网格蛋白，重链(He) 836 CASP3胱天蛋白酶3，细胞凋亡相关半胱氨酸肽酶595 CCNDl细胞周期蛋白Dl1595 CYP51A1 细胞色素P450，家族51，亚家族A，多肽 1GOI编码序列的长度的大小范围在1. 2kb至大于6kb。将来自各GOI的cDNA片段 单独地亚克隆入pMIR-REPORT miRNA表达报告载体的HindIII (核苷酸位点463)/SpeI (核 苷酸位点525)多克隆位点，所述载体包含在哺乳动物启动子/终止子系统的控制下的萤火 虫萤光素酶报告蛋白，如图2A中所显示的。标准的基于PCR的技术用于对HindIII和SpeI 限制性内切核酸酶位点进行工程改造。产生表达mRNA转录物的报告载体，所述mRNA转录 物包含以正向或反向(相对于fLucmRNA，如图3A和图3B中所示的)融合至GOI的mRNA 的萤光素酶mRNA。fLuc-GOI融合mRNA在位于最靠近fLuc编码序列的5’起始位点的CMV 启动子的控制下表达。当将报告构建体和与fLuc或cDNA GOI互补的siRNA共转染入细胞 时，通过测量剩余的萤光素酶蛋白或通过剩余的fLuc-GOI融合mRNA来监控作为RNA干扰 的结果的抑制。将来自各GOI的各方向的所有亚克隆片段的5'和3'末端500个核苷酸 经历核苷酸序列分析以确认载体内包含的cDNA的身份和方向。因此，这些载体用作用于监 控由引导链(正向克隆)或过客链(反向克隆)介导的siRNA切割的底物来源。按照厂商的方案，使用图2B中描述的pMIR-REPORT β -半乳糖苷酶报告对照 载 体(Ambion/Applied Biosystems, Austin TX Cat##AM5795)标准化转染效率。β-gal 编 码序列在CMV启动子的控制下表达。将获自fLuc报告基因的信号除以获自各自的β-gal 报告基因的信号以计算各测定的标准化的萤光素酶活性。转染将Hela 细胞(ATCC No. CCL-2，Manassas, VA)以大约 8. OXlO3 个细胞 / 孔 的密度涂板在96孔组织培养板中。24小时后，使用标准转染方案，用siPORT Amine转 染剂(Ambion/Applied BiosystemsAustin, TX Cat#AM4502)以及终浓度 30nM 的待研究的 siRNA、40ngpMIR-REP0RT 萤光素酶-GOI质粒和4ng pMIR-REPORT 转染对照质粒转染细 胞。转染后24小时用完全培养基清洗细胞，在转染48小时后收集细胞以进行分析。对于每 一种质粒对各个待研究的siRNA进行3个生物学重复实验。平行地，为了计算由测试siRNA 的过客链和引导链产生的mRNA抑制的百分比，在相同的实验条件下转染Silencer 阴 性对照 siRNA (Ambion/Applied Biosystems, Austin TX Cat#AM4636)以测量使用非靴向性 siRNA的表达的基线水平。Dual-Light 组合报告基因测定系统按照厂商推荐的方案，将Applied Biosystems Dual-Light 组合报告基因测定系统(AppliedBiosystems，Foster City CA Cat#T1003)用于同时检测相同样品中的萤光素酶和β-gal。使用BMG LABTECH POLARstar Optima 读数器(BMG LABTECH, Durham, NC)进行发光读数。在Dual- Light 测定系统中在加入荧光素底物后2至5秒进行萤光素酶测定。 在加入底物以进行半乳糖苷酶的检测和测量之前，使板静置至少45分钟。使用适当的β -gal读数标准化各孔以获得萤光素酶信号/β -gal信号的比。然后通过针对阴性对照 siRNA转染的细胞标准化生物学样品来计算抑制或剩余的萤光素酶表达％。实施例3SiRNA修饰形式的沉默效应可进行链转换(Stra
nd-Switch)为了进行该研究，对于3个外源提供的靶mRNA中的每一个，以未修饰形式A和8 种不同测试修饰形式(E、F、G、H、J、K、M*0)中的每一种形式合成2个siRNA。因此，各测 试形式提供了 6个siRNA的数据。对于图4A至图4E的数据，由形式字母指定的并且参照 图IA和图IB的位点上的修饰核苷酸“m”是具有上述结构(a)的LNA 残基，其中Rl是0， R2是0，以及R3是CH2。通过实验确定图4A举例说明的选择用于本研究的siRNA序列对两 条链的部分都具有链沉默活性。这样的集合允许分析修饰具有的对引入链偏向性(即，削 弱一条链的沉默活性同时保持另一链的活性的能力)的影响。对于该siRNA集合，显示了 由未修饰引导链介导的萤光素酶-GOI mRNA的平均大约70%的抑制，显示了由未修饰过客 链介导的萤光素酶-GOI mRNA的平均大约58%的抑制(图4A，形式A)。将在进行未修饰形式A和各测试修饰形式(E、F、G、H、J、K、M和0)的RNAi研究 后存在的标准化的报告蛋白的量绘制于图4A中。深色条块表示由于引导链产生的沉默导 致的剩余活性％，因为数据由具有正向定向的GOI的克隆产生。图4A的浅色条块表示由于 过客链的沉默而导致的剩余活性％，因为数据由具有反向定向的GOI的克隆产生。通过混 杂的(无义)siRNA的平行转染进行标准化，所述混杂的siRNA的转染导致两条链的少量抑 制。该信号减少(大约20%)导致报告蛋白的明显增加(对于所有标准化的结果)，因为 标准化基于无义siRNA的阴性值。该明显增加对于修饰靶E、F、G、H、J、K、M和0的过客链 数据最为明显。该模型报告系统用于检测过客链和引导链的活性的变化。图4A的数据显示具有修饰形式E、F、H、K、M和0的siRNA的引导(反义)链获得 基本上与对照形式A引导链相同的沉默活性。在修饰形式G和J存在的情况下，siRNA的 引导链沉默它们的靶的能力降低，在形式J的情况下，siRNA的引导链沉默它们的靶的能力 降低至低于20%的平均抑制活性。虽然大部分图4A描述的修饰形式提供了与未修饰对照引导链相似的引导(反义) 链介导的切割，但所有测试修饰形式严重地削弱了过客链沉默它们的靶的能力，从而基本 上使过客链失去干扰活性。为了进一步检查修饰形式对链活性的影响，将该用于链型测定的SiRNA的组扩展 至包括另外18种siRNA。图4B至图4E的数据以箱线图形式(也称为箱须图)提供了更大 的siRNA集合的测定结果。对于各图，深色水平条表示各修饰形式的数据集的中值。箱表 示数据在各修饰形式的数据集的下四分位数和上四分位数上的分布，而虚线(须)表示各 修饰形式的数据集的最小和最大值。圆圈表示各修饰形式的数据集中可能的异常值。图4B提供了在该更大的siRNA组的siRNA转染入Hela细胞后过客链的活性。使 用下式计算活性P(过客链的活性)=(来自用测试siRNA处理的反向克隆的剩余fLUC β -gal活性)/ (来自用Neg对照siRNA处理的反向克隆的剩余fLUC β -gal活性)。图4B 的数据显示修饰的siRNA形式的过客链的活性丧失，如通过中值过客链抑制活性的向上偏 移所看到的(与形式A的抑制活性相比)。修饰形式G、H、J、K、M和0的数据在统计学上是 显著的(P < 0. 05)，从而证明修饰形式在降低过客链的活性上是有效的。
图4C提供了在图4B中分析的siRNA组转染Hela细胞后引导链的活性。使用下式 计算活性G(引导链的活性)=(来自用测试siRNA处理的正向克隆的剩余fLUC β-gal 活性)/(来自用Neg对照siRNA/处理的正向克隆的剩余fLUC β -gal活性)。形式Ε、F、 Η、Μ和0对引导链的活性没有负影响(即，“无害”)。形式E似乎以统计学上显著的方式增 加引导链减少萤光素酶信号的能力，如中值引导链活性的向下偏移所表明的(与未修饰形 式A相比)。修饰形式G、J和K降低引导链的活性，如此类形式的中值的向上偏移所证明 的(ρ < 0. 05)(与形式A的未修饰siRNA相比)。表4D的数据提供了使用下式获得的图4Β和图4C的过客链与引导链之间的fLUC 活性差异活性差异=P-G(使用上文所示的P和G的定义)。因为fLUC报告测定测量细胞 中siRNA转染后的萤火虫萤光素酶的活性的量，因此更具活性的siRNA链抑制更多的fLUC 报告基因mRNA，且导致更低的萤光素酶活性的相对量。因此，如果过客链的活性低于引导 链，则该活性差异计算的值将大于0。如果过客链的活性大于引导链，则所述值将小于0。修 饰形式J减少测试siRNA的两条链之间的活性差异。图4E的数据提供了图4B和图4C的siRNA的过客链与引导链之间的活性的倍数 变化。使用上文所示的P和G的定义，将活性倍数变化计算为log2(P)-log2(G)。O值描述 了各链具有相等沉默能力的siRNA。活性倍数变化越大，siRNA的引导链偏向性越大。图 4E的箱线图的比较显示，与对照未修饰siRNA形式A的链偏向性相比，修饰形式E、H、M和 0的过客链与引导链之间的链偏向性显著增加(p<0.05)。因此，具有修饰形式Ε、H、M和 0的siRNA，与未修饰形式A相比，展示增加的链型。形式G、J和K显示过客链和引导链之 间更低的倍数差异，但只有形式J显著减小活性的倍数变化(与形式A相比)。形式H显示 了最大的单独的链偏向性。对于各修饰形式，通过链转换(SW)修饰形式(从过客链至引导链以及从引导链至 过客链)来进行研究以检测修饰形式影响高效力siRNA链的沉默活性的能力。S卩，例如，对 于图5A的修饰形式Fsw，将形式F在过客(有义)链的位点1、20和21上的修饰(图1A)引 入引导(反义)链，将形式F在引导(反义)链的位点20和21上的修饰(图1A)引入过 客(有义)链。图5A的数据提供了链测定的结果，其中对于具有未修饰siRNA形式A的12个 siRNA和具有转换的链修饰(与图4A的那些相比较)的相同的12个siRNA，将进行RNAi 研究后存在的标准化的报告蛋白的量作图。图5A数据所研究的siRNA的组与图4A数据所 研究的组相异在于图5A数据的siRNA具有链偏向性，如由未修饰形式A siRNA的引导链与 过客链之间剩余的fLUC信号的百分比的巨大差异所证明的。用于在该“链转换”测定中测 量抑制的实验条件与用于产生图4A的数据的实验条件相同。如图5A的数据所提供的，引导链的沉默活性由于链转换修饰而显著降低。具有链 转换的修饰形式的引导链获得平均低于20%的抑制。对于该siRNA集合，链转换的修饰形 式Hsw是使引导(反义)链失活的最有效修饰形式之一。具有链转换的修饰形式的测试过客链提供了可变结果。然而，具有链转换的修饰 形式的所有测试过客链在抑制上比图5A中的未修饰siRNA形式A中的过客链更有效。然 而不希望受理论束缚，作为削弱引导链 的效力的结果，过客链的效力很可能间接或继发地 被增强，如由链转换修饰形式中的过客链获得的增强的抑制所表明的。
