专利名称：诱导分泌表达生产重组葎草主要致敏蛋白Hum j 3的方法
技术领域：
本发明涉及一种在酵母系统高密度诱导分泌表达潷草花粉主要致敏蛋白的方法， 特别是一种在毕赤酵母(Pichia pastoris,KM71H)系统高密度诱导分泌表达潷草花粉主要 致敏蛋白的方法Hum j 3的方法以及工程菌。本发明属于基因工程药物和医学诊断制剂领 域，该蛋白可能在潷草花粉过敏反应疾病的临床分子诊断、变应原免疫治疗、工业生产以及 质控中发挥重要作用。
背景技术：
蔷薇亚纲大麻科一年生缠绕草本植物潷草(Humulus japonicus或Humulus scandens)，原产我国，广泛分布于远东地区，我国除新疆、青海以外的各省区均有分布，东 亚各国(朝鲜、日本、俄罗斯、越南)以及欧洲、美国西海岸地区亦有分布。上世纪八十年代 由北京协和医院牵头的第一次全国性气传致敏花粉调查中，在79个花粉收集点中有53个 点可收集到潷草花粉，仅次于蒿属花粉，其分布范围基本上覆盖全国，播散高峰为八、九月。 北京协和医院首次发现潷草花粉是我国夏秋季节仅次于蒿属花粉的重要致敏原，是导致临 床上出现变应性鼻炎、过敏性结膜炎、花粉性皮炎、季节性哮喘等花粉症症状的重要病因， 很大程度上影响了患者的生活质量。现阶段对于花粉症的诊断和治疗，依赖于特异性变应原疫苗 (SpecificAllergenic Vaccines) 0变应原疫苗是指包括变应原提取物以及其它成分 的生物制剂，可有效用于人类过敏性疾病的诊断、预防和治疗。变应原特异的免疫治疗 (Allergen-Specific Immunotherapy, SIT)通过调节抗原提呈细胞、B淋巴细胞和T淋巴细 胞的免疫应答以及调节介导变态反应效应细胞的功能和数量，从而减轻患者症状。WHO发布 指导文件指出，SIT是唯一能影响过敏性疾病自然病程、有效阻止变应性鼻炎进展为哮喘的 治疗方法。由于重组技术的广泛运用，现阶段有大量重组过敏原成功用于临床变应性疾病免 疫诊断和治疗，从而避免了天然变应原成分复杂、难于质量控制、易诱发超敏反应、产量受 限的缺点。由于潷草花粉由于地理分布广、流行病学意义重大而倍受国内外研究者重视。 在国内李东栋等对武汉地区潷草花粉变应原蛋白质组分的进行了双向电泳分析，孙秀 珍等对潷草花粉变应原致敏组分进行了研究；刘昀等构建潷草和初步鉴定了花粉cDNA 表达文库，陶爱林等创建了潷草及豚草过敏原的嵌合基因，并对其抗原性作出评价等 等。而在国外，韩国人Park JW于1999首先发现了一分子量为IOkDa左右的潷草变应 原主要致敏蛋白，潷草过敏患者血清SlgE结合率为72 %，并且测定该蛋白的N端序列为 NH4+-DNXFENGMKAXTSLYDXKYQ-C00_(X为未鉴定的未知氨基酸)，但该项研究并没有得到该 蛋白的全序列。而在GeneBank数据库中，Jin HS与Park JW注册了编号为AY335187的一 段潷草致敏蛋白mRNA序列，但没有公开发表的具体文献说明该段序列是通过怎样的技术 路线获得的，也没有血清免疫学试验证实该序列对应的蛋白为潷草主要致敏蛋白(需要潷草过敏患者血清SlgE结合率大于50% )，不过由于该序列完整，国际免疫学联合会(IUIS) 下属的变应原命名委员会(www.allergen.org)仍然将该蛋白命名为Hum j 1，而且作为潷 草花粉变应原主要致敏蛋白。北京协和医院变态反应科尹佳、程璇等纯化了一个潷草花粉 致敏蛋白，其过敏患者血清slgE结合率约为74%，N端序列为MM+MDNPFENGMKA-COCr。该 序列在分子量、等电点、过敏患者血清slgE结合率、蛋白N端序列等方面均与1999年韩国 人Park JW发现的IOkDa的主要致敏蛋白极为接近，但仍没有获得全序列鉴定。
发明内容
鉴于上述不足，本发明人提供一种高密度诱导分泌表达潷草花粉主要致敏蛋白的 方法以及工程菌，通过对酵母系统筛选以及诱导表达、纯化工序的选择，生产了具有免疫学 和生物学活性的潷草花粉主要致敏蛋白Hum j3重组蛋白。为达到上述目的，本发明首先利用3' -RACE技术，设计简并引物，首次在国际上 鉴定了该IOkDa主要致敏蛋白对应的cDNA全序列，并依据IUIS的变应原命名规则将该蛋 白命名为Hum j 3。本发明诱导分泌表达生产重组潷草主要致敏蛋白Hum j 3的方法，包括如下步 骤(1)构建表达SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的重组表达载体；(2)线性化重组表达载体，转化感受态酵母细胞；(3)筛选阳性克隆，得重组菌株，并扩大培养；(4)重组菌株的诱导表达以及筛选Humj 3蛋白在酵母中以α-factor信号肽蛋 白引导分泌表达，筛选活性较高的重组菌；(5)以活性较高的重组菌株为种子菌进行高密度的诱导表达重组Hum j 3蛋白；(6)收集培养上清并分离纯化Humj 3。上述步骤1)可以根据SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列设计编码该序列的核苷酸序 列，特别是根据宿主密码子的偏爱性设计相应的核苷酸序列，将该序列插入到适宜的表达 载体中，得到重组表达载体。