通过光合微生物生产支链醇的制作方法

专利名称：通过光合微生物生产支链醇的制作方法
技术领域：
本发明提供了基因、多肽及其对应的表达构建体、重组光合微生物，以及其对应的使用方法，例如用于生产支链醇类，这些支链醇可以任选地被衍生以生产进一步的化合物。 这种生物路径提供了超越其他已知生产方法的优势。通过引用而结合的序列表本申请包含对氨基酸序列和/或核酸序列的引用，这些作为序列表文本文件 "616872004040SeqList. txt，，与之同时提交，文件大小25. 0千字节(KB)，创建日是2009年 12月10日。上述序列表特此通过引用按照37C. F. R. § 1.52(e) (5)以其整体结合在此。SS支链醇及其衍生物具有多种在本领域中已知的实用性，例如，作为燃料、燃料添加剂、以及溶剂。使用支链醇如异丁醇、2-甲基-1-丁醇、和3-甲基-1-丁醇作为燃料或燃料添加剂的优点包括比乙醇更高的能量含量并且它们能够使用现有的燃料管线来运输。用于生产支链醇的传统方法是昂贵的，例如发酵作用要求一种可发酵的碳源，典型地是糖或多糖，这增加了生产成本。US 2007/00拟957披露了通过重组非光合细菌和酵母来合成异丁醇，利用了葡萄糖或蔗糖作为碳源。US 2007/0259411描述了在包括一种用于生产醇的可发酵碳源的生长培养基中对耐丁醇的细菌肠道球菌物种进行选择。US 2008/(^61230提供了编码高活性酮酸还原异构酶的基因，它们可以用于在遗传上工程化用于生产异丁醇的微生物。US 2009/0081746披露了在包括葡萄糖的培养基中通过重组大肠杆菌菌株来合成支链醇，包括异丁醇、1- 丁醇、I-丙醇、2-甲基1- 丁醇、3-甲基-1- 丁醇、以及2-苯基乙醇。US 2009/0288337(申请号 12/332,305)和 WO 2009/076480 (PCT 申请 US2008/086^6) ( 二者都通过引用结合在此)描述了遗传工程微生物，如用于合成2-甲基-1-丁醇的细菌和酵母。发明概述本发明提供了多肽、基因、表达构建体、代谢路径、光合微生物菌株，以及以生物方式生产支链醇类(包括例如，2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、以及异丁醇)的方法。本发明的一个方面涉及通过弓I入异源基因来生产重组光合微生物，这些异源基因编码增强2-酮基支链酸的生产和脱羧作用的酶，从而导致产生对应的支链醛。接着可以进行另外的基因引入，以使得这些支链醛能够被有效地还原成对应的支链醇。此外，本发明提供了多种方法，其中将支链醇在体内以酶法脱水，以生产不同的支链α烯烃。在一个实施方案中，本发明提供了一种重组光合微生物，它包括至少一个异源DNA 序列，该序列编码至少一种催化底物至产物的转化的多肽，这种转化导致了异丁醇的合成。该编码的多肽可以是催化以下转化的多肽(1)丙酮酸酯至2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸酯；(2) 2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸酯至2，3- 二羟基-3-甲基丁酸酯；(；3) 2，3- 二羟基-3-甲基丁酸酯至3-甲基-2-氧代丁酸酯；(4) 3-甲基-2-氧代丁酸酯至2-甲基-1-丙醛；或(5) 2-甲基-1-丙醛至2-甲基-1-丙醇(异丁醇)。在另一个实施方案中，本发明提供了一种重组光合微生物，它包括至少一个异源 DNA序列，该序列编码至少一种催化选定的底物至产物转化的多肽，这种转化导致2-甲基-1-丁醇的合成。该编码的多肽可以是催化以下转化的多肽(6)丙酮酸酯至2-甲基苹果酸酯；(7) 2-甲基苹果酸酯至2-甲基马来酸酯；(8) 2-甲基马来酸酯至D-赤-3-甲基苹果酸酯；(9) D-赤-3-甲基苹果酸酯至2-氧代丁酸酯；(10)苏氨酸至2-氧代丁酸酯；(11) 丙酮酸酯和2-氧代丁酸酯至2-羟基-2-乙基-3-氧代丁酸酯；(1 2-羟基-2-乙基-3-氧代丁酸酯至2，3- 二羟基-3-甲基戊酸酯；(13) 2，3- 二羟基-3-甲基戊酸酯至3-甲基_2_氧代戊酸酯；(14) 3-甲基-2-氧代戊酸酯至2-甲基-1- 丁醛；以及(1 2-甲基-1- 丁醛至