图5B以箱线图的形式提供了图5A的数据，所述形式如上文对于图4D描述的。因此，如果过客链的活性低于引导链的活性，则预期差异将大于0，这通过修饰形式A来证明， 对于该修饰形式，该siRNA集合的中值活性差异为大约0. 65。链转换的修饰形式具有小于 0的差异活性，表明形式HSW、MSW、FSW、ESW和Osw使链型发生转换，从而有利于过客链而非引导 链(与未修饰形式A相比)。对于链转换的修饰形式Msw(其具有大约-0.5的中值活性差 异)观察到最大的链型增强。在图5C中，对于各修饰形式，提供了图5B的siRNA的过客链与引导链之间的活性 的倍数变化(10&(P)-10&(G))。这些结果表明赋予引导链抑制活性并且基本上使过客链 失活的修饰形式，当进行链转换时，可降低引导链的抑制活性并且增加过客链的抑制活性。 使用不同的修饰形式进行与图4A和图4D的研究(使用LNA 修饰核苷酸)相似的研究， 其中修饰的核苷酸被2' -0甲基化。为了进行该研究，对于3个靶mRNA中的每一个，以未 修饰形式A和各测试形式合成2个siRNA。因此，各测试形式提供了 6个siRNA的数据。如 图4A的研究一样，选择用于该研究的特定siRNA序列是其未修饰形式AsiRNA的两条链都 显示沉默作用的siRNA。未修饰siRNA的引导(反义)链平均使靶mRNA减少70%，而过客 (有义)链使靶mRNA减少55 %。关于过客(有义)链的活性，图6A的数据显示，在与siRNA于培养物中温育48小 时后，基本上所有mRNA产物可获得用于萤光素酶测定。即，具有其中修饰的核苷酸被2' -0 甲基化的修饰形式的测试siRNA显示了过客(有义)链的效力的显著丧失，如这些样品中 剩余基因表达％的增加所表明的。该过客链的抑制功能的失活与使用LNA 修饰核苷酸的 修饰形式的数据相符。还与LNA 修饰形式H、K和0的数据相符，与未修饰对照形式A相 比，具有拥有2' -0-甲基核苷酸的修饰形式H、K和0的引导链的效力基本上未改变。因 此，具有2' -0-甲基修饰的核苷酸的修饰形式似乎在这些链测定(对于所述测定，外源提 供了靶)中对于保持引导(反义)链的活性同时使过客(有义)链的切割活性失活是同样 有效的。图6B以箱线图的形式提供了图6A研究的siRNA (6siRNA)和另外18个siRNA序 列的数据。形式A的组的活性差异显示大部分siRNA偏向于引导链(由大约0. 5的中值所 表明)。然而，与对照形式A相比，在指定的修饰形式中具有2' OMe的siRNA显示过客链 与引导链之间的更大的差异。形式H和H+1诱导最大的链间差异。具有2' -OMe修饰碱基 的形式0不能增加链间的活性差异。图6C中提供了过客链与引导链相比较的活性倍数变化，如之前所述进行计算。倍 数变化分析显示与形式A的未修饰siRNA相比，形式H提供了最大的倍数变化。然而，对于 形式H-1、H、H+UV-2和K但非形式0，也观察到链间活性的显著倍数变化，如图6C的附图 说明中引用的Wi 1 coxon值确定的。在不同的修饰形式中研究了第三个类型的修饰核苷酸。图7A提供了其中修饰形 式的修饰核苷酸是2' ,5'-连接的核苷酸的链测定的结果。对于未修饰形式A和测试形 式H-I、H、H+1、V-2、K和0，将来自以正向和反向克隆的GOI的pMIR-REPORT 研究的fLuc 信号的活性差异(从而表示引导链与过客链的功效和抑制活性的差异)作图。未修饰对照 形式A的链型结果与含有2' ,5'-连接的碱基的测试形式的结果的比较表明，除了形式0 夕卜，通过包含2' ,5'-连接的碱基修饰未获得siRNA的链型的统计学上显著的变化。具有2' -5'-连接的碱基修饰的形式O减小了活性差异，从而表明引导链的抑制活性以统 计学上显著的方式丧失。图7B提供过客链与引导链之间的活性倍数变化(如之前所述进行计算)。倍数 变化分析显示含有2' -5'连接的核酸的形式0在负方向上影响siRNA的链型，如过客链 与引导链之间的活性倍数变化的减少表明的。此外，来自以形式H-1、H+1、V-2和K存在的 2' -5'连接的核酸的数据在统计学上是不显著的，从而，这些形式不适合于提高siRNA的 链型。只有用2' -5'碱基修饰修饰的形式H显示链型的统计学上显著的增加，如图7B的


中引用的Wi 1 coxon值所显示的。基于图4A和图6A的数据，关于引导链对过客链的切割活性的差异的统计学分析 显示链偏向 性的最大变化由修饰形式H中的LNA 和2' OMe修饰的核苷酸引入。链型 分析还显示形式G、形式J和形式K以统计学上显著的方式降低了引导链的活性，从而之后 不再考虑将它们用于增强siRNA特异性。具有LNA 修饰核苷酸的形式H诱导了引导链高 于过客链的切割活性的平均8倍的差异，如图4A的数据所证明的。相比之下，未修饰对照 形式A显示引导链高于过客链的平均4倍的增加的活性。因此，形式H修饰使通常存在于 最佳设计的siRNA中的链偏向性加倍。此外，这些数据证明具有LNA 修饰残基的链转换的形式能够与它们使过客链失 活一样有效地使引导链失活。图12A-1和图12A-2的数据表示在指定的形式中包含LNA⑩修饰核苷酸的12个 siRNA的抑制活性。测试组的链型表明大部分siRNA不对称地偏向具有更高活性的引导 链(图12A-1的形式A的0. 5的中值活性差异所表明的)。然而，产生的具有修饰形式和 LNA 残基的siRNA显示了与未修饰形式A相比，更大的过客链与引导链活性之间的差异。 形式H修饰形式以统计学上显著的方式增加了链间的活性差异，但活性倍数变化不显著， 如图12A-2的数据所显示的。图13A-1和图13A-2的数据表示在指定的形式中含有2 ‘ OMe修饰的核苷酸的 siRNA。测试组的链型表明大部分siRNA不对称地偏向具有更高活性的引导链，如图13A-1 的0. 5的中值活性差异表明的。然而，产生的具有2' OMe修饰的核苷酸的siRNA显示了与 未修饰对照形式A相比，更大的过客链与引导链之间的倍数变化，如图13A-2所显示的。形 式H、K和V-2诱导了最大的且统计学上显著的链间倍数变化(ρ <0.05)。除了形式0以 夕卜，所有形式的数据与未修饰siRNA相比，在统计学上都是显著的。实施例4siRNA修饰形式对内源基因的沉默的效应检测修饰形式化的siRNA对内源基因的沉默，以确定修饰形式是否改变siRNA抑 制其mRNA靶的功效。为了进行该研究，通过以低浓度将修饰形式化的siRNA转染入Hela 细胞(ATCC No. CCL-2, Manassas, VA)、U20S 细胞(人骨肉瘤细胞系，ATCC No. HTB-96)和 HUH7 细胞(人肝细胞瘤细胞系，#JCRB 0403，Japanese Cancer Research ResourceBank, Tokyo, Japan)来检测内源基因的抑制。本文中论述了 Hela细胞的数据。使用厂商描述的“反向”转染方案，利用SiP0RTTMNeoFXTM转染剂(Ambion/Applied Biosystems Austin, TX Cat#AM4510)转染Hela细胞。将未修饰对照或修饰形式化的siRNA 涂板至96-孔组织培养板中以获得InM或5nM的终浓度。将SiP0RTTMNeoFXTM转染剂与siRNA复合，进行至少10分钟，然后将刚刚经胰蛋白酶处理的Hela细胞(大约4. 0 X 103个细胞) 覆盖在siRNA/转染剂复合物上。将板在37°C下于组织培养条件下温育48小时。使用厂商描述的“正向”转染方案，利用HyPerFeC t 转染剂(Qiagen， Gaithersberg，MD)转染U20S细胞。将未修饰对照或修饰形式化的siRNA涂板至96-孔组 织培养板中以获得3nM或30nM的终浓度。将HyPerFeC t 转染剂与siRNA复合，进行 至少10分钟，然后将复合物加入培养中的U20S细胞(大约4.0X103个细胞)中。将板在 37°C下于组织培养条件下温育48小时。在收获转染的细胞后，按照厂商的方案使用MagMAX -96总RNA分离试剂盒 (Ambion, Inc. Austin TX Cat. #AM1830)分离总 RNA。将 RNA 洗脱在 50 ii 1 不含核酸 酶的水中。按照厂商的方案，在30iU反应体积中使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosys terns, Inc. Fos ter City CA, Cat. #4368814)产生 cDNA。在 10 i! 1 的总 PCR 反应体积中使用 2 u 1 cDNA 进行TaqMan Gene Expression Assays (App lied Biosystems, Inc.，Cat. #4331182)。进行技术重复，计算各样品的 18S 值。通过使用上述公式计算ddCT来检查预扩增的均一性。使用下列公式计算剩余% 剩余％ = 100 X 2_(ddCT)。使用下列公式计算mRNA抑制的分数mRNA 抑制的分数=l_(2_(ddCT))和mRNA抑制％ = mRNA抑制的分数*100。为了进行该抑制研究，针对8个内源靶mRNA中的每一个，以未修饰形式A和8个 测试修饰形式E、F、G、H、J、K、M和0中的每一个形式合成6个siRNA。从而，各测试形式提 供了 48个siRNA的数据。关于图8的数据，由形式字母指定的并且参照图1A至图1C的位 点上的修饰核苷酸“m”是具有上述结构(a)的LNA 残基，其中R1是0，R2是0，并且R 3