在本发明的一个实施例中，所述表达载体通过如下方法构建获得根据潷草花 粉主要致敏蛋白Hum j 3的蛋白N端序列NH4+-MDNPFENGMKA-C00_，设计上游简并引物 Fl 为 5, -ATG GA(C/T)AA(C/T) CC(A/G/C/T) TT(C/T) GA(A/G) AA(C/T) GG(A/G/C/T) ATGAA-3 ‘，其下游通用引物AUAP为5’_GGC CAC GCG TCG ACT AC_3’，潷草花粉总mRNA逆 转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物经回收纯化后，连接入pEASY-T3 载体， 进行T-A克隆，在含有IPTG/X-gal的平板上进行蓝白斑筛选后，挑选白斑用菌落PCR筛选， 将阳性重组子用通用测序引物M13F/M13R测序，得到该cDNA序列全长，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，设计上游引物 F30 :5，-CGT CTC GAG AAA AGA ATGGAT AAT CCC TTC-3，；下 游引物 R30 5' -CGT CCG CGG TCA TCC TTGCAA ATC ACC ACA-3，，RT-PCR 产物经柱纯化后， T-A克隆连接入pCR4-TOPO 载体，重组质粒经Xhol I/Sac II双酶切后，与经过Xhol I/ Sac II双酶切的pPICZ α A载体相连接，构建成F30R30_pPICZ α A重组质粒。将构建好的F30R30-PPICZ α A重组质粒经Sac I酶切线性化，电穿孔转化毕赤酵 母，以Zeocin 抗生素筛选得到转化的重组菌株。所述毕赤酵母为巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)，KM71H 菌株，基因型为 arg4aoxl ARG4，表型为 Muts，Arg+，ZeocinK，得到的重组 菌株命名为 Hum j3-pPICZ α Α-ΚΜ71Η。具体所述步骤(3)阳性克隆的筛选方法是用含500，1000，2000μ g/mlZeocin 抗 生素的YPDS平板筛选，置于30°C培养2天，出现菌落者即为阳性克隆。此外还可进一步挑 选Muts菌落进行酶切鉴定或测序鉴定，所用上游引物5' AOXl 5' -GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC-3‘，下游引物 3' AOXl 5' -GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC-3‘，目的 PCR产物 大小为849bp，经测序鉴定插入了目的片段。其中步骤(5)所述高密度诱导表达的方法是将重组菌株接种于BMGH液体培养 基中30°C /2500rpm摇瓶培养10 14h，作为一级种子；将此一级种子按接种量5%接种于 BMGH液体培养基中，300C /2500rpm摇瓶培养16_20h至0D_为4_6，作为二级种子；将此二 级种子离心，收集菌体，用原体积10%的液体BMMH培养基重悬，300C /2500rpm摇瓶诱导培 养，每隔20 28h添加甲醇至终浓度0. 5%，振荡培养90 100h，其中摇瓶培养时培养基 体积不超过培养瓶容积的1/10。其中步骤(6)收集培养上清并分离纯化Hum j 3的方法是收集培养上清，用分 子截留量3. 5KDa的透析袋于去离子水中透析20 30h，用抗潷草花粉天然主要致敏蛋白 nHum j 3的单抗亲和柱层析，所述单抗优选为杂交瘤细胞(Hum j 3-#87_mAb，该细胞株已 于2009年7月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为 小鼠杂交瘤细胞，保藏号为=CGMCC No. 3208)分泌的单抗。本发明还提供一种表达Hum j 3的基因工程菌，其是通过构建表达SEQID NO. 1所 示氨基酸序列的重组表达载体，将所述表达载体转化感受态酵母细胞，经筛选得到的阳性 克隆。本发明还提供利用上述方法制备纯化得到的潷草花粉主要致敏蛋白制备得到的 各种试剂，其包括含有纯化的重组潷草花粉主要致敏蛋白Hum j3的用于诊断潷草花粉过 敏的诊断试剂；含有纯化的重组潷草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的用于检测潷草花粉主要 致敏蛋白含量的检测试剂；含有纯化的重组潷草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的用于免疫治 疗潷草花粉主要致敏蛋白过敏病症的药物。对筛选得到的重组酵母菌株高密度分泌表达，以BMMH诱导培养，解决了本实验室 前期以大肠杆菌胞内融合或非融合表达该蛋白不能成功的问题。随后，我们对rHumj 3进 行了亲和纯化，所用的单抗(编号#87)是用针对nHum j 3的单抗库筛选而来，从而建立了 有效的纯化路线。本发明的优点本发明在国际上率先克隆了潷草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的 基因，分析测定了基因的序列，并成功进行了酵母真核表达，本发明还提供了工程菌Hum j 3-pPICZ α Α-ΚΜ71Η，该菌株能分泌表达有免疫学活性的rHum j 3蛋白，粗蛋白表达量可以 达到100mg/L，且分离纯化步骤简单。本发明为潷草花粉过敏患者的分子诊断和临床免疫治 疗提供了全新的蛋白，为后期临床试验打下了良好的基础。因而重组潷草花粉主要致敏蛋 白rHum j 3具有巨大的应用前景和市场。