2-甲基-1-丁醇。在另一个实施方案中，本发明提供了重组光合微生物，它包括至少一个异源DNA 序列，该序列编码至少一种催化底物至产物转化的多肽，这种转化导致3-甲基-1- 丁醇的合成。该编码的多肽可以是催化以下转化的多肽(16)丙酮酸酯至2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸酯；(17) 2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸酯至2，3- 二羟基-3-甲基丁酸酯；(18) 2，
3-二羟基-3-甲基丁酸酯至3-甲基-2-氧代丁酸酯；(19) 3-甲基-2-氧代丁酸酯至2-异丙基苹果酸酯；00) 2-异丙基苹果酸酯至2-异丙基马来酸酯；2-异丙基马来酸酯至 3-异丙基苹果酸酯；0 3-异丙基苹果酸酯至4-甲基-2-氧代戊酸酯(2-酮基异己酸酯)；03) 4-甲基-2-氧代戊酸酯至3-甲基-1- 丁醛；以及04) 3-甲基-1- 丁醛至3-甲基-1-丁醇。在一些实施方案中，在此提供了重组光合微生物，这些微生物包括一种编码支链 2-酮酸脱羧酶的异源核酸分子，其中该光合微生物产生了支链醇，如异丁醇、2-甲基-1-丁醇、或3-甲基-1-丁醇。在一个示例性实施方案中，光合微生物包括编码乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)的kdcA或其变体的异源核酸序列。在另一个示例性实施方案，光合微生物包括编码树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的PDC3-6或其变体的异源核酸序列。在一些实施方案中，提供了生产一种或多种支链醇的重组光合微生物，其中这些光合微生物包括编码醇脱氢酶(如支链醇脱氢酶)的异源核酸序列。在一个示例性实施方案中，一种重组光合微生物包括编码酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)的ADH6或其变体的异源核酸序列。在进一步的实施方案中，将重组光合微生物在遗传上工程化以用于生产一种或多种支链醇，如异丁醇、2-甲基-1-丁醇、或3-甲基-1-丁醇，该微生物包括至少一个异源核酸序列，该异源核酸序列编码一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成乙酰乳酸合酶(EC 2. 2. 1. 6)、酮醇酸还原异构酶(EC 1. 1. 1. 86)、或二羟酸脱水酶(EC4. 2. 1. 9)。在一些示例性实施方案中，重组光合微生物包括编码乙酰乳酸合酶(EC2.2. 1.6)的异源核酸序列。在本发明的某些实施方案中的重组光合微生物被工程化以生产3-甲基-1-丁醇并且包括编码以下酶中的一种或多种的一个或多个异源核酸序列2-异丙基苹果酸合酶(EC 2.3.3. 13)、3_异丙基苹果酸脱水酶(EC 4. 2. 1. 3 或3-异丙基苹果酸脱氢酶 (EC1. 1. 1. 85)。在其他实施方案中，重组光合微生物在遗传上被工程化以生产2-甲基-1-丁醇，并且包括编码以下酶中的一种或多种的至少一个异源核酸序列高丝氨酸脱氢酶 (EC1. 1. 1. 3)、高丝氨酸激酶(EC 2. 7. 1. 39)、苏氨酸合酶(EC 4. 2. 3. 1)、或苏氨酸脱氨酶 (EC 4. 3. 1. 19)。本发明的另一个方面是用于生产支链醇的方法，其中该方法包括培养如在此提供的重组光合微生物，如包括编码支链2-酮酸脱羧酶的异源序列以及编码醇脱氢酶的异源序列的微生物，以生产支链醇。在一些优选实施方案中，该光合微生物是以光能自养方式培养的。在一些实施方案中，该光合微生物是在不存在还原的碳源(如糖或有机酸)时进行培养的。该光合微生物培养基在一些实施方案中配备有无机碳，如CO2、碳酸、或碳酸盐。在这些方法中使用的光合微生物可以进一步包括编码以下各项中一种或多种的至少一个异源核酸序列乙酰乳酸合酶(EC 2. 2. 1. 6)、酮醇酸还原异构酶(EC 1. 1. 1. 86)、 或二羟酸脱水酶(EC 4. 2. 1. 9)。通过该培养基生产的支链醇在一些优选实施方案中是异丁醇、2-甲基-1- 丁醇、或3-甲基-1- 丁醇。在一些实施方案中，该光合微生物产生3-甲基-1-丁醇。在一些实施方案中， 该光合微生物产生3-甲基-1-丁醇并且被工程化以包括编码以下酶中的一种或多种的至少一个异源核酸序列2-异丙基苹果酸合酶(EC 2. 3. 3. 13)、3_异丙基苹果酸脱水酶 (EC4. 2. 1. 33)或3-异丙基苹果酸脱氢酶(EC 1. 