CH2 。图8提供了关于5nM终浓度的修饰形式化的siRNA在Hela细胞中沉默内源mRNA 靶以及在转染后48小时使用TaqMan GeneExpression Assays测定靶的抑制％的数据。 这些研究的结果显示与对于未修饰形式A的组观察到的抑制活性相比，在形式G、J和K中 包含的修饰形式化的siRNA削弱了 siRNA的抑制活性，然而在形式E、F、H、M和0中 包含LNA 的修饰形式化的SiRNA保持或增加了抑制活性。因此，在不同位点上具有LNA 残基的几种修饰形式不负面影响SiRNA的抑制活性，但足以增强引导链对过客链的链型。 还在人肝细胞瘤细胞(HUH7)和人骨肉瘤细胞(U20S)中测定了该LNA 修饰的siRNA的集 合中siRNA的抑制活性。在这些细胞系中，通过考虑不同的转染效率，各修饰形式的LNA 修饰的siRNA展示了与在HeLa细胞中观察到的抑制活性相似的抑制活性(数据未显示)。 因此，沉默性能不受使用的细胞系的类型影响。图12B提供了关于使用LNA 修饰核苷酸的修饰形式H、H-2、H-1、H+1、Q、K、V、V_1 和V-2的另外的抑制活性数据。该数据集表示靶向4个不同内源mRNA靶的24个不同的 siRNA。以各形式合成24个siRNA中的每一个，同样地分析各组中siRNA的抑制活性。以 5nM的终浓度转染Hela细胞，在转染后48小时使用TaqMan GeneExpression Assay进行测定。结果显示以形式K和V-2存在的SiRNA的抑制活性轻微减小(该减小与未修饰S RNA相比在统计学上不显著)。修饰形式H、H-1、H-2、H+1、Q、V和V-1，与对于未修饰siRNA 的组观察到的抑制活性相比，保持或增加了对mRNA靶的抑制活性。图13B的数据提供了使用2' OMe修饰的核苷酸的修饰形式H、H+1、H-1、K、V_2和 0的抑制活性。该数据集表示靶向4个不同的内源mRNA靶的24个不同的siRNA。以各形 式合成24个siRNA中的每一个，然后同样地分析各组中siRNA的抑制活性。以5nM的终浓 度转染Hela细胞，转染后48小时使用TaqMan Gene Expression Assay进行测定。结 果显示修饰形式H、H+l、H-1、K、V-2和0，与对于未修饰形式Asi RNA观察到的抑制活性相 比，保持或增加了抑制活性。图14A提供了与形式A相比的使用LNA 修饰核苷酸的修饰形式H、M、W、W+1、 W-1、Y、Y+1和Y-I的另外的数据。该数据集表示靶向5个不同内源mRNA靶的15个不同的 siRNA。以指定的形式合成15个siRNA中的每一个，然后同样地分析各组中siRNA的抑制 活性。以30nM的终浓度转染U20S细胞，转染后48小时使用TaqMan GeneExpression Assay进行测定。结果显示具有用LNA 残基修 饰的修饰形式W、W+1、W_1、Y、Y+1和Y-I的 siRNA,当与未修饰siRNA形式A的抑制活性相比较时，保持抑制活性。具有修饰形式M的 siRNA,当与具有未修饰形式A的siRNA的抑制活性相比时，抑制活性被削弱(以统计学上 显著的方式)，具有修饰形式H的siRNA，当与未修饰形式A的抑制活性相比时，提高了抑制 活性(以统计学上显著的方式)。图14B的数据提供了使用LNA 修饰核苷酸的修饰形式H、M、JB1、JB2、JB 3、JB4 和JB5与形式A相比较的抑制活性。该数据集表示靶向5个不同内源mRNA靶的15个不同 的siRNA。以指定的形式合成15个siRNA中的每一个，然后同样地分析各组中siRNA的抑 制活性。以30nM的终浓度转染U20S细胞，转染后48小时使用TaqMan GeneExpression Assay进行测定。结果显示具有修饰形式JB2、JB 3和JB5的siRNA就抑制活性而言与未 修饰形式A没有统计学上显著的差异；具有形式H、JBl和JB4的siRNA，与形式A相比，提 高了抑制活性，具有形式M的siRNA，当与形式A相比时，具有较低的抑制活性。在本实施例中检查的siRNA修饰形式中，当与未修饰形式相比时，形式G、J、K和M 削弱了抑制活性。实施例5作为脱靶效应的量度的具有修饰形式H的siRNA对全基因表达特征谱的影响通过使用微阵列分析测量基因特征谱，将形式H中LNA 和2' -0-甲基修饰的 核苷酸影响差异表达的基因的特征(signature)的能力与未修饰siRNA的能力相比。在一 式四份的用4个经设计靶向FDFTl基因的siRNA转染的生物学样品上进行微阵列基因组分 析。FDFTl是参与胆固醇生物合成的基因，其对于用于检测的细胞不是必需的。该标准确保 通过阵列分析检测到的基因表达的差异完全是siRNA介导的切割的结果而不是由于功能 性mRNA靶的丧失而引起的任何生物级联的结果。使用上文中概述的标准方法，分别以未修饰形式A、LNA 修饰的形式H和 2' -0-甲基修饰的形式H将3个siRNA序列(称为siRNA#183、#184和#192)中的每一个 转染入Hela细胞，在24小时后收获转染的细胞。使用标准方法分离RNA以进行微阵列分 析。将含有人探针组的Affymetrix U133V2微阵列芯片(Affymetrix，Santa Clara, CA)用于这些研究。对照包括阴性对照siRNA、“模拟(mock)”转染的细胞和未处理的细胞(以记录在实验处理不存在的情况下基因表达的基线水平)。在对数据进行标准化后，分析结果以 确定与模拟(只有递送剂)对照样品的结果相比，样品组的每一个样品中变化2倍或更大 倍数的基因的身份。然后将使用计划对比(planned contrast)的单因素方差分析(1-way AN0VA)用于确定各模拟处理对实验条件的ρ值。然后以2倍变化和ρ < 0. 001来确定差异 表达的基因探针组。差异表达的基因的数目是由于siRNA而引起的脱靶效应的量度。图 9A 至图 9C 提供了 siRNA#183(图 9A)、siRNA#184(图 9B)和 siRNA#192(图 9C) (3个不同的经设计靶向FDFTl基因的siRNA)的结果的维恩图。各图描述了以指定的未修 饰的、2' -0-甲基或LNA 修饰的siRNA形式存在的3个siRNA中的每一个的结果。维恩 图显示了在各实验条件中发生变化的特定基因的数目和siRNA条件之间基因的交集。对于 各图，左下组(如果有颜色的话为红色)显示未修饰的siRNA处理的样品中变化2倍或更 大倍数的特定基因的数目，上组(如果有颜色的话为蓝色)显示2' -0-甲基形式H修饰 的siRNA处理的样品中变化2倍或更大倍数的特定基因的数目，右下组(如果有颜色的话 为绿色)显示LNA 形式H修饰的siRNA处理的样品中变化2倍或更大倍数的特定基因的 数目。对于siRNA#183 (图9A)，未修饰的siRNA诱导31个基因(2+19+10+0)的mRNA水 平降低2倍或更大倍数。2’ -0-甲基修饰的siRNA诱导32个基因(3+0+10+19)的mRNA水 平降低2倍或更大倍数，其中29个也受到未修饰的对照siRNA的影响。用2' -0-甲基修 饰的siRNA处理的样品与未修饰siRNA处理的样品在脱靶基因的数目上只相差3个基因。 LNA 修饰的siRNA诱导10个基因(0+0+10+0)的mRNA水平降低2倍或更大倍数，其全部 也受未修饰对照和2' -0-甲基修饰影响。因此，这10个基因代表了依赖于序列的并且不 能通过本文中提供的教导减弱的脱靶效应。因此，与2' -0-甲基修饰(0%的脱靶效应的 减少)相比，LNA 修饰形式对脱靶基因表达变化的消除具有更显著的影响(68%的脱靶 效应的减少)。对于siRNA#184 (图9B)，未修饰的siRNA在Hela细胞中诱导70个差异表达的基因 (14+23+33+1)的mRNA水平降低2倍或更大倍数。2' -0-甲基修饰的siRNA诱导66个基 因(9+1+33+23)的mRNA水平降低2倍或更大倍数。相比之下，与未修饰siRNA的结果相比， LNA 修饰的siRNA减少差异表达的基因的数目50% (35个基因(0+1+33+1))。在LNA 修饰处理的样品中绝大部分差异表达的基因(33个基因)也在未修饰siRNA和2' -0-甲 基修饰的siRNA处理的样品中被鉴定为差异表达。这样的基因代表了依赖于序列的并且不 能通过本文中提供的教导减弱的脱靶效应。因此，与2' -0-甲基修饰(6%的脱靶效应的 减少)相比，LNA 修饰形式对脱靶基因表达变化的消除再次具有更显著的影响(50%的 脱靶效应的减少)。对于siRNA#192 (图9C)，未修饰的siRNA诱导103个差异表达的基因 (28+13+61+1)的mRNA水平降低2倍或更大倍数。2' -0-甲基修饰的siRNA诱导81个基 因(7+0+61+13)的mRNA水平降低2倍或更大倍数。LNA 修饰的siRNA诱导64个基因 (2+1+61+0)的mRNA水平降低2倍或更大倍数。因此，与未修饰siRNA相比，LNA 修饰消除 了大约38%的脱靶效应。对于该siRNA，61个基因代表依赖于序列的并且不能通过本文中 提供的教导减弱的脱靶效应。与2' -0-甲基修饰(21%的脱靶效应的减少)相比，LNA ‘修饰形式对脱靶基因表达变化的消除再次具有更显著的影响(38%的脱靶效应的减少)。总之，微阵列分析显示，当与未修饰形式A SiRNA相比时，LNA 修饰的形式H siRNA产生减少38%至68%的差异表达的基因，当与未修饰形式A siRNA相比时， 2' -0-甲基修饰的形式H siRNA产生减少0%至22%的差异表达的基因。因此，LNA⑩修 饰的形式H siRNA提供最少数目的脱靶效应。实施例6修饰形式化的siRNA在细胞生物学研究中的性能进行细胞生物学研究以测量修饰形式和修饰核苷酸的类型影响由SiRNA引起的 中靶和脱靶表型的能力。为了确定修饰形式化的SiRNA是否保持“中靶”或期望的表型和减少“脱靶”或不 期望的表型，选择诱导可测量的并且高度表征的生物学应答的siRNA。因此，除了消除脱靶 表型以外，还监控中靶表型的保持。以测试修饰形式合成siRNA，将其转染入合适的细胞中 以如下所述进行测定。进行在本文中称为“生长测定”的测定以研究修饰形式化的siRNA与未修饰siRNA 和阴性对照siRNA相比在细胞水平上的差异。生长测定包括在以30nM和以3nM进行siRNA 转染后测量U20S骨肉瘤细胞系中细胞表型相关参数例如增殖、细胞凋亡和形态学。本文中 论述了来自30nM的测定的结果，因为在更高的siRNA浓度下观察到更多的脱靶效应，从而 消除此类脱靶效应的屏障(barrier)更高。生长测定分析包括下列抗原的免疫荧光检测， 所述抗原为指定的表型的标志物1.切割的核纤层蛋白A(细胞凋亡)，2.磷酸化的组蛋白H3 (有丝分裂)，3.微管蛋白(细胞骨架形态学，其为性质对照测量，即用于细胞结构的背景确定， 以及其标记所有细胞)，和4.HoeSCht染色(细胞核形态学，其提供细胞数目标准化)。使用IMAGEXPRESSMi。r。