图1 :3’ -RACE法所得目的基因Hum j 3的特异性PCR扩增产物(481bp左右)，M为分子量Marker，1为Hum j 3的特异性基因PCR产物。图2 菌落PCR筛选Hum j 3_pEASY_T3重组质粒。蓝白斑筛选平板上提取白斑 1-11，蓝斑12-13。其中2，6，9号菌插入了目的基因片段。图3 :F30R30-pPICZaA与pPICZaA重组质粒的构建以及Sac I酶切线性化过程，M 为分子量Marker，1为纯化的Hum j 3PCR产物，2为F30R30-Humj3-pCR4-T0P0重组质粒经 Xhol I/Sac II双酶切后的F30R30-Humj3小片段切胶纯化产物，3为pPICZ α A质粒经Xhol I/Sac II双酶切后的大片段，4为重组F30R30-Hum j 3-pPICZ α A重组质粒经Sac I酶切线 性化片段，5为纯化的F30R30-Hum j 3-pPICZ α A重组质粒经Sac I酶切线性化片段，导入 KM71H前的检测，6为pPICZ α A质粒经Sac I酶切线性化片段，作为阴性对照导入KM71H。图4 :F30R30-pPICZaA-KM71H重组菌与pPICZaA-KM71H阴性对照阳性的菌株筛选。 其中1-9为在含有ΙΟΟμ g/ml的Zeocin 抗生素YPDS平板上生长的F30R30-pPICZaA-KM71H 单菌落，10为在该筛选平板上生长的pPICZaA-KM71H单菌落。图5 巴氏毕赤酵母高表达克隆菌株的Dot-ELISA方法快速筛选结果。图示NC膜 上不同克隆的显色强度，其中，6、7、8号克隆被认为是高表达克隆菌株，其显色强度明显高 于其它克隆。图6 SDS-PAGE示不同时间F30R30-pPICZaA_KM71H菌株分泌表达rHum j 3蛋白 情况，M为蛋白分子量Marker，1为w22潷草变应原浸液，2为pPICZaA_KM71阴性质控菌株 24h诱导后分泌表达蛋白上清液，3为pPICZaA-KM71阴性质控菌株96h诱导后分泌表达蛋 白上清液，4为GS115/Albumin阳性质控菌株96h诱导后分泌表达蛋白上清液，5_8分别为 重组菌株F30R30-pPICZaA-KM71H于BMMH诱导24h，48h，72h，96h表达蛋白上清液。其中 72h和96h诱导时，重组酵母菌株开始表达分子量约为9. 6kDa重组蛋白rHum j 3。图7 =Tricine-SDS-PAGE示还原和非还原状态下nHum j 3和rHum j 3的蛋白分 子量，M为蛋白分子量Marker (单位kDa)，1为pPICZaA_KM71阴性质控菌株96h诱导后分泌 表达蛋白上清液(上样缓冲液中加入DTT)，2为pPICZaA-KM71阴性质控菌株96h诱导后分 泌表达蛋白上清液(上样缓冲液中不加入DTT) ；3为GS115/Albumin阳性质控菌株96h诱 导后分泌表达蛋白上清液(上样缓冲液中加入DTT)，4为GS115/Albumin阳性质控菌株96h 诱导后分泌表达蛋白上清液(上样缓冲液中不加入DTT) ；5为F30R30-pPICZaA-KM71重组 菌株96h诱导后分泌表达蛋白上清液(上样缓冲液中加入DTT)，6为F30R30-pPICZaA-KM71 重组菌株96h诱导后分泌表达蛋白上清液(上样缓冲液中不加入DTT) ；7为潷草花粉变应 原浸液可溶性蛋白(上样缓冲液中加入DTT)，8为潷草花粉变应原浸液可溶性蛋白(上样 缓冲液中不加入DTT)。图8 =Western Blotting分析nHum j 3和rHum j 3与潷草过敏患者血清结合的 情况。其中，A表示抗原为潷草花粉变应原浸液，B为重组潷草花粉主要致敏原rHum j 3,M 为蛋白分子量Marker，Al为潷草花粉浸液Western Blotting后丽春红染色结果，A2为潷 草花粉阴性血清池免疫印迹结果，A3-A9为7份潷草过敏患者阳性血清免疫印迹结果，均对 9. 6kDa蛋白有阳性反应；AlO为小鼠单抗的阴性对照，不与潷草9. 6kDa蛋白反应，A11-17， 分别是针对潷草nHum j 3获得的单抗，编号分别为#50、#59、#66、#67、#68、#87、#92。Bl 为F30R30-pPICZaA-KM71H菌株表达的包含rHumj 3蛋白的上清分泌液Western Blotting 后丽春红染色结果，B2是潷草花粉阴性血清池与rHum j 3免疫印迹结果，B3-B9为相同7份潷草过敏患者阳性血清与rHum j 3免疫印迹结果，B10为小鼠单抗的阴性对照，不与潷 草9. 