专利名称：绿豆黄色花叶病印度病毒(mymiv)的嵌合构建体和其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域。更特别地,本发明涉及绿豆黄色花叶病印度病毒(Mungbean Yellow Mosaic India Virus, MYMIV)毒性克隆的构建体和其用途。
背景技术：
绿豆黄色花叶病的特征是被感染植物的叶上具有亮黄色花斑，该疾病造成绿豆 (Vigna radiata)作物的大量损失。黄色花叶病是五种重要豆类作物的主要危害黑吉豆 (Black gram)、绿豆、菜豆(French bean)、木豆和大豆。其造成每年约3亿美元的损失。大 豆是一种主要的豆类作物。取决于严重程度,其高度易患黄色花叶病并造成21-86%的产量 损失。经鉴定，该疾病的病原体为绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV),其是双粒病毒组和菜 豆金色花叶病毒属(Begomoviruses)家族的成员。在印度，该病毒通过粉虱传播。该疾病 的症状包括小的黄色散在的斑点，该斑点的融合使得叶完全变黄。新生的叶显示黄色花斑 和斑纹。与大多数二连的双粒病毒相似，MYMIV的遗传物质为两条单链共价闭环DNA。该 DNA被命名为DNA-A和DNA-B，每个约2. 7kb的大小。DNA A主要编码4个蛋白，所述蛋白在 复制和转录两种DNA成分中起重要的作用。DNA B只编码两个蛋白，所述蛋白帮助病毒颗粒 的移动。它们在成熟植物细胞细胞核中通过双链DNA中间物复制。为了研究许多这些二连菜豆金色花叶病毒的生物学过程,为了筛选群体中的抗性 品种，需要用病毒感染植物。为了这一目的，已经幵发了许多感染方法，如⑴在粉虱(烟粉 虱(B. tabaci))的帮助下从被感染的植物传播至未感染植物，(2)向健康植物机械接种来 自被感染植物的纯化病毒或病毒DNA 二聚体，及(3)接种具有在Ti质粒中的DNA A和DMA B的部分或完整二聚体的农杆菌属混悬剂。粉虱介导的接种是用于感染植物的最早方法。但是一些重要的二连菜豆金色花叶 病毒不能通过粉虱传播至其他宿主，并且感染的频率低，因为其取决于粉虱。另外，保存纯 的含有病毒的粉虱储存液是非常不方便的和有害的；完全可控制地将昆虫引入植物是困难 的。在粉虱介导的感染中，筛选种子种群也不是完全可靠的；因为抗性可针对粉虱本身产生 (Grimsley,N. ,Hohn,B. ,Hohn,T.禾口 Walden,R. (1986) · "Agroinfection",an alternative route for viral infection of plants by usingthe Ti plasmid. Proc. Ncitl. Acad. Sci. USA 83 :3282-3286)。为了克服使用昆虫载体进行病毒接种的困难,早期研究中也测试了机械方法。这 些方法包括通过机械损伤向未感染的植物接种纯化病毒或DNA A和B的二聚体(Etessami， P.，Ccillis, R.，Ellwood, S.，Stanley , J.，(1988). Delimitation of essential genes of cassava latent virusDNA 2. Nucleic Acid Res. 16,481.1-4829)。在少数植物如番茄中， 可通过使用这些方法获得100%的感染。但是结果不乐观。对于不能通过机械传播的其它 病毒如玉米条纹病毒、甜菜曲顶病毒和南瓜叶卷曲病毒，需要有效的感染方法(Stanley, J.，Markham, P. G.，Callis, R. J. , Pinner, Μ. S. , (1986). The nucleotide sequence of aninfectious clone of thegeminivirus beet curly top virus. EMBO J. 5,1761-1767)。因为大多数双粒病毒不能通过机械传播，所以发现新方法如农杆菌介导的接种 是用这些病毒人工感染植物的可靠和合适的方法(Grimsley, N.，Hohn, B.，Hohn, T.和 Walden, R. (1986) “Agroinfectionan alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83 :3282_3286)。通过使用 该方法，用番茄金色花叶病毒接种了牵牛花(Petunia)植物(Rogers, S. G.，Bisaro, D. M.， Horsch, R. B.，Fraley, R. T.，Hoffmann, N. L.，Brand, L.，Elmer, J. S.禾Π Lloyd, Α. Μ. (1986) Tomato golden mosaic virus A component DNAreplicates autonomously in transgenic plants. Cell 45 =593-600)。