自动化荧光显微镜(Molecular Devices, Toronto, Canada),利用计算机控制的图像获取软件(Cellinger，Munich, Germany)和 METAM0RPH 图像分析软件包(MolecularDevices，Toronto, Canada)驱动的 10X 物镜 采集免疫荧光。采集各384孔样品中的4个位点，计算3个生物学重复实验的数据的平均 值，将其与以相似方式处理的阴性siRNA对照样品(混杂的非靶向性siRNA)相比。在进行 图像分析后，根据下列方案评估数据1)指数计算对于孔中的各位点，针对细胞核的总数标准化有丝分裂细胞核和细 胞凋亡细胞核的数目，从总图像面积中减去非细胞背景的面积以计算细胞占据的面积，然 后针对细胞核的数目进行标准化；2)样品孔平均值计算计算孔中所有位点的平均值，此外，计算每块板所有阴性 对照孔的所有位点的平均值；3)标准化将一式三份重复的每一块板的样品和阳性对照针对阴性SiRNA对照孔 的平均值进行标准化；4) 一式三份重复的平均值计算就各处理和读数(readout)计算一式三份的板的 平均值。
选择在不同细胞中在功能上被良好表征的测试基因(根据公开的文献)。测试基 因包括表1的测试基因。表 1 鉴定提供可测量的预期表型(例如在Weel或PLKl的抑制后有丝分裂增加 300 % (Watanabe, N.等人(2004) PNAS, 101,4419-4424 ；Leach, S. D.等人(1998) Cancer Research,58,3132-3136 ；Cogswell, J. P.等人(2000)Cell Growth and Diff.ll， 615-623))的强诱导的siRNA。与Neg对照相比，BUBlB基因的抑制预期减少有丝分裂的百 分比(Lampson，Μ· A.禾口 Kapoor，Τ· Μ· (2004)Nature Cell Biology, 7，93—98)。此外，鉴定展示脱靶表型的siRNA。例如，针对LDLR(预期不诱导细胞凋亡的基因) (关于其他此类基因，参见表1)的siRNA显示增加细胞凋亡500%。此类siRNA序列用作 确定修饰形式是否可提高siRNA的特异性的工具。产生具有可观察的中靶表型和脱靶表型 的siRNA的分开的组以包含几种修饰形式以及2' -0-甲基修饰的核苷酸或具有上述结构 (a)的LNA 残基，其中Rl是0，R2是0，并且R3是CH2。就中靶和脱靶表型检测此类修饰 的siRNA以确定可消除脱靶效应同时保持中靶表型的修饰形式。在图10A至图10E、图IlA至图11F、图12C至图12D、图13C至图13D、图15A至 15D和图16A至图16D中以箱须图的形式，将修饰形式化的siRNA的基于细胞的测定结果作 图，以与在基于细胞的测定中平行分析的阴性对照siRNA处理的样品的标准化的值(在所 述图中标记为Neg)相比较。图10A提供了由于具有LNA 修饰形式E、F、G、H、J、K、M和0的siRNA产生的沉默而引起的标准化的有丝分裂细胞的箱线图。siRNA靶向BUB1B、WEEK⑶C2、⑶K2、CASP3 和CCND1 (这些基因对有丝分裂表型具有迥然不同的效应)。即，该组基因包括当被沉默时 增加有丝分裂的亚组，当被沉默时减少有丝分裂的亚组以及当被沉默时预期对有丝分裂没 有作用的亚组。由于此类迥然不同的效应，分析其抑制提供了预期的有丝分裂减少的表型 的基因亚组，数据提供于图10B中。图10B数据显示在靶向基因(BUB1B、⑶C2、CCND1)的siRNA的转染后标准化的 有丝分裂细胞，所述基因的抑制预期减少有丝分裂(Lampson，M. A.和Kapoor，T. M. (2004) Nature Cell Biology, 7,93-98 ；Harborth,J.等人(2001) Journal of Cell Science 114， 4557-4565 ；Klier，M. (2008) Leukemia, EPUB) 因此，这些数据测量了中靶表型效应，即，该 测定确保修饰形式化的siRNA对功能性siRNA的组“无害”。Neg对照处理的样品的标准化 的值显示大约1.0的中值。未修饰形式A siRNA提供了大约0.55的中值，这表示有丝分裂 减少大约2倍。与Neg对照相比，所有修饰形式都减少了有丝分裂。具有修饰形式H和J的 siRNA在它们对有丝分裂的影响上与未修饰形式A相比，提供了统计学上显著的差异(较少 的中靶效应)，如通过Wilcoxon值以及有丝分裂的中值偏离未修饰形式A所证明的。因此， 与图8的关于mRNA抑制的结果相一致，基于细胞的测定显示形式J与高度功能性的siRNA 的期望的特征不相容。基于细胞的生长测定还通过定量来自展示切割的核纤层蛋白A的细胞的荧光信 号测量与Neg对照处理的样品相比的细胞凋亡(Rao,L.等人(1996) J Cell Biology, 135, 1441-1455)。历史上，在基因组范围的siRNA筛选实验中观察到的最普遍的预料之外的表 型是细胞死亡。在用于此类研究的该siRNA集合中，包括了已知其诱导预料之外的细胞死 亡的siRNA序列，这样的siRNA序列用作确定修饰形式是否可消除不希望的细胞表型的工 具。图10C提供了定量由于用具有LNA 修饰形式E、F、G、H、J、K、M和0的siRNA处 理U20S细胞而产生的细胞凋亡片段的结果。阴性对照siRNA处理的样品用于确定siRNA转 染后细胞凋亡的基线，将数据标准化为1. 0。该集合中的siRNA靶向下列基因BUB1B、CDC2、 CCNDUWEEUCASP 3和⑶K2 ( —组基因靶，其一个亚组的抑制预期增加细胞凋亡，其一个亚 组的抑制预期对细胞凋亡没有作用)。由于此类迥然不同的效应，分析其抑制提供了预期的 细胞凋亡增加的表型的基因亚组，数据提供于图10D中。图10D提供了在靶向TOE1的siRNA转染后U20S细胞中细胞凋亡测量的结果。TOE1 的抑制预期增加细胞凋亡(Watanabe,N.等人(2004) PNAS, 101, 4419-4424 ；Leach, S. D.等 人(1998) Cancer Research，58，3132-3136)。因此，这些数据测量了中靶表型效应，即，该 测定确保修饰形式化的siRNA对功能性siRNA的组“无害”。Neg对照siRNA处理的样品用 于确定标准化的细胞凋亡的基线。靶向WEE1的形式A的未修饰siRNA与NEG处理的样品 相比展示大约7. 5的中值，从而提供了预期的表型变化。具有形式J和K的修饰形式化的 siRNA通过以统计学上显著的方式减少细胞凋亡的量(当与未修饰形式A siRNA相比时) 来减少中靶表型，从而证明形式J和K削弱了 siRNA的性能。这些数据与图8的关于由具 有修饰形式J和K的siRNA产生的抑制的数据相一致。图10E的数据提供了修饰形式化的siRNA消除基因亚组(其抑制预期对细胞凋 亡没有作用)的脱靶表型的能力的分析。特别地选择已在经验上证实细胞凋亡脱靶效应的siRNA来进行研究以确定这样的siRNA，当被修饰形式化时，是否消除或减少脱靶效应。 siRNA具有脱靶效应可通过未修饰形式A的箱线图(与Neg对照相比，其具有增加的中值和 更大的数据分布)来证明(图10E)。研究的siRNA具有形式A、E、F、G、H、J、K、M和0，靶 基因(其抑制预期不诱导细胞凋亡)包括BUB1B、CCND1、OTK2和⑶C2。将Neg对照处理的 群体用于确定细胞凋亡的基线。具有形式G、H、J和K的siRNA显示统计学上显著的消除脱 靶效应的能力，如与未修饰形式A相比更低的细胞凋亡信号所证明的(图10E)。根据图IOD的数据(其中具有修饰形式J和K的siRNA显示削弱了 siRNA的中靶 功效)和根据图8的数据(其中具有修饰形式G、J和K的siRNA显示削弱了抑制活性)， 形式G、J和K似乎对功能性siRNA “有害”。通过使用含有2' 0-甲基化的残基而非LNA 残基的修饰核苷酸进行修饰形式 的进一步表征，以确定其他类型的修饰是否可降低siRNA的脱靶效应。图IlA提供了由于 具有2' -0-甲基修饰形式H和K并且靶向TOE1、PLK1、FDFT1、LDLR和SC5DL(这些基因对 有丝分裂表型具有迥然不同的效应)的siRNA产生的沉默而引起的标准化的有丝分裂细胞 的箱线图。即，该组基因包括当被沉默时增加有丝分裂的亚组，和当被沉默时预期对有丝分 裂没有作用的亚组。由于这些迥然不同的效应，分析其抑制提供了预期的有丝分裂增加的 表型的基因亚组，数据提供于图IlB中。图IlB提供了在靶向TOEl或PLKl的siRNA转染(通过具有2' _0_甲基修饰形式 H禾口 K的siRNA)后U20S细胞中有丝分裂测量的结果。WEEl或PLKl的该沉默导致U20S细 胞中有丝分裂增加，这由 Watanabe，N.等人((2004)PNAS，101,4419-4424)，Leach，S. D.等 人((1998) Cancer Research, 58, 3132-3136)和 Cogswell，J. P.等人((2000) Cell Growth and Diff，11,615-623)提出，并且由具有未修饰形式A的siRNA (其诱导了与Neg对照处理 的样品相比增加大约4倍的有丝分裂)的数据证实。因此，这些数据测量了中靶表型效应， 艮口，该测定确保修饰形式化的siRNA对功能性siRNA的组“无害”。如图IlB的数据所显示 的，使用具有2 ‘ OMe修饰形式H和K的siRNA观察到相似水平的对有丝分裂的影响。该研 究证明形式H和K中的2‘ OMe修饰对功能性siRNA无害。为了确定具有2' OMe修饰形式H和K的siRNA是否可减少脱靶效应，将靶向基因 亚组(FDFT1、SC5DL和LDLR)(所述基因亚组的抑制预期对有丝分裂没有作用)的siRNA转 染入U20S细胞，然后测定对有丝分裂的影响。然而，特别地选择已在经验上证实有丝分裂 脱靶效应的siRNA来进行研究以确定这样的siRNA，当被修饰形式化时，是否消除或减少脱 靶效应。图IlC提供了数据。siRNA具有脱靶效应可通过未修饰形式A的箱线图(与Neg 对照相比，其具有更大的数据分布)来证明(图11C)。当比较单独的siRNA序列时，在形式 H中具有2' OMe残基的siRNA降低了在未修饰siRNA形式A中观察到的许多脱靶表型。在 形式K中具有2' OMe残基的siRNA，与未修饰siRNA相比，提高了中值有丝分裂影响。然 而，关于形式H和K中该2' -0-甲基修饰的数据与未修饰形式A的数据在统计学上没有显