6kDa蛋白反应，B11-17分别是编号#50、#59、#66、#67、#68、#87、#92的小鼠单抗与 rHumj 3免疫印迹结果。结果显示对潷草变应原浸液9. 6kDa蛋白有免疫反应的患者血清与 F30R30-pPICZaA-KM71H菌株表达的rHum j 3蛋白也有结合，而与天然n Hum j 3反应的7 株小鼠单抗中，#66、#68、#87、#92四株单抗与rHum j 3蛋白也有结合。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不 用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件 如J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南(第二版，黄培堂等译，科学出版社，2002)，或按照 EasySelect Pichia Expression Kit 手册(invitrogen 公司，Version H，2005.)，以及相 关制造厂商所建议的要求。实施例11.潷草花粉总RNA的提取和cDNA的合成(1).潷草(Humulus japonicus)花粉总RNA的提取。在2007年9月采集北京郊 区新鲜潷草花粉，晴天晾晒干，9号分样筛过滤，丙酮脱脂风干后立即装入瓶中，-80°C冷冻 保存。使用RNeasy Plant Mini kits(QIAGEN , Catalog No. 74903)试剂盒提取潷草花
粉总RNA，按照试剂盒操作程序提取。提取时将75mg左右的花粉投入液氮罐中反复研磨，使 用试剂盒中的Buffer RLT来破坏花粉组织。得到的总RNA量最后约20-60 u g/75mg花粉， A260/A80 = 1. 81，甲醛琼脂糖凝胶电泳(1. 2%琼脂糖)显示rRNA有16S、18S、23S、25S等 清晰的条带，显示总RNA质量完好，最后得到的总RNA浓度约为0. 9mg/ml。(2).潷草花粉cDNA的合成。第一链cDNA的合成使用3，RACE Systemfor Rapid Amplification of cDNA Ends 试剂盒(Invitrogen , CatalogNo. 18373-019)中 的superscript II RT逆转录酶，按照试剂盒操作程序完成潷草花粉cDNA的合成。简述 如下:6u 1总RNA(0. 9mg/ml),5u 1 DEPC处理过的超纯水，1 yl AP引物(10 uM,)加入 200 u 1 EP管，混勻，70°C lOmin ；置冰上冷却至少lmin，然后加入10XPCR Buffer 2u 1, 25mM MgCl2 2 u 1,2. 5mM dNTP Mix 1 u 1,0. 1M DDT 2 u 1，混勻后离心，42°C平衡 5min ；加入 1 u 1 SuperScript II RT 逆转录酶使总体积达到 20 yl，42°C 水浴 50min ；然后 70 °C 15min 终止反应，冰上预冷lmin后，加入1 y 1 RNase H，混勻离心后置37°C 20min以消化RNA， 于-20°C冷冻保存逆转录得到的cDNA。该步骤中的AP引物序列为5' -GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACT TTT TTTTTT TTT TTT TTT T_3'。2. Hum j 3基因序列(cDNA)的获得与验证(l).Hum j 3基因序列(cDNA)的获得。该cDNA序列的获得使用3，RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends 试剂盒(Invitrogen , Catalog No. 18373-019) 完成。操作简述如下建立3，RACE的PCR反应体系，取2 ill上述合成的cDNA，10XPCR Buffer 5u l,25mM MgCl2 3 yl，灭菌双蒸水 36. 5 yl，2. 5mM dNTP Mix lyl，所设计的简并
引物F1(10UM )1UL，引 物 AUAP(10iiM)lii 1，Taq DNA polymerase (5units/u 1)0. 5u 1, 混勻离心，配成50iil反应体系。PCR反应条件为94 °C 3min变性；94°C 45s，55°C 30s， 72 V lmin, 30个循环；72°C lOmin。取5 yl进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下检测到490bp左右的PCR产物。该步骤中简并引物Fl序列为5' -ATG GA(C/T) AA(C/T) CC(A/G/C/T) TT (C/T) GA (A/G) AA(C/T)GG(A/G/C/T)ATG AA_3'，下游通用引物AUAP序列为 5’-GGC CAC GCGTCGACTAC-3，。(2). Hum j 3基因(cDNA)的克隆测序与验证。