这是对二连菜豆金色花叶病毒的农杆菌接种的第一个报道。 该方法使用了农杆菌通过重组从细菌细胞向植物染色体转移其Ti质粒DNA的能力(Wang, K；Herrera-Estrella, L ；Van Montagu, M；Zambryski, P. Right 25bp terminus sequence of the nopaline T—DNA is essential for anddetermines direction of DNA transfer from agrobacterium to the plantgenome. Cell. (1984)Sep ；38 (2) :455_462)。通常，为了用MYMIV感染植物，将二连菜豆金色花叶病毒DNA A和DNA B的部 分二聚体或完整二聚体克隆入两个单独Ti质粒的T-DNA中，并引入单独的农杆菌培养 物。这两个农杆菌培养物(具有DNA A的二聚体和DNA B的二聚体)等量混合并用于植 物接种，称为农杆菌共接种(co-Agroinoculation)。在T-DNA重组和转移至植物染色体 后，单位长度的双粒病毒基因组在病毒和植物蛋白的帮助中下释放。该方法广泛用于许 多菜豆金色花叶病毒如番茄金色花叶病毒、绿豆黄色花叶病毒、绿豆黄色花叶病印度病毒 (Katoor S.Usharani,Bali ji Surendranath,Qazi Μ· R. Haq禾口Varagur G.Malathi(2005), Infectivity analysis of a soybean isolate of Mungbean yellowmosaic India virus by agroinoculation. J Gen Plant Pathol 71 :230_237)和马铃薯黄色花叶病毒和木薯花 叶病毒。在二连菜豆金色花叶病毒的农杆菌接种方法的改进版本中，将DNA A和DNA B 的部分串联重复序列克隆至两个单独的Ti质粒DNA上，并将其引入相同的农杆菌细 胞并用于植物的接种(Jacob S S, Vanitharani R, Karthikeyan A S, Chinchore Y, Thillaichidambaram P 禾口 Veluthambi K(2003)Mungbean yellow mosaic virus-Vi agro infect ion bycodel ivery of DNA A and DNA B from one Agrobacterium strain ； PlantDis. 87247-251)。近期的对MYMIV感染大豆植物的研究通过用混合的农杆菌培养物(单独含 有DNA A和DNA B的部分二聚体)接种植物进行。发现感染的最大效率只有21 % (Katoor S. Usharani, Baliji Surendranath, Qazi M. R. Haq ^P Varagur G. Malathi(2005) Infectivity analysis of asoybean isolate of Mungbean yellow mosaic India virus by agroinoculation. J. Gen. Plant Pathol. 71 =230-237)。因此，需要更好的用绿豆花叶病 印度病毒(MYMIV)感染植物的系统,该系统给出用病毒感染植物的更高的效率。
发明内容
本发明涉及绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)毒性克隆的构建体和其用途。本发 明提供了含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的DNA A和DNA B 二聚体的重组构建体、重组载体和宿主细胞。本发明的一个具体实施方式
提供了在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病 毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B 二聚体的重组DNA构建体。本发明的另一个具体实施方式
提供了在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度 病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B 二聚体的重组DNA构建体,其中DNA A的多核苷酸 序列如SEQ ID N0:11或SEQ ID N0:13中所列，DNA B的多核苷酸序列如SEQ ID NO: 12或 SEQ ID NO 14 中所列。本发明的另一个具体实施方式