者差升。图IlD提供了定量由于用具有2' -0-甲基修饰形式H和K的siRNA处理U2 0S细 胞而引起的细胞凋亡片段的结果。Neg对照siRNA处理的样品用于确定siRNA转染后细胞凋 亡的基线，并且将数据标准化为1.0。该集合中的siRNA靶向基因TOEl、PLKl、FDFTl、LDLR 和SC5DL，所述基因的一个亚组的抑制预期增加细胞凋亡，所述基因的一个亚组的抑制预期对细胞凋亡没有作用。由于这些迥然不同的效应，分析其抑制提供了预期的细胞凋亡增加 的表型的基因亚组，数据提供于图IlE中。图IlE提供了在靶向TOEl和PLKl的siRNA转染(通过12个具有2' _0_甲基修 饰形式H和K的siRNA的组)后U20S细胞中细胞凋亡测量的结果。因此这些数据测量了 中靶表型效应，即，该测定确保修饰形式化的siRNA对功能性siRNA的组“无害”。Neg对照 siRNA处理的样品用于确定标准化的细胞凋亡的基线。靶向WEEl或PLKl的形式A的未修 饰siRNA展示与NEG处理的样品相比细胞凋亡的中值增加大于大约4倍，从而提供了预期 的表型变化。对于以形式H和形式K存在的2' OMe修饰的siRNA观察到相似水平的细胞 凋亡。该研究表明H和K形式中的2' OMe修饰不降低siRNA的功效并且提供与在未修饰 siRNA形式A中观察到的表型相似的表型。图IlF的数据提供了 2' -0-甲基修饰形式化的siRNA消除一组基因(FDFT1、LDLR 和SC5DL)(其抑制预期对细胞凋亡没有作用)的脱靶表型的能力的分析。特别地选择已在 经验上证实细胞凋亡脱靶效应的siRNA来进行研究以确定这样的siRNA，当被修饰形式化 时，是否消除或减少脱靶效应。研究的siRNA具有形式A、H和K。Neg对照处理的群体用 于确定细胞凋亡的基线，所述群体具有范围特别宽的细胞凋亡结果。对照形式A的中值与 Neg对照处理的样品的中值相似。当评估单独的siRNA序列时，在修饰形式H和K中具有 2’ OMe修饰核苷酸的siRNA减少在未修饰siRNA形式A中观察到的许多脱靶表型，但在测 试群体中，未以统计学上显著的方式观察到脱靶效应的减少。 检测另外的修饰形式(如提供了形式!1、!1-2、!1-1、!1+1、0、￥、￥-1、￥-2和1(的图IA 至图IC的示意图中所示)。LNA 修饰核苷酸具有结构(a)，其中Rl和R2是0，R 3是CH2, R4和R5是如本文中描述的siRNA中的核苷酸的位点所确定的。就图12C的siRNA修饰形 式在U20S细胞中进行针对有丝分裂的中靶表型测定(即，“无害”测定)。如图12C的数据 所显示的，未修饰siRNA，与Neg对照处理的细胞相比，在siRNA处理的细胞中显示有丝分裂 增加大约2倍。以这些形式存在的LNA 修饰的修饰形式化的siRNA的中靶性能对预期的 表型没有负面影响。修饰形式H在表型上提供了统计学上显著的增加。图12D提供了关于消除图12C的具有LNA 修饰形式的siRNA的脱靶效应的数 据。由于具有未修饰形式A和具有LNA 修饰形式H、H+l、H-I、H-2、K、Q、V、V-I和V-2的 siRNA沉默一组基因靶(其抑制预期对细胞凋亡没有作用)(FDFT1、LDLR或SC5DL)而产生 的标准化的细胞凋亡片段的箱线图。阴性对照(Neg)是混杂的非靶向性siRNA，对于所述混 杂的非靶向性siRNA，将细胞凋亡的定量标准化为1. 0的值。然而，特别地选择已在经验上 证实细胞凋亡脱靶效应的siRNA来进行研究以确定这样的siRNA，当被修饰形式化时，是否 消除或减少脱靶效应。siRNA具有脱靶效应由未修饰形式A的箱线图(与Neg对照相比， 其具有增加的中值和更大的数据分布)来证明。在消除不希望的细胞凋亡表型上最有效的 修饰形式是形式H、K、Q和V-2，而修饰形式H-2、H-1、H+1、V和V-I，当与未修饰siRNA相比 时，不以任何统计学显著性改变细胞凋亡片段的测量值。对于修饰形式H、H-l、K和V，由2' OMe核苷酸修饰的siRNA在基于U20S细胞的 测定中对中靶表型也没有负面影响，如图13C的数据所显示的。图13C提供了由于具有未 修饰形式A和具有拥有2' -0-甲基修饰的核苷酸的所述修饰形式的siRNA沉默一组基因 靶(WEE1和PLK1)而引起的标准化的有丝分裂细胞的箱线图，所述基因靶的抑制预期增加有丝分裂。该测定是“无害”测定。未修饰siRNA显示与Neg对照处理的样品相比大约2倍 的有丝分裂中值，如所预期的。修饰形式化的siRNA的数据显示具有2' OMe修饰核苷酸的 siRNA在基于细胞的测定中对预期的表型不具有负面影响。图13D提供了由于具有未修饰形式A的siRNA和具有拥有2' _0_甲基修饰核苷 酸的修饰形式H、H-1、V和K的siRNA沉默一组基因靶(FDFT1、SC5DL或LDLR)而引起的标 准化的细胞凋亡片段的箱线图，所述基因靶的抑制预期对细胞凋亡没有作用。然而，特别地 选择已在经验上证实细胞凋亡脱靶效应的siRNA来进行研究以确定这样的siRNA，当被修 饰形式化时，是否消除或减少脱靶效应。siRNA具有脱靶效应可由未修饰形式A的箱线图 (与Neg对照相比，其具有更大的数据分布)来证明。对于每一种形式，siRNA的组包含13 个不同的siRNA。具有2‘ OMe修饰形式的siRNA没有一个提供与未修饰对照形式A具有 统计学上显著差异的数据，从而证明2' OMe修饰形式化的siRNA保持与对于未修饰形式A siRNA观察到的脱靶效应相同的脱靶效应。研究与形式H的修饰形式和图1D中所示的修饰形式相似的另外的修饰形式。图 15A提供了关于在形式A、H、M、W、W+1、W-1、Y、Y+1和Y_1中具有LNA 修饰核苷酸的siRNA 的标准化的有丝分裂细胞的箱线图。选择siRNA的组来抑制BUB1B、CCND1和CDC2mRNA以 产生预期的U20S细胞有丝分裂指数的减少。因此这些数据测量中靶表型效应，即，该测定 确保修饰形式化的siRNA对功能性siRNA的组“无害”。如图15A的数据所提供的，用未修 饰形式A siRNA处理的样品的有丝分裂中值，与Neg对照siRNA处理的样品相比，显示有丝 分裂减少至大约0. 75。&BSH、M、W+1、W-1、Y-1和Y+1存在的修饰形式化的siRNA不显 著改变此类siRNA对有丝分裂的影响，从而证明此类修饰形式“无害”。然而，修饰形式Y和 W减少预期的siRNA的中靶影响，从而证明此类修饰形式干扰中靶功能。图15B如图15A —样提供了关于CASP3的箱线图，CASP3的抑制预期不影响有丝 分裂。然而，特别地选择已在经验上证实有丝分裂脱靶效应的siRNA来进行研究以确定这 样的siRNA，当被修饰形式化时，是否消除或减少脱靶效应。siRNA具有脱靶效应可由未修 饰形式A的箱线图(与Neg对照相比，其具有大约0.7的中值)来证明。具有修饰形式H、 W、W+1、W-1、Y和Y+1的siRNA逆转了形式A的siRNA显示的脱靶效应。具有形式M和Y-1 的siRNA的修饰不逆转形式A siRNA的脱靶表型。对于图15B的数据，没有一个Wilcoxon 值的p < 0. 05，这可能是由于每一个形式中siRNA的群体较小。图15C提供了关于靶向TOE1基因(其抑制预期增加细胞凋亡)的一组siRNA (形 式A、H、M、W、W+l、W-l、Y、Y+1和Y-1)的标准化的细胞凋亡片段的箱线图。未修饰形式A siRNA，与Neg对照siRNA处理的样品相比，显示大于4. 0的细胞凋亡中值，从而证明由于 WEE1抑制，细胞凋亡强烈增加。因此检测数据测量中靶表型效应，即，该测定确保修饰形式 化的siRNA对功能性未修饰siRNA的组“无害”。如图15C的数据所提供的，具有修饰形式 H、M和W-1的siRNA,与形式A相比，显示相似的细胞凋亡增加，然而形式W、W+l、Y、Y+1和 Y-1，与未修饰siRNA形式A相比，显示更小的对细胞凋亡的影响。对于图15C的数据，没有 一个Wilcoxon值的p < 0. 05，这可能是由于每一个形式中siRNA的群体较小。尽管对细胞 凋亡的影响减小，但化学修饰形式W、W+l、Y、Y+1和Y-1保持抑制靶mRNA(图14A)和诱导 细胞凋亡的能力(与Neg对照siRNA处理的样品相比)。图1叨提供关于具有修饰形式々、1^、1、1+1、1-1、￥、￥+1和￥-1的siRNA沉默一组基因靶(其抑制预期不影响细胞凋亡)的标准化的细胞凋亡片段的箱线图。该组中的 siRNA靶向BUB1B、CCND1、⑶C2或⑶K2。然而，特别地选择已在经验上证实细胞凋亡脱靶 效应的siRNA来进行研究以确定这样的siRNA，当被修饰形式化时，是否消除或减少脱靶效 应。siRNA具有脱靶效应可由非修饰形式A的箱线图(与Neg对照相比，其具有大于3.5的 中值和更大的数据分布)来证明。与形式A相比，由具有形式H、Y和Y+1的siRNA产生的 沉默显示统计学上显著的对脱靶效应的逆转。研究图1E中所示的另外的siRNA修饰形式。将siRNA转染入U20S细胞，如本文 中所述测量有丝分裂效应。图16A提供了关于具有未修饰形式A和具有LNA 修饰形式H、 M、JB1、JB2、JB 3、JB4和JB5的siRNA的标准化的有丝分裂细胞的箱线图。选择siRNA的 组(3个siRNA/靶mRNA)来抑制BUB1B、CCND1和CDC2mRNA以产生预期的U20S细胞有丝分 裂指数的减少。因此，这些数据测量了中靶表型效应，即，该测定确保修饰形式化的siRNA 对功能性siRNA的组“无害”。如图16A的数据所提供的，用未修饰形式A siRNA处理的样 品的有丝分裂中值，与Neg对照siRNA处理的样品相比，显示有丝分裂减少至大约0.75。以 形式H、M、JB1、JB2、JB4和JB5存在的修饰形式化的siRNA没有显著改变siRNA对有丝分 裂的中靶影响，从而证明此类形式能被siRNA耐受。然而，具有修饰形式JB3的siRNA显著 减少了预期的靶向这些基因的siRNA的中靶影响，从而证明形式JB3干扰中靶功能。图16B如图16A—样提供了修饰形式(针对基因靶CASP3，其抑制预期不影响有丝 分裂)的箱线图。然而，特别地选择已在经验上证实有丝分裂脱靶效应的siRNA来进行研究 以确定这样的siRNA，当被修饰形式化时，是否消除或减少脱靶效应。