1. 1. 85)。在一些实施方案中，该光合微生物产生2-甲基-1-丁醇。在一些实施方案中，该光合微生物产生2-甲基-1-丁醇并且被工程化以包括编码以下酶中的一种或多种的至少一个核酸序列高丝氨酸脱氢酶(EC 1. 1. 1. 3)、高丝氨酸激酶(EC 2. 7. 1. 39)、苏氨酸合酶 (EC 4. 2. 3. 1)、或苏氨酸脱氨酶(EC 4. 3. 1. 19)。在一些实施方案中，该方法包括从该培养基中回收该支链醇，例如使用诸如蒸馏、 液液萃取、气体汽提(反萃取，gas stripping)、蒸汽汽提、和/或全蒸发的方法。在另一方面，在本发明的范围内包括通过在此提供的方法制成的支链醇。通过重组光合微生物生产的支链醇可以是例如异丁醇、2-甲基-1- 丁醇、或3-甲基-1- 丁醇。附图简要说明

图1描绘了用于合成异丁醇的生物化学路径(该路径与用于氨基酸缬氨酸的生物合成路径重叠)以及用于合成3-甲基-1- 丁醇的生物化学路径(该路径与用于氨基酸亮氨酸的生物合成路径重叠)。图2描绘了 2-甲基-1-丁醇的生物化学路径，它与用于氨基酸异亮氨酸的生物合成路径重叠。图3提供了 SEQ ID NO :1，用于在细长聚球藻(Synechococcus elongatus)中表达的操纵子序列，包括密码子优化的酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因PDC1、细长聚球藻KaiBC基因区间、密码子优化的酿酒酵母醇脱氢酶基因ADH2、以及rrnB终止子。图4提供了 SEQ ID NO :2，用于在细长聚球藻中表达的操纵子序列，包括来自乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶基因(KDCa)与密码子优化的酿酒酵母ADH2基因相结合。图5提供了 SEQ ID NO :3，一个操纵子序列，包括酿酒酵母ADH6基因与密码子优化的酿酒酵母PDCl基因相结合。图6提供了 SEQ ID NO :4，一个操纵子序列，包括乳酸乳球菌KDCa基因以及酿酒酵母ADH6基因。图7提供了 SEQ ID NO :7，一个表达构建体序列，包括trc启动子以及集胞藻某种 (Synechocystis sp.)PCC 6803ilvB 编码序列和 rpsl4 终止子。图8提供了 SEQ ID NO :8，由树干毕赤酵母的PDC3-6基因编码的支链2_酮酸脱羧酶蛋白的序列。发明详细说明本申请通过引用以其全文结合了美国专利申请12/332，305 ；PCT申请PCT/ US08/086296 ；以及美国临时申请60/012，749。本说明书中提及的所有公开物和专利申请都通过引用以结合在此，其程度如同各个单独的公开物或专利申请都确切并且单独地表明为通过引用进行结合。除非另外定义，在此所使用的全部技术和科学术语都具有与本发明相关的领域之内的普通技术人员通常所理解的相同含义。以下术语是出于如在此描述的本发明的目的来定义的。单数形式“一个/ 一种(a/an) ”和“该”包括复数指示物，除非上下文中清楚地另外表明。因此，例如，提及“一个(种)细胞”包括了多个细胞，并且提及“一个(种)抗体” 包括了多个抗体，等等。如在此使用的，术语“大约”或“近似”在提及任何数值时旨在表明加上或减去所指出的值的10%的一个值。例如，“大约50°C”(或“近似50°C”)涵盖了从45°C至55°C (包括端值)的温度范围。类似地，“大约lOOmM”(或“近似lOOmM”)涵盖了从90mM至IlOmM(包括端值)的浓度范围。本申请中提供的所有范围都将该范围的上部和下部端值包含在内。“分离的”生物分子(如分离的蛋白或核酸)是从该生物分子天然存在于其中的环境中取出的生物分子。例如，分离的蛋白或核酸分子是从它在天然状态下与之相关联的细胞或有机体中被取出的。分离的生物分子在一些情况下可以是部分地或实质上纯化的，例如分离的核酸分子可以是已经从它在自然状态下整合于其中的染色体、基因组、或游离基因中切除的核酸序列。重组的或“工程化的”核酸分子是已经通过人类介入而改变的核酸分子。作为非限制性实例，重组体核酸分子1)包括在本质上不连接的多个连接的核苷酸序列，2)已经使用分子克隆技术被工程化，使得它相对于天然存在的核酸分子序列而言缺乏一个或多个核苷酸，或者3)已经使用分子克隆技术对其进行操作从而使得它相对于天然存在的核酸序列而言具有一个或多个序列变化或重排。