提供了在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度 病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B 二聚体的重组载体。本发明的另一个具体实施方式
提供了在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度 病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B 二聚体的重组载体,其中DNA A的多核苷酸序列如 SEQ ID NO :11 或 SEQID NO 13 中所列，DKA B 的多核苷酸序列如 SEQ ID KO :12 或 SEQ ID NO 14中所列。本发明的一个具体实施方式
提供了含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的 MYMIV DNA A 二聚体的重组载体,其中DNA A的多核苷酸序列如SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO 13中所列。本发明的另一个具体实施方式
提供了含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的 MYMIV DNA B 二聚体的重组载体，其中DNA B的多核苷酸序列如SEQ ID N0:12或SEQ ID NO 14中所列。本发明的另一具体实施方式
提供了在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病 毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B 二聚体的重组植物转化载体,其中DNA A的多核苷酸 序列如SEQ ID NO 11中所列，DNA B的多核苷酸序列如SEQ ID NO 12中所列。本发明的另一个具体实施方式
提供了在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度 病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B 二聚体的重组植物转化载体，其中DNA A的多核苷 酸序列如SEQ ID NO 13中所列，DNA B的多核苷酸序列如SEQ ID NO 14中所列。本发明的另一个具体实施方式
提供了含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的 MYMIV DNA A 二聚体的重组植物转化载体，其中DNA A的多核苷酸序列如SEQ ID NO 11中 所列。本发明的另--个具体实施方式
提供了含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的 DNA B 二聚体的重组植物转化载体，其中DNA B的多核苷酸序列如SEQ ID NO 12中所列。本发明提供在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B 二聚体的重组宿主细胞,其中宿主细胞选自大肠杆菌(E.coli)或农杆菌。本发明还提供含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B 二 聚体的植物细胞。本发明的另一个具体实施方式
提供了一种筛选绿豆黄色花叶病印度病毒抗性/ 耐受植物的方法，该方法使用在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的 MYMIV DNA A和DNA B 二聚体的重组DNA构建体或重组载体。本发明进一步提供了一种筛选绿豆黄色花叶病印度病毒抗性/耐受植物的方法， 该方法使用在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNAB 二聚体的重组DNA构建体或重组载体,其中DNA A的多核苷酸序列如SEQ ID NO=Il中所 列，DNA B的多核苷酸序列如SEQ ID NO 12中所列。在一个具体实施方式
中，本发明提供了如SEQ ID NO 11中所列的多核苷酸序列。在另一个具体实施方式
中，本发明提供了如SEQ ID NO :12中所列的多核苷酸序在另一个具体实施方式