siRNA具有脱靶效应 可由未修饰形式A的箱线图(与Neg对照相比，其具有大约0. 65的中值，从而展示有丝分 裂的减少)证明。修饰形式H、JB1、JB2、JB4和JB5能够逆转此类脱靶效应，如图16B的数 据所证明的。修饰形式M和JB3没有减少靶向CASP3的siRNA的脱靶表型，从而证明此类 形式在消除脱靶表型上是无效的。对于图16B的数据，没有一个Wilcoxon值的p<0.05， 这可能是由于每一个形式中siRNA的群体较小。图16C提供了由于具有修饰形式A、H、M、JB1、JB2、JB 3、JB4和JB5的siRNA沉 默基因靶WEE1 (其抑制预期增加细胞凋亡)而产生的标准化的细胞凋亡片段的箱线图。因 此这些数据测量了中靶表型效应，即，该测定确保修饰形式化的siRNA对功能性siRNA的 组“无害”。如图16C的数据所提供的，用未修饰形式A siRNA处理的样品的细胞凋亡中值， 与Neg对照siRNA处理的样品相比，显示细胞凋亡增加至大于4. 0，从而显示由于WEE1抑 制，细胞凋亡强烈增加。具有修饰形式的siRNA诱导预期的表型至不同的程度，从而证明 所有测试的形式对功能性siRNA的组无害。对于图15B的数据，没有一个Wilcoxon值的p < 0. 05，这可能是由于每一个形式中siRNA的群体较小。图16D如图16(—样提供了关于在形式々、1^、邛1、邛2、邛3、邛4和邛5中具有 LNA修饰的核苷酸的siRNA的修饰形式(针对包括BUBlB、CCNDl、raC2和⑶K2的基因靶的 组，所述基因靶的抑制预期对细胞凋亡没有作用)的箱线图。然而，特别地选择已在经验上 证实细胞凋亡脱靶效应的siRNA来进行研究以确定这样的siRNA，当被修饰形式化时，是否 消除或减少脱靶效应。siRNA具有脱靶效应可由未修饰形式A的箱线图(与Neg对照处理 的样品相比，其具有大于3的增加的中值和更大的数据分布)证明。如图16D的数据所显 示的，当与形式A的脱靶效应相比时，具有修饰形式H、JB1、JB2、JB3、JB4和JB5的siRNA能够以统计学上显著的方式逆转细胞凋亡脱靶效应。具有形式M的siRNA不能将细胞凋亡 效应逆转至统计学上显著的程度。总的来说，图10E、11C、11F、12D、13D、15B、15D、16B和16D的数据显示提供预料之 外的脱靶表型效应的减少的修饰形式包括形式G、H、J、K、Q、V-2、Y、Y+l、JB1、JB2、JB 3、 JB4和JB5。在这些修饰形式中，形式G、J和K对功能性siRNA抑制活性的能力“有害”。高 度功能性的siRNA具有减少脱靶表型效应的性质，并且在抑制活性方面“无害”。给功能性 siRNA提供这样的功能性的修饰形式包括形式H、Q、V-2、Y、Y+1、JB1、JB2、JB 3、JB4和JB5。就链型效应(图4E、6C、7B、12A、13A、本文实施例3的数据)和就它们减少脱靶效 应的能力(如上文所提供的)对这些修饰形式进行研究，以评估是否可根据链型测定来预 测修饰形式化的siRNA在脱靶效应的消除中将起什么样的作用。使用经典报告子测定获得 的实施例3的链型数据显示，可预期修饰形式E、G、H、K、0和M在细胞表型测定中表现良好。 事实上，这些形式中有3个形式确实表现良好，但它们中有3个表现不良。因此，链型测定 似乎在预测修饰形式化的siRNA在获得期望的细胞表型上是否具有功能中是无效的。实施例7稳定的修饰形式化的siRNA本实施例提供了修饰形式化的siRNA，其除了上述保持抑制活性且消除脱靶效应 的性质外，还对暴露于含有核酸酶的生物学液体特别稳定。Elmen等人(Nucleic Acids Research 33 1，439-447，2005)报导描述了称为siLNA5的稳定的siRNA，其具有与本文中 的形式F相同的修饰形式并且该形式用作参照对照用于本实施例的稳定性研究。术语“对 暴露于生物学液体是稳定的”，如本文中所使用的，是指siRNA在含有核酸酶的生物学液体 存在的情况下保持它们的全长，以与暴露于相同生物学液体且进行相同时间的具有修饰形 式F的siRNA相比，相同或更大的程度。虽然本实施例提供了稳定的修饰形式，但之前的实施例提供的修饰形式化的 siRNA适合用于其中几乎不用考虑核酸酶活性的环境中。 关于形式F，来自实施例6和图10E的数据显示具有修饰形式F的siRNA在消除脱 靶细胞效应中基本上是无效的。 对8个不同的靶向CLTC和TOE lmRNA的siRNA进行研究以确定在90%的小鼠血 清中赋予siRNA稳定性的修饰形式。如实施例1中所述，针对下面描述的和图1F至图1K 所示的修饰形式进行siRNA的合成。形式修饰的位点(从各链尔J5'末端开始编号
过客序列引导序列
A，对照无无
F(E lmen 等人)1,20,2120,21
H1,2,13，14无
DH211,2,13，1420,21
DH201,2,13，1419,20,21
DH31,2,13，14,20,21无
DH301,2,13，14，19,20无
DH351,2,13，14,2021CN 10849008 A说明书
对于每一个测定，将10 ii M的修饰形式化的siRNA以50 i L终体积于37°C下在 90%的小鼠血清中温育，进行时间曲线(图17)中所指定的时间或进行5小时的时间(图
5318A 至图 23B)。平行于血清中的温育，用 PBS(cat#9625，Applied Biosystems, Austin, TX) 处理每一组的siRNA，进行与血清处理的样品相同的时间以确定用于HPLC研究的全长产物 的量的基线。在温育后，用酚(cat#9700, AppliedBiosystems, Austin, TX)抽提 siRNA,然 后在 5iig 糖原载体(liU/试管，产品编号 AM9510，Applied Biosystems, Austin, TX)存 在的情况下用乙醇沉淀以增加小RNA的回收。通过离心(以15，OOOxg进行15分钟)回收 siRNA和切割产物，然后在进行HPLC分析之前将其溶解于PBS缓冲液(磷酸盐缓冲的盐溶 液)中。使用离子交换高效液相色谱(HPLC)，利用连续梯度的含有乙腈的高氯酸钠 (NaC104)确定全长产物的量。固定相是与Waters 2795 ALLIANCE 分析HPLC系 统和 EMPOWER Dissolution Software v2 (Waters Corp, Milford, MA) 一起使用的 DionexDNAPAC 200 柱子(4mm X 250mm, Dionex Corporation, Sunnyvale, CA)。保持 温度以使siRNA双链体不变性。利用Waters 2998光电二极管阵列检测器(Waters Corp, Milford, MA)在254nm处进行定量和UV检测。将10 ii 1-20 u 1注射体积中的靶向GAPdH 的mRNA的siRNA(在各末端上具有2个3'悬突核苷酸的21聚体双链体)(10 u M)用于确 定柱子质量和保留时间。HPLC结果的分析基于未处理的siRNA的峰的总面积(areacount) (当作100% )和血清处理的样品的相同保留时间(+/-0. 1-0. 2分钟)的峰的总面积(提 供了计算的剩余的百分数)。分别就内源基因的抑制活性检测用于血清稳定性检测的相同siRNA以确定修饰 形式是否改变siRNA抑制其mRNA靶的功效。如实施例4所述(除了在厂商描述的“正向” 方案中，转染使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)以外)，以 5nM 的终浓度 将修饰形式化的siRNA和未修饰对照siRNA转染入Hela细胞。在收获转染细胞后，按照厂 商的方案，使用TaqMan Gene Expression Cells-to-CT 试剂盒(Applied Biosystems, Inc. Cat. #AM1728)分离总细胞裂解物。如实施例4中所述进行cDNA的制备、基因表达测定 和抑制活性的计算。图17的数据显示本研究的8个不同siRNA的未修饰形式在血清中降解，其中在暴 露于血清5至10分钟内，50%以上的全长分子降解。对于未修饰形式A、稳定性对照形式F和修饰形式H、DH21、DH20、DH3、DH30、DH35、 DH6、DH34和DH2，图18A提供了当在描述的条件下用90%的血清处理5小时时，保持全长 的siRNA的百分比的箱线图。在描述的条件下，未修饰形式A和修饰形式H在血清中被完 全降解。在描述的条件下，稳定性参照对照形式F在血清中具有大约43%的全长siRNA的 中值。图18A的数据的分析表明只在一个3'-末端上的和/或其附近的核苷酸的修饰不 足以在血清中保护修饰的siRNA(形式DH21、DH20、DH 3和DH 30，与形式F相比)。两个或 三个悬突核苷酸的修饰也不足以在血清中保护修饰的siRNA(形式DH6、DH 34和DH 35，与 形式F相比)。所有4个悬突核苷酸都被修饰的形式DH2在血清中提供了等于或好于形式 F的保护作用。图18B提供了图18A中研究的siRNA的mRNA抑制(表示为Neg对照的百分 比)的箱线图。如由图18B所显示的，未修饰形式A siRNA展示了与Neg对照siRNA处理 的样品相比大约85%的中值抑制。siRNA修饰形式DH20，与形式H的抑制活性相比，特别地 显示抑制活性的降低。这该组研究的修饰形式中，只有形式DH2由于其稳定性和抑制活性 而被考虑用于进一步的分析。