将上述490bp左右的PCR产物用 QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN ，Catalog No. 28704)试剂盒切胶纯化后进行 T-A克隆测序。使用Transgen 的pEASY-T3 载体，进行T-A克隆，在含有IPTG/X-gal的 平板上进行蓝白斑筛选后，挑选白斑用菌落PCR筛选，将阳性重组子用通用测序引物M13F/ M13R测序，得到该cDNA序列全长，序列信息见附图。使用pEASY-T3 载体(Transgen ) 试剂盒进行T-A克隆，所建立的克隆反应体系和操作程序简述如下上述PCR产物2μ 1，试 剂盒盐溶液1μ 1，超纯水2μ l，pEASY-T3 载体1μ 1，混勻离心该6μ 1反应体系，室温 (22-25V )反应IOmin进行载体和目的片段的连接，然后从中取2 μ 1与一管500 μ 1的化 学感受态One Shot T0P10 Ε. Coli菌株轻轻混勻，冰浴15min，然后42°C准确热激30s (禁 止摇晃)，立即置于冰上，然后加入250 μ 1平衡至室温的S. 0. C.培养基，37°C/250rpm条件 下水平振荡培养Ih后，取50 μ 1转化的Τ0Ρ10 Ε. Coli菌株均勻涂布于含8 μ 1500mM IPTG 以及40 μ 1 40mg/ml X-gal于37°C 30min预热的LB培养基上，37 °C孵箱过夜培养。次日 挑选白斑克隆10个，用通用测序引物M13F、M13R做PCR筛选鉴定，选择大小接近700bp的 片段，使用 EasyPure PCRPurification Kit (Transgen )进行 PCR 产物纯化后，用 #2 号 克隆菌株送上海英骏生物技术有限公司测序。所使用的引物M13F:5' -GTA AAA CGACGG CCA G-3 ‘ ；M13R 5 ‘ -CAG GAA ACA GCT ATG AC-3 ‘。PCR 筛选克隆的条件10 XPCR Buffer (Mg2+Plus) 5 μ 1, 2. 5mM dNTP Mix 4 μ 1，M13F(10 μ Μ) 1 μ 1，M13R(10 μ Μ) 1 μ 1，Taq DNA polymerase(5units/y 1)0. 5μ 1，灭菌双蒸水38. 5μ 1，用枪头挑取单克隆菌落，反 复吹吸于反应体系中，混勻离心，配成50 μ 1反应体系。PCR反应条件为94°C 3min变性； 940C 30s, 550C 45s, 72°C lmin，30个循环；72°C IOmin0得到的全部序列图见附表。3.含有Humj 3基因的分泌性酵母表达重组质粒(Humj 3-pPICZ α Α)的构建(1).引物设计与PCR扩增。根据测序得到的Hum j 3cDNA序列设计引物，在5’ 端加上Xhol I酶切位点，因此上游引物F30设计为5，-CGT CTCGAG AAA AGA ATG GAT AAT CCC TTC-3’(下划线标示的是Xhol I酶切位点)；在3’端加上Sac II酶切位点， 因此下游引物 R30 设计为 5，-CGT CCGCGG ITCA I TCC TTG CAA ATC ACC ACA-3，(下划线
标示的是Sac II酶切位点，方框标示的是引入终止密码子)。使用QIAGEN 的HotStar HiFidelityPolymerase kit (Catalog No. 202602)进行高保真的 PCR 扩增，建立的反应 体系为5 XHotStar HiFidelity PCR Buffer (包含 dNTPs) 10 μ 1，F30 (10 μ M) 1 μ 1， R30(10yM)ly 1, HotStar HiFidelity DNA Polymerase (2. 5units/μ 1) 1 μ 1，cDNA 模板 2 μ 1，灭菌双蒸水35 μ 1，混勻离心，配成50 μ 1反应体系。PCR反应条件为95°C 5min变性； 940C 15s，52°C lmin，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0(2).目的基因的克隆扩增与纯化。得到的PCR产物经EasyPure PCRPurification Kit (Transgen )柱纯化后，T-A 克隆连接入 Invitrogen 的 pCR4-TOPO 载体(Τ0Ρ0 TA Cloning Kit for Sequencing试剂盒)。所建立的克隆反应体系和操作程序简述同步骤2。筛选鉴定阳性克隆后，扩大培养含有F30R30-Hum j 3-pCR4-T0P0重组质粒的T0P10 菌株，以QIAprep Spin Minipr印 kit (QIAGEN ，Catalog No. 27104)试剂盒提取纯化质 粒。操作详见说明书。(3).含目的基因克隆载体的双酶切。将含有目的基因的PCR4-T0P0重组质粒 经 Xhol I/Sac II (New England BioLabs , Catalog No. R0146/R0157)双酶切，建立如下 50 μ 1 酶切体系10 X NEB Buffer#45 μ 1，质粒 DNA 40 μ 1, XholI (20000U/ml) 2 μ 1，Sac II (20000U/ml) 2 μ 1，H2O 1 μ 1 ；酶切条件为 37°C 2h 后，65°C 20min 灭活。