中，本发明提供了具有如SEQ ID NO :1至SEQ ID N0:10所 列的核苷酸序列的寡核苷酸。令人惊讶地，据发现，机械接种含有重组DNA构建体(在单个Ti质粒中含有绿豆 黄色花叶病印度病毒的DNA A和DNA B 二聚体)的农杆菌培养物可以在MYMIV易感植物中 增加病毒感染频率达90%至100%。本发明提供的在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的DNA A 和DNA B 二聚体的重组DNA构建体、载体和宿主细胞可以用作以病毒感染植物的高价值系本发明提供的在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的DNA A 和DNA B 二聚体的重组DNA构建体、载体和宿主细胞可以用于以病毒感染植物，以从病毒易 感植物筛选病毒抗性/耐受植物而鉴定病毒抗性植物。本发明提供的在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的DNA A 和DNA B 二聚体的重组DNA构建体、载体和宿主细胞还可以用于标记MYMIV的抗性标记。克隆全长MYMIV DNA A来自MYMIV感染的大豆(Glycine max)植物的有症状叶的总DNA通过CTAB方法 制备。其它本领域已知的方法也可以用于分离DNA。通过使用具有如SEQ ID NO=I和SEQ ID NO :2所列的核苷酸序列的引物序列以聚合酶链反应扩增全长MYMIV DNA A。Afll:GGATCCATTGTTGAACGACTTTCC SEQ ID NO 1Af 12 (iGATCCCACATTGTTAGTGGGTTC SEQ IDNO 2通过使用(3956bp)ZeroBlunt TOPO PCR Cloning 试剂盒(Invitrogen)将获得 的2747bp扩增产物直接克隆进入pCR4Blunt-T0P0质粒载体，将因此获得的重组载体命名 为pT0P0A(6703bp)。将重组载体pTOPOA引入大肠杆菌的感受态细胞Ι)Η5 菌株。本领域 熟知的方法也可用于在合适的克隆载体中克隆片段以获得重组载体。可以使用本领域已知 的方法在大肠杆菌或其它宿主细胞中进行重组载体的转化。具体的过程在实施例1中提含有DNA A串联重复序列克隆(二聚体)的重组载体ρΤ0Ρ0Α2的构建通过在原始克隆pTOPOA中进一步克隆全长DNA A片段构建MYMIV DKA A的串联重 复序列(二聚体)。因此获得的重组载体被命名为只含有一个有效BamHI位点的pTOPOA’。 将从重组载体pTOPOA消化获得的PstI小片段在PstI限制性位点上克隆入载体pTOPA，从 而获得全长DNA A。因此获得的重组载体被命名为具有一个BamIiI限制性位点的pTOPOAl。 将BamHI消化的DNA A的第二个片段克隆入ρ ΡΟΑΙ的BamHI位点从而获得含有全整DNA A 二聚体的重组载体ΡΤ0Ρ0Α2。请参考实施例2。相似地,构建包含具有如SEQ ID Ν0:13所 列的核苷酸序列的DNA A的重组载体，该重组载体被命名为pT0P0C2。克隆全长MYMIV DNA B
利用CTAB方法制备来自用MYMIV感染的大豆(Glycine max)植物的有症状叶的 总DNA。其它本领域中已知的方法也可以用于分离DNA。通过使用具有如SEQ ID NO :3和 SEQ ID NO :4所列的核苷酸序列的引物序列以聚合酶链反应扩增全长MYMIV DNA B。Bf ll :CGGGATCCAATGATGCCTCTGGCAATTTGTG SEQ IDNO : 3Bfl2 CGGGATCCTGGAGATTCAATATCTCAG SEQ IDNO 4通过使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning 试剂盒(Invitrogen)直接将 2671bp 的扩增产物克隆入pCR4Bhmt T0P0质粒载体(3956)。因此获得的重组载体被命名为 pT()P0B(6627bp)。本领域熟知的方法也可以用于将片段克隆进入合适的载体。可以使用本 领域已知的方法在大肠杆菌或其它宿主细胞中进行重组载体pTOPOB的转化。在实施例3 中提供了具体的方法。通过限制性消化和PCR确认DNA B的克隆。通过使用本领域熟知的 方法进行DNA克隆的完全测序。DKA B的串联重复序列克隆(二聚体)的构建通过进一步将全长的DNA B片段克隆入重组载体pTOPOB构建DNA B的串联重复 序列(二聚体)。pTOPOB中的MYMIV DNA B插入片段有两个BamHI位点，一个在开头，另一 个在末尾。因此获得的重组载体被命名为PT0P0B2 (9298bp)。在实施例4中提供具体的方 法。相似地,构建了包含具有如SEQ ID NO :13所列的核苷酸序列的DNA B的重组载体,该 载体被命名为PT0P0D2。通过将MYMIV DNA A(A2)和MYMIV DNA B(B2)的全长串联重复序列(二聚体)克 隆入pCAMBIA载体构建双二聚体。通过EcoRI消化从重组质粒pT()P0B2中切出MYMIV DKA成分B的二聚体并克 隆入双元载体pCAMBIA 1305. 1 (Gambia,澳大利亚)的EcoRI消化的T-DNA区从而制备 PCAMBIAB2。为了将二聚体DNA A克隆入相同的T-DNA，需要在DNA A 二聚体的两个侧翼区 上引入SalI和SacI限制性位点。用对Τ0Ρ0侧翼DNA A 二聚体的序列特异的引物进行PCR 反应。