作为非限制性实例，cDNA是重组体DNA分子， 例如是通过一个或多个体内聚合酶反应产生的、或者在其上已经附连了多个连接体的、或者已整合到载体(如克隆载体或表达载体)之中的任何核酸分子。重组的或“工程化的”有机体是已经对其引入一个或多个重组的或“工程化的”核酸分子的有机体。基因或蛋白的“同源物”是指它在其他物种中的功能等同物。基因或核酸序列的“变体”是指与所参照的基因或核酸序列具有至少65%的同一性、并且相对于所参照的序列可以包括一个或多个碱基的缺失、增加或取代的序列。变体还包括这样的的嵌合基因，这些基因包括来自两种或更多种来源的序列。变体还包括密码子优化的基因，以及包含突变、插入、缺失、或取代的基因，是天然存在的或重组的。变体可以是一种天然存在的变体或是自发的或诱导的突变的结果。诱导的突变可以使用有机体或细胞的诱变的领域中已知的方法来创造(例如，使用伽马或UV辐射或化学诱变剂如 5-溴-脱氧尿苷，乙基甲烷磺酸酯(EMS)、甲基甲烷磺酸酯(MMS)、硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)、ICR化合物等等)、或者可以使用基因工程技术(如基因合成、体内单链修复技术、在允许误差的温度下基于聚合酶的扩增和/或使用结合了碱基变化的引物进行的基于聚合酶的扩增)来引入。肽或蛋白的“变体”是相对于参照的肽或蛋白而在一个或多个氨基酸位置处改变的肽或蛋白序列。变体可以是天然存在的变体或者可以是对编码该变体肽或蛋白的核酸分子进行一种或多种自发的、诱导的或遗传工程化的突变的结果。变体肽也可以是化学合成的变体。氨基酸或核酸序列一致性的程度可以通过用于将有待比较的序列基于指定的程序参数进行比对的各种计算机程序而测定。例如，可以使用Smith & Waterman，Adv. Appl. Math. 2 :482(1981)的局部同源性算法、Needleman & Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443 (1970) 的同源比对算法、或 Pearson & Lipman，Proc. Nat ‘ 1. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)的相似性搜索法来对序列进行比对和比较，并且可以基于目视检查对其进行比对和比较、或者可以使用计算机程序进行分析(例如，GAP, BESTFIT, FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group,575Science Dr. , Madison, Wis.)。在Altschul，et al.，J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990)中说明的 BLAST 算法是通 il^HHit^^ii^ffE^^^ (the National Center for Biotechnology Information) (万维网地址ncbi.nlm.nih.gov)可公开获得的。这种算法通过识别在查询序列中长度为W的短字串来识别高得分的序列对(HSP)，它们在与数据库序列中的一个同样长度的字串进行比对时或者匹配或者满足一些正性评分的阈值得分T。T被称为邻近字得分阈 (Altschul, et al. ，supra.)。率刀女台的令PiS 串中(neighborhood word hits)
启动搜索的种子(seed)以发现包含它们的较长的HSP。然后，将这些字串命中在两个方向上都沿着每个序列延长直到该累积的比对得分可以得到增加。对于核苷酸序列，使用参数 M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是> 0)和N(对于错配残基的罚分；总是< 0)来计算累积的得分。对于氨基酸序列，使用一种得分矩阵来计算该累积的得分。在以下时刻停止这些字串命中在每个方向上的延伸该累积的比对得分从它的最大获得值下降达到X数量时；由于一个或多个负得分残基比对的累积而该累积的得分变为零或以下时；或者达到了任一序列的末尾时。对于测定一个氨基酸序列或核酸序列的百分比一致性，可以使用这些 BLAST程序的缺省参数。对于氨基酸序列的分析，这些BLASTP缺省值是字串长度(W)3 ；期望值(E)IO ；以及BL0SUM62评分矩阵。对于核酸序列的分析，这些BLASTN程序缺省值是字串长度(W)Il ；期望值(E)IO ；M = 5;N = -4 ；以及两条链的比较。