1. 5% TAE 琼月旨 糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收277bp的添加了 Xhol I/Sac II双酶切位点的目的基因。(4) .pPICZ α A 穿梭质粒的扩增与双酶切。使用 EasySelect PichiaExpression Kit (Invitrogen )中的pPICZ α A穿梭质粒，转化T0P10F，化学感受态菌株，在含有25 μ g/ ml Zeocin 抗生素的LB低盐平板上筛选。经菌落PCR鉴定后，在含有25 μ g/ml Zeocin 抗生素的LB液体培养基中扩大培养。然后用QIAprep Spin Miniprep kit (QIAGEN ) 提取纯化质粒pPICZ α A，酶切体系和条件同上。1.5% TAE琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切 胶回收3522bp的载体片段。上述菌落PCR筛选含pPICZ α A质粒菌株条件为10XPCR Buffer (Mg2+Plus) 5 μ 1,2. 5mM dNTP Mix 4 μ 1，5，AOXl 弓| 物(10 μ Μ) 1 μ 1，3，AOXl 弓| 物 (10μΜ)1μ 1，Taq DNApolymerase (5units/ μ 1)0. 5 μ 1，灭菌双蒸水 38. 5 μ 1，用枪头挑取 单克隆Ze0CinK菌落，反复吹吸于反应体系中，混勻离心，配成50 μ 1反应体系。PCR反应条 件为 940C 3min 变性；94°C 30s, 55°C 45s, 72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0(5).目的基因与pPICZ α A质粒双酶切片段的连接。建立目的基因和pPICZ α A 酶切片段的20μ 1连接体系10XNEB Buffer 2 μ 1，目的DNA (lOng/μ 1) 8 μ 1，目的 载体(20ng/y 1)8 μ 1，T4DNA 连接酶(400000U/ml，New England BioLabs , Catalog No. M0202) 2 μ 1，室温连接 2h，65°C 20min 灭活。(6).含F30R30_Hum j 3-pPICZ α A重组质粒阳性克隆的筛选与扩大培养将连接 好的F30R30-Hum j 3-pPICZ α A重组质粒转化T0P10F，化学感受态菌株，以5，A0X1/3，A0X1 为引物做菌落PCR筛选阳性克隆菌株，然后大量提取质粒。菌落PCR和质粒提取的方法同 上。(7).重组质粒F30R30-Hum j 3-pPICZ α A与空质粒pPICZ α A/的线性化将用 QIAprep Spin Miniprep kit试剂盒提取的质粒用Sac I内切酶线性化处理。50μ1酶 切体系和条件为10 X NEB Buffer 5 μ 1，空质粒/重组质粒DNA (lOng/μ 1) 35 μ 1，Sac I内 切酶(400000U/ml，New England BioLabs , Catalog No. R0156)2y 1，H2O 8μ 1，37°C过夜 酶切，65°C 20min灭活。然后用乙醇沉淀法纯化线性质粒，以灭菌双蒸水溶解沉淀的DNA，使 其浓度为l_2yg/y 1。4.制备酵母感受态细胞(Pichia pastoris，KM71H)将KM71H酵母菌株接种于装有5ml YPD液体培养基的50ml离心管中30°C过夜培 养，取0. 5ml过夜培养菌液接种于装有500ml新鲜YPD培养基的2000ml的摇瓶中过夜培养 直至OD600 = 1. 3-1. 5，然后40C 1500gX5min离心，弃上清，用500ml冰冷的(0°C )灭菌去 离子水重悬沉淀，4°C 1500gX5min再次离心后，用250500ml冰冷的(0°C )灭菌去离子水重 悬沉淀，4°C 1500gX5min第三次离心后，用20ml冰冷的(0°C ) IM的山梨醇重悬沉淀，4°C1500gX5min第四次离心，最后用Iml冰冷的(0°C ) IM的山梨醇重悬沉淀，此时总体积约为 1. 5-3ml，随后立即进行电击操作。5.电穿孔将线性化空质粒pPICZaA/重组质粒F30R30-Hum j3_pPICZ a A导入酵 母感受态细胞。取80 μ 1感受态酵母细胞，加入10 μ 1 (1 μ g/ μ 1)的空质粒/线性化重组质粒，混 勻后，转入冰冷(0°c )的0. 2cm的电穿孔杯中，冰浴5min，用Bio-RadGene Pulser电转仪 进行电击，条件为电压1500V，电容25 μ F，电阻400 Ω，> 5ms。然后立即往电转杯中加入冰 冷(0°C )的IM山梨醇1ml，随后转移至15ml灭菌离心管中，30°C孵育l_2h，不振荡；分别取 10，25，50，100，200 μ 1 涂布于含 100μ g/ml, 100 μ g/ml，250 μ g/ml，500 μ g/ml，1000 μ g/ ml的Zeocin 抗生素的YPDS平板上，置30°C孵箱培养3_4天直至阳性克隆出现。