将带有SalI位点的具有如SEQ ID NO :5所列的核苷酸序列的正向引物(Cf ll)和在 其5’末端带有SacI的具有如SEQ ID NO 6所列的核苷酸序列的反向引物(Cfl2)用于扩 增反应。具体过程在实施例5中有解释。Cfl1 :GGCGGATCCGTCGACAGCTCAGAATTAACCCTCACSEQ ID NO 5Cfl2 :GGCGGATCCGAGCTGTAG(;GCGAATTGAATTTAGCSEQ ID KO 6将双二聚体(pCAMBIAA2B2)克隆引入根癌农杆菌(Agrobact.eriumtumefaciens)利用冻融方法将pCAMBIA中的MYMIV DNA A和B的重复串联重复序列即质粒 PCAMBIAA2B2引入根癌农杆菌菌株EIIA105中。其它的方法如电穿孔也可以用于农杆菌转 化。携带DNA A和DNA B完整二聚体的重组农杆菌转化子被命名为MYMIVA2B2。利用PCR 和Southern印迹分析确认转化子存在DNA A和DNA B的串联重复序列。在实施例6中提 供具体的方法。其它的本领域中熟知的农杆菌菌株如LBA 4404和EHA 101也可以用于转 化。相似地，构建重组植物转化载体PCAMBIAC2D2,其中载体包含具有如SEQ ID NO : 13中 所列的核苷酸序列的MYMIV DNA A和具有如SEQ ID NO 14中所列的核苷酸序列的MYMIV DNA B的双二聚体。植物的农杆菌感染通过使用含有pCAMBIAA2B2质粒(含有DNA A和DNA B完整二聚体)的重组农杆
7菌细胞MYMIVA2B2并利用茎接种方法进行农杆菌接种。其它本领域中已知的方法也可以用 于植物的农杆菌感染。为了模拟接种，带有PCAMBIA载体的农杆菌培养物用作阴性对照。一 些植物只用YEB+乙酰丁香酮接种并保持在相同的条件下作为“未接种的对照”。在实施例 7中公开了具体的方法。通过使用DNA-A 和 DNA-B 特异性引物 CPl (SEQ ID NO 7)、CP2 (SEQ ID NO 8)和 BVl (SEQ ID NO 9)和BV (SEQ ID NO 10)并利用聚合酶链反应确认农杆菌接种的大豆植物 的农杆菌感染(实施例8)。CPl :GAAACCTCGGTTTTACCGACTGTATAG SEQ ID NO 7CP2 TTGCATACACAGGATTTGAGGCATGAG SEQ ID NO 8BV CACCGTCAAGAGGACGTTTACGTCTTC SEQ ID NO 9BV2 :AGGCTATGCATGGATATAAATGCATAG SEQ ID NO 10进行进一步的Southern杂交以确认各个病毒DNA整合入农杆菌感染的大豆植物。 Southern分析确认了各种病毒DNA形式整合入带有症状的农杆菌接种的植物(实施例9)。为了确认转基因的表达，进行了 ELISA。在实施例10中提供具体的方法。通过 使用针对外壳蛋白产生的多克隆抗体对叶的蛋白提取物进行ELISA测试。结果与PCR和 Southern印迹的结果相符。
图1 表示显示pCAMBIAA2B2构建的轮廓图。图2 显示来自农杆菌接种的大豆植物的CP (外壳蛋白)基因的PCR扩增。图3 显示从大豆植物中提取的总DNA的southern印迹分析,所述大豆植物用含 有PCAMBIAA2B2的农杆菌培养物进行农杆菌接种。用DNA-A的Rep蛋白基因片段作为探针。 还分析了模拟接种(M)和未接种(U)的植物。OC=开环的，Lin=线性的，SC=超螺旋的， SS =单链的。
具体实施例方式实施例应该理解，本文所述的下列实施例只 [是i
丨,各种针对性的 丨精神和范围内以及随附的权利
要求的范围内,
例
全长MYMIV DKA A的PCR扩增和克隆利用CTAB方法或本领域中已知的方法制备来自大豆(Glycinemax)植物的有症状 叶的总DNA。从已发表的序列设计具有重叠区(在其5’末端带有BamHI位点)的两套引物 用于DNA扩增，从而扩增全长MYMIV DNA Α。反应的条件为30个循环,解链、退火和聚合的 条件分别为94°C 80秒、55°C 1分钟和72°C 12分钟。用于扩增反应的引物(Afll和Α 2) 的核苷酸序列如SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2中所列。Afll GGATCCATTGTTGAACGACTTTCC SEQ ID NO 1Afl2 :GGATCCCACATTGTTAGTGGGTTC SEQ ID NO :2。