BLASTN程序(使用蛋白序列来查询核苷酸序列数据库)使用字串长度(W) 3、期望值伍)10、以及见05疆62评分矩阵作为缺省值。(参见 Henikoff & Henikoff，Proc. Natl. Acad. ki. USA 89:10915(1989))。除了计算序列一致性百分数之外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的一种统计分析(参见，例如 Karlin & Altschul，Proc. Nat ‘ 1. Acad. Sci. USA 90 5873-5787(1993))。最小概率和(P(N))提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生的一个匹配的概率的一个指示。例如，若在一个测试核酸序列与一个参比核酸序列的比较中该最小概率和是小于约0. 1、优选地是小于约0. 01、并且更优选地是小于约0. 001，则该核酸序列被认为是与该参比序列相类似的。在基因或蛋白的情况下“外源的”是基因或蛋白不衍生自宿主生物物种。“异源的”基因或核酸序列是来自不同于它被引入其中的宿主生物的来源、或来自不同于它与之并列于核酸构建体中的另一种核酸序列的来源的一种基因或序列。例如，一个物种引入了另一物种中的基因可以称为异源基因。包括可操作地连接到一个启动子(不是用于该基因的天然启动子(不是在其天然状态下连接到该基因上的启动子))上的基因的一种核酸分子在此被称为异源核酸分子或序列，即使该基因可能衍生自与宿主生物相同的物种。被“密码子优化的”用于在有机体中表达的基因是如下的基因，其核苷酸序列已经相对于原始核苷酸序列被改变为使得该核苷酸序列的一个或多个密码子已被改变成编码该相同氨基酸的不同的密码子，其中这个新的密码子比原始的密码子更频繁地用在感兴趣的有机体的基因中。该基因密码子的简并性提供了，除蛋氨酸和色氨酸外的所有氨基酸都被多于一个的密码子编码。例如，精氨酸、亮氨酸、以及丝氨酸被六个不同的密码子编码；甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、以及脯氨酸被四个不同的密码子编码。许多有机体比其他那些更频繁地使用了某些密码子来编码一种特定的氨基酸。不将本发明的任何方面限制于任何具体的机理，据信对于一种给定的氨基酸一些tRNA在特定的有机体内比其他那些是更流行的，并且要求一种罕见tRNA来翻译所编码的蛋白的基因可以在低水平上表达，这部分地是由于该罕见tRNA的有限量值。因此，为了一种编码的蛋白的适当或最佳水平的表达， 可以将一个基因进行“密码子优化”以将一个或多个密码子改变成新的密码子(“优选的密码子”)，这些新的密码子在那些之中更频繁地用在宿主生物的基因中(称为有机体的“密码子偏爱”)。如在本发明的背景下使用的，本发明的一个“密码子优化的”基因或核酸分子不需要将每个密码子改变以符合预期的宿主生物的密码子偏爱，也不要求一个“密码子优化的”基因或核酸分子的被改变的密码子被改变成感兴趣的有机体所使用的最流行的密码子。例如，一个密码子优化的基因可以将一个或多个密码子改变成比原始的一个或多个密码子更频繁被使用的密码子，无论它们是否最频繁地在该有机体中用于编码一种特定的氨基酸。“光合微生物”是可以进行光合作用并且可以仅借助显微镜就能作为单一有机体看到的任何原核的或真核的单细胞的或集群的有机体。光合微生物包括真核微藻以及光合细菌。真核的微藻包括绿藻(绿藻纲)、黄藻(黄藻纲)、金藻(金藻纲)、褐藻(褐藻纲)、 红藻(红藻纲)、硅藻(硅藻纲)、以及“微微型浮游生物”(葱绿藻纲和真眼点藻纲)。光合细菌包括蓝细菌、绿色硫细菌、紫色硫细菌、紫色无硫细菌、以及绿色无硫细菌。光能自养的生长或培养是指有机体在没有供应可以代谢而提供能量的化合物或分子(如还原的碳源)时并且在有机体使用光作为唯一能量源的条件下的生长。无机碳是以本身不能被有机体代谢而提供能量的分子形式所提供的碳，如CO2、碳酸、和碳酸盐。无机碳的来源包括CO2、空气、碳酸、碳酸盐、以及排放物，如烟气。