6.菌落PCR检测目的基因的整合用枪头挑去单克隆菌落悬浮于10 μ 1去离子水，加入2. 5μ 1 Lyticase (10U/μ 1， TIANGEN , Catalog No. RT410-01)，30°C孵育 IOmin 后置入 _80°C IOmin 以裂解酵母。建 立 50ul 筛选重组子的 PCR 反应体系10 X PCRBuffer (Mg2+Plus) 5 μ 1,2. 5mM dNTP Mix 4μ 1，5，AOXl引物(10 μ Μ) 1 μ 1，3，AOXl引物(10 μ Μ) 1 μ 1，酵母裂解液5 μ 1，灭菌双蒸水 33. 5 μ 1，混勻，置 PCR 仪 95°C 5min 后，加入 Taq DNApolymerase (5units/ μ 1)0. 5 μ 1。PCR 反应条件为 94 °C 3min 变性；94°C 45s, 54°C lmin,72°C lmin，30 个循环；72 °C IOmin0 取 5μ1 PCR产物进行1.5% TAE琼脂糖凝胶电泳鉴定。根据PCR产物分子量大小鉴定外源基 因的整合情况。对整合有外源基因的克隆PCR产物纯化后直接用5’ AOXl引物/3’ AOXl引 物测序，验证其与PPICZ α A载体的α-factor信号肽同框。7.阳性克隆的诱导表达以及高表达克隆的筛选用无菌牙签随机挑取含Zeocin 抗生素的YPDS上的47个转化子，接种到匪板上 (质量分数1. 34% YNB,4X ΙΟ"5生物素、0. 5%甲醇和1. 5%琼脂)，同时接种了不含目的片 段的pPICZ α A载体的KM71H空白菌株作为克隆对照。待长成直径约2mm的克隆后，将灭菌 后的NC膜贴于匪板上，做好标记，倒置30°C继续培养。，待克隆位置被湿透后(约3 4d)， 揭下NC膜，37°C干燥，固相抗原斑点。经质量分数3%BSA封闭1. 5h，加入抗潷草主要致敏 蛋白 Hum j 3 的小鼠杂交瘤单抗(Hum j 3-#87-mAb, CGMCC No. 3208), 37 °C lh，洗涤 5 次， 加入1 1000酶标羊抗鼠IgG 二抗，37°C lh,洗涤5次，加入DAB-H2O2底物显色，观察斑点 颜色深浅。从以上匪平板上挑选Dot-ELISA普通显色强度的5株阳性克隆(编号1_5)和显 色强度最深的3株菌株克隆(编号6、7、8)，经PCR和测序鉴定的整合有Hum j 3基因后，分 别接种于5ml BMGH培养基，同时另外接种一株不插入任何外源基因的pPICZaA_KM71阴性 质控菌株，30°C /2500rpm振摇12h，取4ml菌种分装保存于含15%甘油的YPD培养基中。另 取Iml接种到100ml BMGH培养基中直至OD6tltl为4_6左右，1500gX 5min离心，弃上清，菌体 沉淀用10ml BMMH重悬，每24小时加100%甲醇至终浓度0. 5%，诱导4天。每天取样Iml 室温1500gX5min离心，将上清和菌体沉淀液氮速冻后，保存于_80°C。将上述9株菌株分泌的上清液以0. 5ug/孔包被于96孔酶标板，4°C 12h ；5次洗板 后；加入100 μ 1以1 10稀释的20位潷草过敏患者混合血清，37V反应3h ；5次洗板后； 加入100 μ 1以1 2000稀释的HRP标记抗人IgE单抗；5次洗板后在0D492nm处显色。显示菌株#7分泌表达的rHum j 3的蛋白与潷草过敏患者血清中slgE显色强度明显优于其它 菌株(见表1，编号1-8的菌株来自图5所示的克隆。可见6、7、8号克隆的rHum j 3蛋白表 达水平的确高于1-5号非高表达克隆)。故经Dot-ELISA筛选得到的菌株#7是高分泌表达 的rHum j 3的菌株，将该株命名为F30R30_pPICZaA_KM71 (该菌株已于2009年07月28日 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路甲3号，中 国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)， 保藏号为CGMCC No. 3215。)表IELISA显示高表达克隆与普通克隆rHumj 3蛋白表达水平的差异
权利要求