通过根据制造商说明书使用Pfu聚合酶(Stratagene)进行了扩增反应。其它本领 域中已知的聚合酶也可以用于所述DNA片段的扩增。通过使用(3956bp)Zero Blunt TOPO PCR Cloning试剂盒(Invitrogen)直接将扩增产物(2747bp)克隆入pCR4Blunt-TOPO质粒 载体,该载体被命名为ρ ΡΟΑ (6703bp),并引入大肠杆菌DH50中。本领域熟知的方法也可 以用于将片段克隆入合适的克隆载体从而获得重组载体。可以使用本领域中已知方法在大 肠杆菌或其它宿主细胞中进行重组载体的转化。在含氨苄西林(50μ g/ml)、X-gal (40 μ g/ml)和 IPTG (40 μ g/ml)的培养基上选择 含有重组载体的重组大肠杆菌菌株Ε>Η5 。通过使用Qiaprep(Qiagen)试剂盒并利用碱裂 解法纯化质粒DNA。本领域中熟知的方法可以用于分离质粒DNA。通过限制性消化和扩增方法确认DNA A克隆。通过本领域中已知的方法进行DNA 克隆的完全测序。实施例2含有DNA A的串联重复序列克隆(二聚体)的重组载体ρΤ0Ρ0Α2的构建通过进一步将DNA A的全长片段克隆入原始克隆ρΤΟΡΟΑ构建MYMIV DNA A的串联 重复序列(二聚体)。重组载体ρΤΟΡΟΑ中的MYMIV DNA A插入物有两个BamHI位点，一个在 开头，另一个在末尾。为了制备二聚体,一个BamHI:位点被无效掉，其它BamHI位点用于克隆 BamHI消化的第二个全长DNA A片段。简而言之,ρΤΟΡΟΑ的PstI消化释放了 1. 5kb (PstI小 片段)和5. 2Kb (PstI大片段)片段。自我连接大片段。因此获得的质粒被命名为ρΤΟΡΟΑ’ 并只含有一个有效BamIII位点。然后通过用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段处理而无 效BamHI位点。将从重组载体ρ ΡΟΑ消化获得的PstI:小片段在PstI限制性位点克隆入 载体pTOPA’，从而获得全长DNA A。因此获得的重组载体被命名为具有一个BamHI限制性 位点的pTOPOAl。将BamHI消化的DNA A的第二个片段克隆入ρΤΟΡΟΑ 1的BamHI位点，从而 获得含有DNA A完整二聚体的重组载体ΡΤ0Ρ0Α2。利用限制性分析检查pT0P0A2 (9450bp) 中DNAA的串联方向。实施例3全长MYMIV DNA B的PCR扩增和克隆利用CTAB方法制备来自用MYMIV感染的大豆植物有症状叶的总DNA。从已发表的 序列设计具有在其5’末端具有BaraHI位点的重叠区的两套引物，用于PCR反应从而扩增全 长MYMIV DNA B。反应条件为30个循环,解链、退火和聚合的条件分别为94°C 30秒、55° 1 分钟和72°C 12分钟。用于PCR反应的引物的核苷酸序列显示在SEQ ID NO 3 (Bfll)和SEQ ID NO :4(Bfl2)中。Bf ll :CGGGATCCAATGATGCCTCTGGCAATTTGTG SEQ IDNO 3Bfl2 CGGGATCCTGGAGATTCAATATCTCAG SEQ ID NO :4。根据制造商的说明书使用Pfu聚合酶(Stratagene)进行扩增反应。其它的本领域 中已知的聚合酶也可以用于所述DNA片段的扩增。通过使用Zero Blunt T0P0 PCR Cloning 试剂盒(Invitrogen)直接将扩增产物(2671bp)克隆入pCR4Blunt- Ρ0质粒载体(3956)。 因此获得的重组载体被命名为pT0P0B(6627bp)。本领域熟知的方法也可以用于将片段克隆 入合适的载体。可以使用本领域中的已知方法在大肠杆菌或其它宿主细胞中进行重组载体 PTOPOB的转化。
在含氨苄西林(50μ g/ml)、X_gal (40 μ g/ml)和 IPTG (40 μ g/ml)的培养基上选择 含有pTOPOB的重组大肠杆菌菌株DH50U通过使用Qiaprep试剂盒(Qiagen)并利用碱裂 解法纯化质粒DNA。本领域中熟知的方法可以用于分离质粒DNA。利用限制性消化和PCR确认DNA B的克隆。使用本领域熟知的方法进行DNA克隆 的完全测序。实施例4DNA B的串联重复序列克隆(二聚体)的构建通过进一步将DNA B的全长片段克隆入重组载体pTOPOB构建DNA B的串联重复序 列(二聚体)。pTOPOB中的MYMIV DNA B插入物有两个BamHI位点，--个在开头,另一个在 末尾。为了制备二聚体，一个BamHI位点被失效，其它的BamHI位点用于克隆BamHI消化的 第二个全长DNA B片段。pTOPOB的PstI消化给出2. 4kb的小片段和4. 3kb的大片段。自 我连接大片段。因此获得的质粒被命名为pTOPOB’并只含有一个有效BamHI位点。通过用 大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段处理使BamHI位点失效。将从pTOPOB获得的PstI小 片段重新插入pTOPOB’的PstI位点从而获得全长DNA B。因此获得的重组载体被命名为 pTOPOB 1并只含有一个BamIII位点。将BamIII消化的DNA B的第二个片段克隆入pTOPOB 1 的BamHI位点从而获得含有DNA B完整二聚体的重组载体pT()P0B2 (9298bp)。