在有义链的3'末端的倒数第二和倒数第三位中提供两个修饰的核苷酸且在反义 链的两个或三个末端残基中提供修饰的核苷酸(DH4、DH31、DH19)似乎对血清稳定性具有 不利作用，如图19A所显示的。这些数据进一步支持将修饰核苷酸安置为悬突核苷酸。此 外，如图19B的数据所显示的，形式DH19、DH27和DH25，与形式A相比，显示抑制活性的显著 降低。形式DH 31具有大于70%的抑制活性。保护内部残基(如DH27(位点7)和DH25 (位 点6和9))而让末端残基不受保护，在抑制活性方面产生相反效果(当将数据与形式DH2 的数据相比时)。图20A提供的数据显示与对照形式F相比，修饰形式DH47和DH29的稳定性增加， 且DH18的稳定性甚至进一步增加。除了悬突位点和形式H的位点中的修饰核苷酸外，修饰 形式DH47和DH29在有义链序列的倒数第三和倒数第四位中的一个位点(即，对于21聚 体，位点18和19之一)上提供修饰核苷酸。形式DH18提供了与DH29 —样的修饰核苷酸， 此外，在反义链的倒数第三个位点(即，对于21聚体，位点19)上提供了修饰核苷酸。形式 DH28的数据，当直接与形式DH 29相比时，再次显示反义链的悬突位点上修饰核苷酸的缺 乏破坏了受保护的有义链提供的稳定性。当与形式F相比时，形式DH47和DH28的数据具 有p < 0. 05的Wilcoxon值。图20B的数据显示形式DH47、DH29和DH28具有大于70%的 抑制活性。反义链的倒数第三个位点(位点19)的修饰(如形式DH18)，虽然提供了增强的 稳定性，但将抑制活性削弱至大约60%的中值。基于上述数据，形式DH47和DH29都提供了 超过对照形式F的增加的siRNA的稳定性，形式DH47提供了与未修饰形式A相当的抑制活 性，形式DH29提供了大于70%的抑制活性。图21A中描述的具有修饰形式的siRNA没有一个提供超过具有修饰形式F或形式 DH2的siRNA的增加的血清稳定性。增加的血清稳定性的缺乏进一步支持其中悬突核苷酸 被修饰的修饰形式。图21A中研究的siRNA的抑制活性的数据都显示大于70%的活性，如 图21B所显示的。图22A的具有修饰形式F的siRNA的血清稳定性与具有修饰形式DH23、DH48、 DH49、DH44和DH45的siRNA的血清稳定性的比较进一步支持悬突核苷酸的位点上的修饰 核苷酸。除了在悬突核苷酸的位点上具有修饰核苷酸外，反义链的位点2上的核苷酸的修 饰(例如形式DH1和DH7)增加了血清稳定性的中值(图22A)。图22B的数据显示图22A 的所有形式化的siRNA，除了形式DH23外，都获得大于70%的抑制活性。总的来说，除了悬 突核苷酸的位点外，在引导链的位点2上具有修饰核苷酸的形式DH1和DH7提供了血清稳 定性和抑制活性的性质。具有修饰形式DH7的siRNA在位点13和14上以及其附近的位点 上缺乏修饰的核苷酸，因而可能不提供消除脱靶效应的性质。然而，这样的siRNA可在其中 不预期脱靶效应的环境中用于沉默。图23A提供的数据检查除了形式H和悬突位点上的修饰核苷酸外在反义链的位点 1、2、3、4、5、6或7(位点#1是5'核苷酸)上的一个核苷酸修饰(分别地DH38、DH1、DH 39、 DH40、DH41、DH42、DH43)的效应。数据显示所有检测的形式化的siRNA都增加中值血清稳 定性，并且随着修饰核苷酸进一步远离引导反义链的5'末端，稳定性倾向于减小。如图23B的数据所提供的，除了具有形式DH38的siRNA以外，所有形式化的siRNA 具有大于70%的抑制活性。该观察结果突出了位于反义链的5'末端的修饰核苷酸的不相 容性。将磷酸基团添加至反义链的5'末端部分地拯救了生物学活性，但以减小的稳定性为代价(数据未显示)。总的来说，关于血清稳定性和抑制活性的数据显示在引导反义链的位 点2、3、4、5、6或7(参照5'末端)上的至少一个核苷酸修饰增强了 siRNA稳定性同时还提 供了至少70%的抑制活性。结合图18A至图23B的数据，提供大于形式F的血清稳定性同时保持至少70%的 抑制活性的修饰形式是形式 DH47、DH29、DH7、DH1、DH 39、DH40、DH41、DH42 和 DH43。形式DH7在位点13和14上以及其附近的位点上缺乏修饰的核苷酸，因而可能不 提供消除脱靶效应的性质。形式DH47、DH29、DH1、DH 39、DH40、DH41、DH42 和 DH43 在过客有义链中在位点 1、 2、13、14、20、21上以及对于DH47和DH29，在位点18或19之一上具有修饰的核苷酸；且在 引导反义链中在位点20和21上以及对于DH39至DH43，在位点2、3、4、5、6或7的任一个上 具有修饰的核苷酸。其中在过客有义链的位点1上的两个核苷酸都被修饰的双链化碱基对 显示对抑制活性是不利的(DH20、DH19、DH4、DH18)。实施例8稳定siRNA的体内递送体内递送未修饰形式A siRNA和具有修饰形式DH1和DH47的稳定siRNA，并且 比较存在于对照动物和测试动物的肝中的全长siRNA的量。将允许siRNA和miRNA的 可靠和有效定量并且只特异性检测全长分子的基于TaqMan 的茎-环rt-pcr测定 (TaqMan basedstem-loopRT-PCR assay)用于分析(2004 年 9 月 21 日提交的属于 Chen 等人的美国公开专利申请 2005/0266418 ;Chen，C.等人 Nucleic AcidsResearch 33， e 179，2005)。如Zhang等人(HumanGene Thera py 10，1735-1737. 1999)和Lewis等人(Nature Genetics 32，107-108. 2002)所述，使用水动力(hydrodynamic)(高压)尾静脉注射对小鼠 施用靶向Fas基因的siRNA(lnmol，稀释于2.5ml PBS中(10%的小鼠体重))。针对每一个 修饰形式化的siRNA注射4只小鼠。修饰的核苷酸是具有结构(a)的LNA 残基，其中R1 是0，R2是0且R 3是CH2。注射后5分钟时，杀死小鼠，收获完整肝脏，将其冷冻于干冰中。按照具有如下改 进的厂商的方案，使用mirVanaTMPARIS 试剂盒(Applied Biosystems,Foster City，CA)从 完整肝脏分离总RNA。加入细胞裂解缓冲液(Cell disruption buffer) (20ml)，并将样品勻 浆。将裂解物(400 yl)转移至新管中，向各管中加入变性溶液(400 yl)，通过涡旋充分混 合管。通过加入800 u 1酚，涡旋5分钟，离心10分钟来进行酚抽提。将上层相(300 yl)转 移入新管中并且与375 u 1 (1. 25倍体积)的100%乙醇混合。按照试剂盒的方案，将混合物 通过过滤柱，使用100 yl洗脱缓冲液进行终洗脱。测量RNA的浓度并且将其调整至10ng/
li lo用于定量siRNA的测定包括使用具有茎-环设计的RT引物逆转录(RT) siRNA的引 导链，如对于 TaqMan MicroRNA ReverseTranscription Assays(Applied Biosystems, Foster City, CA)所描述的，然后进行PCR。在10 yl RT反应中，将lng/ u 1的总RNA和 50nM的RT引物在85°C下变性5分钟，然后在60°C下进行5分钟，然后在4°C下退火。在加 入酶混合物(0. 25mM各dNTP，终浓度；3. 33个单位/yl的MultiScribe 逆转录酶(Applied Biosystems), IX RT缓冲液，0. 25个单位/ yl的RNA酶抑制剂)后，将反应混合物在16°C下温育30分钟，在42°C下温育30分钟，在85°C下温育5分钟，然后在4°C下温育。在Applied Biosystems 7900HT 序列检测系统(AppliedBiosystems)上使用标准TaqMan PCR 方案 进行实时PCR。10 μ 1 PCR反应混合物包含1 μ 1 RT产物、IX TaqMan Universal PCR
下温育10分钟，然后进行40个循环95°C下进行15秒和在60°C下进行1分钟。在勻浆之前，用300、200、100和50pmol的siRNA给来自分开的对照未处理组的小鼠的冷冻完整肝脏加料(spike)。此类“加料的”样品用作研究的对照并且提供用于比较注 射的样品与对照样品之间的循环阈值(Ct)的标准曲线。如上所述从对照器官分离RNA。术 语“Ct”表示当信号首次被记录为统计学上显著的时，PCR循环的次数。因此，Ct值越低，核 酸靶的浓度越高。在TAQMAN 测定中，通常各循环几乎倍增PCR产物的量，因此，如果不 存在对反应的抑制并且反应对于纯化的核酸几乎100%有效，那么荧光信号应当加倍。图24提供了“加料的”对照、未修饰形式A注射的动物以及形式DHl和形式 DH47siRNA处理的动物的Ct值。在水动力注射后5分钟在肝中检测到大约5%的未修饰形 式A SiRNA0相比之下，检测到大约20%的具有形式DHl和DH47的修饰形式化的siRNA，与 未修饰siRNA相比，400%的增加。该体内研究显示为了稳定而进行修饰形式化的siRNA在 全身性施用后提供了显著增加的全长siRNA的递送。本文中已广泛地和一般地描述了本教导的组合物、方法和试剂盒。落在一般公开 内容内的每一个更窄的种类和亚属(sub-generic)分类也形成了本教导的部分。这包括带 有条件或负向限制(从该属中除去任何主题物质，无论去除的物质是否明确地在本文中引 用)的本教导的一般描述。虽然已通过参考不同应用、方法和组合物描述了公开的教导，但应当理解可进行 各种改变和修饰而不背离本文中的教导。前述实施例用于更好地说明本教导而非意欲限定 本文的教导的范围。可根据下列权利要求进一步理解本教导的某些方面。
权利要求
一种化学合成的过客(有义)寡核苷酸，其具有15至30个核苷酸的长度并且包含不依赖于序列的修饰形式(1)、不依赖于序列的修饰形式(2)和不依赖于序列的修饰形式(3)中的一个(1)5′Np-m-m-Nx-m-m-Nq-nr3′，其中p为0或1；x为7、8、9、10或11；r为0、1或2；以及q是表示过客链的长度减去(p+x+r+4)的整数；(2)5′Np-m-m-Ny-m-Nz-m-Nq-nr3′，其中p为0或1；y为7、8或9并且z为1；或y为7并且z为2或3；r为0、1或2；以及q是表示过客链的长度减去(p+y+z+r+4)的整数；(3)5′m-N1-m-Nx-m-m-Nq-nr3′，其中x为8、9或10；r为0、1或2；以及q为表示过客链的长度减去(x+r+5)的整数；其中，各m独立地是二环核苷酸或三环核苷酸；各n独立地是脱氧核苷酸、修饰的核苷酸或核糖核苷酸；当m是二环核苷酸时，各N独立地是除了二环核苷酸外的核苷酸，和当m是三环核苷酸时，各N独立地是除了三环核苷酸外的核苷酸。
2.包含权利要求1的过客(有义)寡核苷酸和引导(反义)寡核苷酸的化学合成的 短干扰RNA，所述引导(反义)寡核苷酸具有15至30个核苷酸，与至少12个核苷酸的过客 (有义)寡核苷酸连续互补的区域；引导链还与靶mRNA的至少一部分具有互补性。
3.权利要求2的化学合成的短干扰RNA，其中所述过客(有义)寡核苷酸包含不依赖 于序列的修饰形式(1)，？为0，乂为10且1~为2。