一种诱导分泌表达生产重组葎草主要致敏蛋白Hum j 3的方法，其特征在于它包括如下步骤(1)构建表达SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的重组表达载体；(2)线性化重组表达载体，转化感受态酵母细胞；(3)筛选阳性克隆，得重组菌株，并扩大培养；(4)重组菌株的诱导表达以及筛选Humj 3蛋白在酵母中以α factor信号肽蛋白引导的分泌表达，筛选活性较高的重组菌；(5)以活性较高的重组菌株为种子菌进行高密度的诱导表达重组Hum j 3蛋白；(6)收集培养上清并分离纯化Hum j 3。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体的构建方法如下根据潷草 花粉主要致敏蛋白Hum j 3的蛋白N端序列NH4+-MDNPFENGMKA-C00—，设计上游简并引物Fl 为5' -ATG GA(C/T)AA(C/T)CC(A/G/C/T)TT (C/T)GA(A/G)AA(C/T)GG(A/G/C/T)ATGAA-3‘， 其下游通用引物AUAP为5’ -GGC CAC GCG TCG ACT AC-3’，潷草花粉总mRNA逆转录得到 的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物经回收纯化后，连接入pEASY-T3 载体，进行T-A 克隆，在含有IPTG/X-gal的平板上进行蓝白斑筛选后，挑选白斑用菌落PCR筛选，将阳性重 组子用通用测序引物M13F/M13R测序，得到该cDNA序列全长，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，设计上游引物 F30 :5，-CGT CTC GAG AAAAGAATGGAT AAT CCC TTC-3，；下游引物 R30 5，-CGT CCG CGG TCA TCC TTGCAA ATC ACC ACA-3，，RT-PCR 产物经柱纯化后，T-A 克隆连 接入pCR4-TOPO 载体，重组质粒经Xhol I/Sac II双酶切后，与经过Xhol I/Sac II双 酶切的PPICZ α A载体相连接，构建成F30R30-pPICZ α A重组质粒。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)，KM71H 菌株，基因型为 arg4 aoxl ARG4，表型为 Muts, Arg+, ZeocinK。
4.根据权利要求1 3任一项所述的方法，其特征在于所述步骤(3)阳性克隆的筛选 方法是用含500，1000, 2000 μ g/ml Zeocin 抗生素的YPDS平板筛选，置于30°C培养2天， 出现菌落者即为阳性克隆。
5.根据权利要求1 3任一项所述的方法，其特征在于，其中步骤(5)所述高密度诱导 表达的方法是将重组菌株接种于BMGH液体培养基中30°C /2500rpm摇瓶培养10 14h， 作为一级种子；将此一级种子按接种量5%接种于BMGH液体培养基中，30°C /2500rpm摇瓶 培养16-20h至0D_为4-6，作为二级种子；将此二级种子离心，收集菌体，用原体积10% 的液体BMMH培养基重悬，300C /2500rpm摇瓶诱导培养，每隔20 28h添加甲醇至终浓度 0. 5%，振荡培养90 100h，其中摇瓶培养时培养基体积不超过培养瓶容积的1/10。
6.根据权利要求1 3任一所述的方法，其特征在于其中步骤(6)收集培养上清并分 离纯化Hum j 3的方法是收集培养上清，用分子截留量3. 5KDa的透析袋于去离子水中透 析20 30h，用抗潷草花粉天然主要致敏蛋白nHumj 3的单抗亲和柱层析，所述单抗优选为 杂交瘤细胞Hum j3-#87-mAb CGMCC No. 3208分泌的单抗。
7.表达Hum j 3的基因工程菌，其是通过构建表达SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的 重组表达载体，将所述表达载体转化感受态酵母细胞，经筛选得到的阳性克隆，所述阳性 克隆优选为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris) F30R30_pPICZ α A-KM71H保藏号为CGMCCNo.3215。
8.一种含有纯化的重组潷草花粉主要致敏蛋白Hum j3的用于诊断潷草花粉过敏的 诊断试剂。
9.一种含有纯化的重组潷草花粉主要致敏蛋白Hum j3的用于检测潷草花粉主要致 敏蛋白含量的检测试剂。
10.一种含有纯化的重组潷草花粉主要致敏蛋白Hum j3的用于免疫治疗潷草花粉主 要致敏蛋白过敏病症的药物。
全文摘要
本发明提供一种在酵母系统中诱导表达重组葎草花粉主要致敏蛋白Hum j 3的方法，包括构建表达SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的重组表达载体；线性化重组表达载体，转化感受态酵母细胞；筛选阳性克隆，得重组菌株，并扩大培养；重组菌株的诱导表达以及筛选Hum j 3蛋白在酵母中以α-factor信号肽蛋白引导的分泌表达；以高活性的重组菌株为种子菌进行高密度的诱导表达重组Humj 3蛋白；收集培养上清并分离纯化Humj 3。本发明首次在国际上确证了葎草主要致敏蛋白的全基因序列，并首次成功进行了酵母分泌表达，且证实了该重组蛋白具有免疫活性，为葎草花粉过敏患者的分子诊断和临床免疫治疗提供了全新的蛋白。
文档编号C12P21/02GK101993888SQ20091009176
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月25日 优先权日2009年8月25日
发明者周俊雄, 尹佳, 程璇 申请人:中国医学科学院北京协和医院