二氧化碳(其与碳酸、碳酸氢盐和/或碳酸盐一起定义了术语“无机碳”)在光合过程中被转化为有机化合物。无机碳源包括以任何方式传递的无机碳、任选地是与任何其他的化合物组合进行混合，这些化合物并不用作主要的碳原料、而是仅用作一种混合物或载体(例如，来自生物燃料(如，乙醇)工厂、发电厂、石油精炼厂的排放物，以及大气和地下来源)。一种被还原的或有机的碳源是可以被有机体代谢而提供能量的基于碳的分子，例如，碳水化合物(包括糖或多糖)、氨基酸、蛋白、有机酸、脂肪酸、类脂、乙酰基CoA、或这些生物分子中任何一种的任何生物合成的前体。可以将在此说明的实施方案的要素相组合而得到另外的未具体说明的实施方案， 这些实施方案也在本发明的范围之内。本申请中的标题仅仅是为了方便读者、并且不以任何方式限制本发明的范围或其实施方案。在一个方面，本发明包括将重组光合微生物工程化以生产各种支链醇分子。在优选实施方案中，将这些光合微生物工程化用以生产的这些支链醇是五个碳的支链醇，它们可以部分地使用将底物进行催化而按某些氨基酸生物合成路径发生产物转化的酶来合成。
本发明的一个实施方案是在一种光合微生物中表达一种或多种异源基因，这些基因编码在生产支链醇(包括异丁醇、2-甲基-1- 丁醇、以及3-甲基-1- 丁醇)中所涉及的酶。这些产物各自的合成利用内源氨基酸生物合成路径的多种酶。将这些重组微生物工程化以包括一个或多个编码酶的异源基因，这些酶与内源酶相结合从而导致这些支链醇的合成。用于生产异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸的氨基酸生物合成路径，以及用于生产异丁醇、 2-甲基-1- 丁醇、以及3-甲基-1- 丁醇的另外的酶(不是这些内源氨基酸路径的一部分) 在图1和2中提供。在一个实施方案中，本发明提供了用于生产异丙醇的方法。该酶促路径的每个步骤都拥有一个数字命名，这个数字命名对应于具有酶活性的多肽，以进行如下的底物至产物的转化(图1)(1)丙酮酸酯至2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸酯；(2) 2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸酯至2，3_ 二羟基_3_甲基丁酸酯；(3) 2，3- 二羟基-3-甲基丁酸酯至3_甲基_2_氧代丁酸酯；(4) 3-甲基-2-氧代丁酸酯至2-甲基丙醛；以及(5) 2-甲基-1-丙醛至2-甲基-1-丙醇(或异丁醇)。在另一个实施方案中，本发明提供了用于生产2-甲基-1-丁醇的方法。该酶促路径的每个步骤都拥有一个数字命名，这个数字命名对应于具有酶活性的多肽，以进行如下的底物至产物的转化(图2)(6)丙酮酸酯至2-甲基苹果酸酯；(7) 2-甲基苹果酸酯至2-甲基马来酸酯；(8)2-甲基马来酸酯至D-赤-3-甲基苹果酸酯；(9) D-赤-3-甲基苹果酸酯至2-氧代丁酸酯；(10)苏氨酸至2-氧代丁酸酯；(11)丙酮酸酯和2-氧代丁酸酯至2-羟基-2-乙基_3_氧代丁酸酯；(12) 2-羟基-2-乙基-3-氧代丁酸酯至2，3_ 二羟基_3_甲基戊酸酯；
(13) 2，3- 二羟基-3-甲基戊酸酯至3_甲基_2_氧代戊酸酯；(14) 3-甲基-2-氧代戊酸酯至2-甲基丁醛；以及(15)2-甲基-1-丁醛至 2-甲基-1-丁醇。在另一个实施方案中，本发明提供了用于生产3-甲基-1-丁醇的方法。该酶促路径的每个步骤都拥有一个数字命名，这个数字命名对应于具有酶活性的多肽，以进行如下的底物至产物的转化(图1)(16)丙酮酸酯至2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸酯； (17) 2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸酯至2，3_ 二羟基_3_甲基丁酸酯；(18) 2，3- 二羟基-3-甲基丁酸酯至3_甲基_2_氧代丁酸酯；(19) 3-甲基-2-氧代丁酸酯至2-异丙基苹果酸酯；(20) 2-异丙基苹果酸酯至2-异丙基马来酸酯；(21) 2-异丙基马来酸酯至3-异丙基苹果酸酯；0 3-异丙基苹果酸酯至4-甲基-2-氧代戊酸酯(2-酮基异己酸酯)；(23) 4-甲基-2-氧代戊酸酯至3_甲基丁醛；以及04)3-甲基-1-丁醛至 3-甲基-1-丁醇。考虑了编码与在此披露的这些酶的氨基酸序列具有80% -85%的一致性、 85% -90%的一致性、90% -95%的一致性、或95% -100%的一致性的酶的基因变体(其中，所编码的这些酶至少具有参照酶的活性)用于本发明的重组光合微生物中。