4.权利要求2的化学合成的短干扰RNA，其中所述过客(有义)寡核苷酸包含不依赖 于序列的修饰形式(1)，P为0，χ为9或11且r为2。
5.权利要求2的化学合成的短干扰RNA，其中所述过客(有义)寡核苷酸包含不依赖 于序列的修饰形式(2)，ρ为0，y为9且r为2。
6.权利要求2的化学合成的短干扰RNA，其中至少一个m具有结构(a)、(b)或(c) 其中Rl和R2独立地是O、S、CH2或NR，其中R是氢或C"-烷基；R3 是 CH2、CH2-O, CH2-S, CH2-CH2, CH2-CH2-CH2, CH-CH 或 CH2-NR,其中 R 是氢或(^3-烷基；R4和R5独立地是核苷间的连接、末端基团或保护基团； R4和R5中至少一个是核苷间的连接；和 B是核碱基、核碱基衍生物或核碱基类似物。
7.权利要求6的化学合成的短干扰RNA，其中所述过客(有义)寡核苷酸包含不依赖 于序列的修饰形式(1)，P为0，χ为10，r为2，并且各m具有结构(a)，其中Rl是0，R2是O 且 R3 是 CH2。
8.权利要求6的化学合成的短干扰RNA，其中所述过客(有义)寡核苷酸包含不依赖 于序列的修饰形式(1)，P为l，x为9或10，r为2，并且各m具有结构(a)，其中Rl是0，R2 是0且R3是CH2。
9.权利要求6的化学合成的短干扰RNA，其中所述过客(有义)寡核苷酸包含不依赖 于序列的修饰形式(3)，χ为9或10，r为2，并且各m具有结构(a)，其中Rl是0，R2是0且 R3 是 CH20
10.权利要求2的化学合成的短干扰RNA，其中所述过客(有义)寡核苷酸和所述引导 (反义)寡核苷酸通过核苷酸环或连接体环共价连接，从而形成短发夹寡核苷酸。
11.权利要求2的化学合成的短干扰RNA，其中所述SiRNA的各3'末端独立地具有1 个、2个或3个核苷酸的悬突。
12.权利要求2的化学合成的短干扰RNA，其中至少一个核苷间的连接不是磷酸二酯核 苷间连接。
13.权利要求2的化学合成的短干扰RNA，其中所述化学合成的短干扰RNA进一步与靶 向细胞的配体结合。
14.权利要求2的化学合成的短干扰RNA，其中用磷酸盐/酯、Ch2-烷基、CH2-烷基胺、 CV12-烯基、C1^12-炔基、CV12-环烷基、C1^12-芳烷基、芳基、酰基或甲硅烷基取代基进一步衍 生5'末端。
15.包含权利要求2的化学合成的短干扰RNA和生物学上可接受的载体的组合物。
16.包含权利要求2的化学合成的短干扰RNA和转染剂的试剂盒。
17.使关于通过RNA干扰抑制靶基因表达的脱靶事件减少至最少的方法，该方法包括 将含有靶基因的细胞与足以减少脱靶事件同时保持效力的量的权利要求2的化学合成的 短干扰RNA接触。
18.权利要求17的方法，其中所述基因是内源基因。
19.权利要求17的方法，其中所述接触是含有所述细胞的细胞培养物或含有所述细胞 的组织与所述化学合成的短干扰RNA的体外接触。
20.权利要求17的方法，其中所述接触是含有所述细胞的组织、含有所述细胞的体液 或含有所述细胞的器官与所述化学合成的短干扰RNA的离体接触。
21.权利要求17的方法，其中所述接触是含有所述细胞的器官或动物与所述化学合成 的短干扰RNA的体内接触。
22.在通过RNA干扰抑制外源提供的靶基因的表达中使由过客链产生的切割减少至最 少的方法，该方法包括将含有所述靶基因的细胞与足以使过客链产生的切割减少至最少 同时保持引导链的效力的量的化学合成的短干扰RNA接触，所述短干扰RNA包含过客(有义)寡核苷酸，其具有15至30个核苷酸的长度，并且包含如下的不依赖于序 列的修饰形式(1)、不依赖于序列的修饰形式(2)和不依赖于序列的修饰形式(3)中的一 个(1)5'Np-m-m-Nx-m-m-Nq-nr3 ‘，其中 ρ 为 O 或 1 ;x 为 7、8、9、10 或 11 ;r 为 O、1 或 2 ； 并且q是表示过客链的长度减去(p+x+r+4)的整数；(2)5‘ Np-m-m-Ny-m-Nz-m-Nq-nr 3'，其中 ρ 为 O 或 l;y 为 7、8 或 9 并且 ζ 为 1;或 y 为7并且ζ为2或3 为0、1或2 ；并且q是表示过客链的长度减去(p+y+z+r+4)的整数；(3)5'm-Nrm-N.-m-m-N,-!!, 3'，其中 χ 为 8、9 或 10 ;r 为 O、1 或 2 ；并且 q 为表示过 客链的长度减去(x+r+5)的整数；其中各m独立地是2'-修饰的核苷酸； 各η独立地是脱氧核苷酸、修饰的核苷酸或核糖核苷酸； 各N独立地是未修饰的核苷酸； 禾口引导(反义)寡核苷酸，其具有15至30个核苷酸，与至少12个核苷酸的过客(有义) 寡核苷酸连续互补的区域；引导链还与靶mRNA的至少一部分具有互补性。
23.权利要求22的方法，其中所述2'-修饰的核苷酸的2'修饰包括H、溴、氯、碘、 氟、阿拉伯糖构象中的氟(FANA)、SH、NH2, CN、叠氮化合物或OR、R、SR、NHR或N(R)2，其中R 是烷基、烯基、炔基、烷氧基、氧烷基、烷氧基烷基或烷基胺，其中烷基部分是C1-C6。
24.短干扰RNA，其包含过客(有义)寡核苷酸，其具有17至30个核苷酸的长度并且包含不依赖于序列的修 饰形式(4)、形式(5)和形式(6)中的一个(4)5'mp-Nx-m-m-Nq-nr3'，其中当 ρ 为 0 时，χ 为 12 ；当 ρ 为 1 时，χ 为 11 ；当 ρ 为 2 时，χ为10 ；当ρ为3时，χ为9 ；当ρ为4时，χ为8 ;r为0、1或2 ；以及q是表示过客链的 长度减去(P+x+r+2)的整数；(5)5'm-m-Nx-m-Nq-nr3'，其中χ为11 ;r为0、1或2 ；以及q是表示过客链的长度减 去(x+r+3)的整数；(6)5 ‘ mp-Ny-m-Nz-m-Nq-nr3 ‘，其中 ρ为 3;y 为9并且ζ 为 l;r 为0、1 或2;以及 q为 表示过客链的长度减去(p+y+z+r+2)的整数；和引导(反义)寡核苷酸，其具有17至30个核苷酸，与至少12个核苷酸的过客(有义) 寡核苷酸连续互补的区域；引导链还与靶mRNA的至少一部分具有互补性； 其中各m独立地是二环核苷酸、三环核苷酸或2'-修饰的核苷酸；各η独立地是脱氧核苷酸、修饰的核苷酸或核糖核苷酸，且为悬突核苷酸；当m是二环核苷酸时，各N独立地是除了二环核苷酸外的核苷酸，当m是三环核苷酸时，各N独立地是除了三环核苷酸外的核苷酸，和当m是2' _修饰的核苷酸时，各N独立地是除了 2' _修饰的核苷酸外的核苷酸。
25.权利要求24的短干扰RNA，其中所述过客(有义)寡核苷酸具有不依赖于序列的修饰形式(4)，p为2，x为10，r为2， 各η是悬突核苷酸，并且各η独立地是修饰的核苷酸，所述引导(反义)寡核苷酸包含2个3'-悬突修饰的核苷酸，和 各修饰的核苷酸独立地是二环核苷酸、三环核苷酸或2'-修饰的核苷酸。
26.权利要求25的短干扰RNA，其中所述过客寡核苷酸的3'倒数第三个位点和3'倒 数第四个位点中的至少一个是修饰的核苷酸。
27.权利要求25的短干扰RNA，其中当长度为17个核苷酸时，所述引导寡核苷酸的位点2和3中的至少一个是修饰的核苷酸；当长度为18个核苷酸时，所述引导寡核苷酸的位点2、3和4中的至少一个是修饰的核 苷酸；当长度为19个核苷酸时，所述引导寡核苷酸的位点2、3、4和5中的至少一个是修饰的 核苷酸；当长度为20个核苷酸时，所述引导寡核苷酸的位点2、3、4、5和6中的至少一个是修饰 的核苷酸；和当长度为21-30个核苷酸时，所述引导寡核苷酸的位点2、3、4、5、6和7中的至少一个 是修饰的核苷酸。
28.权利要求24、25、26或27的短干扰RNA，其中所述过客(有义)寡核苷酸的至少一 个m具有结构(a)、(b)或(c) 其中Rl和R2独立地是O、S、CH2或NR，其中R是氢或C"-烷基；R3 是 CH2、CH2-O、CH2-S、CH2-CH2、CH2-CH2-CH2、CH = CH 或 CH2-NR,其中 R 是氢或 C1^-烷基；R4和R5独立地是核苷间的连接、末端基团或保护基团； R4和R5中至少一个是核苷间的连接；和 B是核碱基、核碱基衍生物或核碱基类似物。
29.权利要求24、25、26或27的短干扰RNA，其中各修饰的核苷酸具有结构(a) 其中Rl和R2独立地是0、S、CH2或NR，其中R是氢或C"-烷基；R3 是 CH2、CH2-O、CH2-S、CH2-CH2、CH2-CH2-CH2、CH = CH 或 CH2-NR,其中 R 是氢或 C1^-烷基；R4和R5独立地是核苷间的连接、末端基团或保护基团； R4和R5中至少一个是核苷间的连接；和 B是核碱基、核碱基衍生物或核碱基类似物。
30.包含权利要求24至29中任一项的短干扰RNA和生物学上可接受的载体的组合物。
31.在有此需要的受试者中减少关于通过RNA干扰抑制靶基因表达的脱靶事件的方 法，该方法包括将所述受试者与足以减少脱靶事件同时保持效力的量的权利要求25至30 的任一项的短干扰RNA接触。
32.权利要求31的方法，其中接触是通过血管内注射的施用。
33.一种方法，其包括获得权利要求26或27的短干扰RNA，其中各修饰的核苷酸具有结构(a) 其中Rl和R2独立地是O、S、CH2或NR，其中R是氢或C"-烷基；R3 是 CH2、CH2-O, CH2-S, CH2-CH2, CH2-CH2-CH2, CH-CH 或 CH2-NR,其中 R 是氢或(^3-烷基；R4和R5独立地是核苷间的连接、末端基团或保护基团； R4和R5中至少一个是核苷间的连接；和 B是核碱基、核碱基衍生物或核碱基类似物 禾口将所述短干扰RNA体内施用至有此需要的受试者；其中在施用后，与缺乏修饰的核苷酸的短干扰RNA的量相比，体内存在更大量的所述 短干扰RNA。
全文摘要
提供了siRNA的具有修饰核苷酸的修饰形式。本文中提供的具有修饰形式和修饰核苷酸的短干扰RNA在内源基因的RNA干扰中减少脱靶效应。已证明另外的修饰形式化的siRNA对于富含核酸酶的环境是稳定的。出人意料地，增加或保持链偏向性，虽然是保持内源RNA干扰的效力所必需的，但不足以在细胞生物学测定中减少脱靶效应。
文档编号C12N15/113GK101849008SQ200880113683
公开日2010年9月29日 申请日期2008年9月17日 优先权日2007年9月19日
发明者A·乌拉索夫, C·博内特, I·查尔斯, N·普瑞, S·马格达雷诺 申请人:应用生物系统有限公司