利用限制性 分析检查PT0P0B2中DNA B的串联方向。实施例5通过将MYMIV DNA A(A2)和MYMIV DNA B(B2)的完整串联重复序列(二聚体)克 隆入pCAMBIA载体构建双二聚体利用EcoRI消化从重组质粒pT0P0B2中切出MYMIV DNA成分B的二聚体，并克 隆入双元载体pCAMBIA 1305. 1 (Gambia,澳大利亚)的EcoRI消化的T-DNA区，从而制备 PCAMBIAB2。为了将二聚体DNA A克隆入相同的T-DNA，需要在DNA A 二聚体的两个侧翼区 引入SalI和SacI:限制性位点。用对 Ρ0侧翼DNA A 二聚体序列特异的引物进行PCR反 应。将带有SalI位点并具有如SEQ IDNO :5所列的核苷酸序列的正向引物(Cfll)和在其 5’末端带有SacI并具有如SEQ ID NO :6中所列的核苷酸序列的反向引物(Cfl2)用于扩 增反应。Cf ll :GGCGGATCCGTCGACAGCTCAGAATTAACCCTCACSEQ ID KO 5Cfl2 :GGCGGATCCGAGCTGTAGGGCGAATTGAATTTAGCSEQ ID NO 6用Pfu聚合酶进行聚合酶链反应。反应条件为30个循环，解链、退火和聚合的条 件分别为94°C 30秒，550C 1分钟和72V 15分钟。用SalI和SacI消化PCR产物，并将其 克隆入pCAMBIAB2的T-DNA中的Sa:[I-SacI位点。利用限制性消化检查获得的被命名为 PCAMBIAA2B2的克隆(22655bp,图1),并发现两个DNA A和DNA B 二聚体在相同的T DNA ____丨二，所述二聚体由质粒DNA的小片段(small stretch)分幵。还通过测序确认了克隆。实施例6将双二聚体(pCAMBIAA2B2)克隆引入根癌农杆菌利用冻融方法将pCAMBIA中的MYMIV DNA A和B的重复串联序列，即质粒 PCAMBIAA2B2,弓丨入根癌农杆菌菌株EHA105中。其它的方法如电穿孔也可以用于农杆菌的 转化。在1. 5ml离心管中将质粒DNA (1-3 μ g)加至100 μ 1的感受态农杆菌菌株ΕΗΑ105。将管在液氮中冷冻30秒。将管立即转移至37°C水浴中5分钟。将ImlYEB培养基(lg/L酵母 提取物、5g/L牛肉提取物、5g/L蛋白胨、5g/L蔗糖、2mM MgSO4)加至管中并在28°C保持2_3 小时，同时轻柔摇晃。在补充了卡那霉素(50μ g/ml)的YEB 琼脂培养基上选择克隆。携带 DKA A和DNA B的完整二聚体的农杆菌转化子被命名为MYMIVA2B2。利用PCR和Southern 印迹分析确认转化子存在DNAA和DNA B的串联重复序列。其它本领域熟知的农杆菌菌株如LBA 4404和EHA 101也可以用于转化。实施例7植物的农杆菌感染 将含有pCAMBIAA2B2质粒(含有DNA A和DNA B的完整二聚体)的重组农杆菌细 胞MYMIVA2B2在28°C、YEB培养基(pH7. 0)中培养过夜。在室温下将培养物在4000rpm离 心5分钟。获得的沉淀重悬于含有100 μ M乙酰丁香酮的YEB培养基(ρΗ 5.6)中。在无菌 蛭石中使大豆种子发芽直到两叶阶段。利用茎接种方法进行农杆菌接种，其中通过用30号 (30-gaze)针穿剌5_6次在大豆茎的生长结点区周围制造伤口。将约20 μ 1的农杆菌培养 物(MYMIVA2B2)置入伤口。对于模拟接种，具有pCAMBIA载体的农杆菌培养物用作阴性对 照。将植物保持在28°C的温室中。一些植物只用YEB+乙酰丁香酮接种并保持在相同的条 件下作为“未接种的对照”。MYMIV感染症状的出现测试六个大豆品种的农杆菌接种。在农杆菌接种10天后，在接种点上的第一个叶 上开始出现黄色花叶病症状。在接种的21天内，所有的新出现的叶都显现出密集的黄色花 斑。模拟接种和未接种的植物不显示症状。先前已知的野生MYMIV抗性品种UPSM用作对 农杆菌接种出现抗性的阳性对照。在表1和2中提供了利用单个质粒和分开质粒上的DNA A和DNA B的农杆菌接种而获得的MYMIV对大豆品种感染性的比较数据。表1 :利用单个质粒上的DNA A和DNA B的农杆菌接种获得的MYMIV对大豆品种 的感染性 表2 利用在分开的质粒上的DNA A和DNA B的农杆菌接种获得的MYMIV对大豆 品种的感染性 实施例8DNA 提取和 PCR利用CTAB方法从接种点上的三叶中提取总DNA。为了利用聚合酶链反应(PCR) 检查病毒DNA的存在，使用7 DNA-A和DNA-B的特异性引物CPl、CP2和BVl和BV。具有如 SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8中所列的核苷酸序列的引物CPl和CP2对应于DNA-A的外壳 蛋白基因，而具有如SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10中所列的核苷酸序列的引物BVl和BV2 对应于DNA-B的移动蛋白基因。