可以将此类基因变体进行测试以用于对本发明的宿主菌株进行工程化，这些宿主菌株使用本申请或美国专利申请公开2009/(^88337(通过引用结合在此)中提供的方法产生了一种或多种支链醇。在一些方面，本发明提供了重组光合微生物，它包括编码2-酮酸脱羧酶的异源核酸序列，其中该重组光合微生物产生支链醇。催化反应G)、(14)和的底物至产物转化的示例性多肽包括2-氧代-酸羧基裂解酶(也称为α酮酸脱羧酶)，包括在EC4. 1.1.1, EC 4. 1.1. 43、EC 4. 1. 1. 71、EC 4. 1. 1. 72、EC 4. 1. 1. 74 类别中的酶，它们能够利用支链 2-氧代-羧酸作为底物来生产支链醛类。已经识别了多个编码2-氧代-酸羧基裂解酶的基因，可以测试它们在支链2-氧代羧酸(例如，2-氧代-3-甲基丁酸酯、3-甲基-2-氧代戊酸酯以及4-甲基-2-氧代戊酸酯)上的活性并且将其引入光合微生物之中，这些基因包括但不限于编码以下酶(UniProtKB登录号)的基因:Ρ83779 ；Q6FJA3 ；Q12629 ；Ρ33149 Ρ28516 ；A2Y5L9 ；Q0DHF6 ；Ρ51850 ；Q09737 ；Ρ51845 ；Ρ06169 ；Q05326 ；A2XFI3 ；Q10MW3 Ρ51851 ；Q92345 ；Ρ51846 ；Q05327 ；A2YQ76 ；Q0D3D2 ；Q9P7P6 ；042873 ；Ρ16467 ；Ρ26263 Q4WXX9 ；Q96535 ；Q684K0 ；Q84V95 ；Q5BN14；Q5BN15 ；Q7M227 ；Q96536 ；B0ZS79 ；Q9SM49 B3F7U5 ；Q7M228 ；B2J634 ；Q1QC58 ；Q3EJQ4 ；Q8L388 ；Q93EN4 ；Q9R5L0 ；Q8KTX6 ；B0VBZ7 B0VUA9 ；B3Q3J2 ；Q5ZWD0 ；Q2JYJ7 ；Q2YVJ9 ；Q5FRZ6 ；Q4FTE7 ；Q2YUZ2 ；Q93IM7 ；Q2UKV4 Ρ51844 ；QOCNVl ；Ρ87208 ；Ρ34734 ；Ρ33287 ；Ρ06672 ；Q0W4D3 ；A2Q7Q7 ；A3GF21 ；A3GGL8 043107 ；Q659I2 ；Q8NK65 ；Q9UUT6 ；Q8NK64 ；A2QT68 ；Q4W928 ；A2R228 ；A4HQP2 ；Α5ΑΑ75 B0DZR5 ；Q4WW88 ；043106 ；Q43005 ；Q7U0A6 ；Α1ΚΙ36 ；Q9CC97 ；Q73WX4 ；A0R2B1 ；A3Q3N5 A1UK81 ；Q1B4V6 ；A5U1U6 ；050463 ；A0PVU7 ；A1TDK2 ；Q06408 ；A3LXV3 ；Q07471 ；Q6QBS4 Q684J7 ；Q9CG07 ；053865 ；以及A4F1TO。在一些实施方案中，被用来工程化光合宿主生物的核酸分子所编码的2-酮酸脱羧酶是由以下物质编码的酿酒酵母的PDCl (蛋白登录号 CAA97573 ；UniProtKB P06169)、PDC5 (CAA97705 ；UniProtKB P16467)、PDC6 (CAA39398 ； UniProtKB P26263)、THI3 (CAA98646 ；UniProtKB Q07471)、或 AROlO (AAB64816 ；UniProtKB Q06408)；树干毕赤酵母的 PDCl (UniProtKB A3GGL8)、PDC2 (UniProtKB A3GF21)、 PDC3 (ABN67867. IGI :126093174 ；UniProtKB A3LXV3)、或 PDC6 (也称为 PDC3-6 ；ABN67867. 1 GI :126093174 ；SEQ ID NO 8)；乳酸乳球菌的 kdcA(AAS49166 ；GI :44921617 ；UniProtKB Q6QBS4)、kdcA-S286Y、kdcA-F381W、或 kdcA_S286Y、F381W ；结核分枝杆菌的 Kdc (UniProtKB 053865)；或肠沙门菌的吲哚丙酮酸脱羧酶(NP_461346 ；GI :16765731)、或者在US 2009/(^88337(通过引用结合在此)中披露的编码2-酮酸脱羧酶或丙酮酸脱羧酶的任何基因。这些基因、这些基因的变体或同源物、或已知是或怀疑是编码支链2-酮酸脱羧酶的基因中的任何一种都可以试验用于工程化本发明的、生产一种或多种支链醇的宿主菌株。