在PCR反应后,对应于外壳蛋白基因的575bp条带和对应 于移动蛋白基因的652碱基对从农杆菌接种的植物中获得。从模拟接种的、未接种的或抗 性的植物中未获得PCR片段(图2)。CPlGAAACCTCGGTTTTACCGACTGTATAG SEQ ID NO -JCP2 TTGCATACACAGGATTTGAGGCATGAG SEQ ID NO 8BV CACCGTCAAGAGGACGTTTACGTCTTC SEQ ID NO 9BV2 :AGGCTATGCATGGATATAAATGCATAG SEQ ID NO 10实施例9Southern 杂交进行Southern杂交以确认各个病毒DNA在植物中的整合。约1 μ g的总DNA在 tris-乙酸缓冲液中、在的琼脂糖凝胶上进行电泳，转移至硝酸纤维素膜....Ll并用 32Ρ标 记的探针(用MYMIV外壳蛋白基因和移动蛋白基因的PCR片段制成)杂交。放射性标记的 探针利用随机引物标记方法或本领域中已知的方法产生。使用本领域中熟知的方法进行 Southern杂交。Southern分析确认了带有症状的农杆菌接种的植物中各种病毒DNA形式症状的植物中未发现相应的条带(图3)。实施例10利用ELISA进行检测使用双抗体夹心(Antibody-sandwich)ELISA检测来自受感染大豆植物的MYMIV 外壳蛋白。针对MYMIV的外壳蛋白产生多克隆抗体。通过将抗体稀释至包被缓冲液(0. IM NaHCO3 Ph 8. 6)，用该抗体制备捕获抗体。通过加入50 μ 1的包被缓冲液并在4°C孵育过夜 包被ELISA微量滴定板的每个孔。次日，用去离子水洗涤孔并在室温用50μ 1的3% BSA/ PBS封闭。1小时后，除去封闭溶液,将来自受感染叶的蛋白提取物加入孔中。在37°C孵育 微量滴定板1小时。在此之后,将蛋白提取物从孔中除去并用IOx PBS/吐温20(0. 05% ) 洗涤。现在，在10A BSA/PBS中以1 1000稀释度向每孔加入25 μ 1的第二抗体-碱性磷 酸酶共轭物。在37°C孵育微量滴定板1小时。1小时后，用IOx PBS/吐温20(0. 05% )洗 孔。向每个孔中加入底物溶液，在37°C使微量滴定板显色30分钟。根据上面的描述,本领域技术人员可以容易地确定本发明的本质特征，并且在没 有脱离本发明精神和范围的情况下，可以产生本发明的各种改变和修改从而使其适应各种 应用和条件。因此，其它的具体实施方式
也包括在下列权利要求的范围内。
权利要求
一种在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的DNA A和DNA B的二聚体的重组DNA构建体，其中DNA A的多核苷酸序列与如SEQ ID NO13中所列的核苷酸序列99％同一，并且DNA B的多核苷酸序列与如SEQ ID NO14中所列的核苷酸序列97％同一。
2.一种在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的MYMIV DNA A和DNA B的二聚体的重组DNA构建体,其中DNA A的多核苷酸序列如SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13中所列，并且DNA B的多核苷酸序列如SEQ ID NO 12或SEQID NO 14中所列。
3.一种含有根据权利要求1或权利要求2所述的重组DNA构建体的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体,其是植物转化载体。
5.一种含有根据权利要求2或权利要求3所述的重组载体的重组宿主细胞,其中宿主 细胞选自大肠杆菌、农杆菌或植物细胞。
6.一种通过使用根据前述权利要求任一项所述的重组DNA构建体或重组载体筛选绿 豆黄色花叶病印度病毒抗性/耐受植物的方法。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述重组构建体或重组载体包含具有如SEQID NO :11和SEQ ID NO 12中所列的核苷酸序列的多核苷酸。
8.一种具有如SEQ ID NO: 11中所列的核苷酸序列的多核苷酸。
9.一种具有如SEQ ID NO: 1.2中所列的核苷酸序列的多核苷酸。
10.具有如SEQID NO :1至SEQ ID NO 10中所列的核苷酸序列的寡核苷酸。
全文摘要
本发明提供了在单个Ti质粒中含有绿豆黄色花叶病印度病毒(MYMIV)的DNA A和DNA B的二聚体的重组DNA构建体、重组载体和宿主细胞。
文档编号C12N7/02GK101918561SQ200880125176
公开日2010年12月15日 申请日期2008年12月8日 优先权日2007年12月7日
发明者D·查托帕迪亚雅, R·K·亚达夫, R·K·舒克拉 申请人:国立植物基因组研究所