在一些方面，本发明提供了重组光合微生物，它包括编码醇脱氢酶的异源核酸序列，其中该光合微生物产生支链醇，如异丁醇、3-甲基-1-丁醇、或2-甲基-1-丁醇。催化反应(5)、(15)、和04)的底物至产物的转化的示例性多肽包括醇脱氢酶(EC1. 1. 1. 1 和EC 1.1. 1.2)，它们能够利用支链醛作为底物来生产对应的支链醇。已经识别了多个作为醇脱氢酶的基因，可以测试它们在支链醛上的活性并且将其引入光合微生物之中，这些基因包括但不限于编码以下酶(UniProtKB登录号)的基因P07327 ；P28469 ；Q5RBP7 ；
P25405；P00325；Q5R1W2；P14139；P25406；P00327；P00326；097959；P00328；P80222P30350；P49645；P06525；P41747；P12311；Q17334；P43067；P85440；P48814；Q70UN9P23991；P19631；P23236；P48586；P09370；P22246；P07161；P12854；P08843；P26325Q9Z2M2；Q64413；Q64415；P05336；P20369；Q07288；P00333；P00329；P80512；Q9P6C8Q75ZX4；Q2R8Z5；P12886；P14219；P41680；P25141；000097；Q03505；P22797；P06757P14673；P80338；P13603；P00330；Q07264；P20368；P42327；045687；094038；P48815Q70UP5；Q70UP6；P27581；P25720；P23237；P48587；P09369；P07160；P24267；P37686P54202；Q24803；P10847；P49383；Q9P4C2；P04707；Q4R1E8；Q0ITW7；013309；P28032P14674；P00331；P06758；P42328；P07754；P10848；P49384；P14675；P07246；P08319P49385；Q9QYY9；Q64563；Q09669；P80468；A6ZTT5；P10127；Q6XQ67；P38113；P28332P41681；Q5R7Z8；Q5XI95；P40394；Q64437；P41682；031186；Q7U1B9；P71818；P33744P0A9Q8；P0A9Q7；P81600；P72324；Q9SK86；Q9SK87；A1L4Y2；Q8VZ49；Q0V7W6；Q8LEB2Q9FH04；P81601；P39451；046649；046650；Q96533；Q3ZC42；Q17335；Q54TC2；P46415P19854；P11766；P93629；P28474；P80360；P81431；A2XAZ3；QODffHl；P80572；019053P12711；P79896；P80467；Q9NAR7；Q00669；P21518；P25139；P48584；Q00670；P22245Q9NG42；P28483；P48585；P51551；Q09009；P51549；P21898；Q07588；Q9NG40；Q27404P10807；P07162；Q09010；P00334；Q00671；P25721；Q00672；P07159；P84328；P37473P23361；P23277；Q6LCE4；Q9U8S9；Q9GN94；Q24641；P23278；Q03384；P28484；P51550Q05114；P26719；P17648；P48977；P81786；P14940；P25988；P00332；Q2FJ31；Q2G0G1Q2YSX0；Q5HI63；Q99W07；Q7A742；Q6GJ63；Q6GBM4；Q8NXU1；Q5HRD6；Q8CQ56；Q4J781P39462；P50381；Q96XE0；P51552；P32771；A7ZIA4；Q8X5J4；A7ZX04；A1A835；Q0TKS7Q8FKG1；B1J085；P25437；BlLIPl；Q1RFI7；P44557；P39450；Q3Z550；P73138；P71017P33010 ；P35630 ；Q24857 ；Q04894 ；P25377 ；057380 ；P0A4X1 ；P0A4X0 ；P25984 ；P75214 ； P14941 ；Q3ZCJ2 ；070473 ；P14550 ；Q9JII6 ；P50578 ；P51635 ；Q9UUN9 ；以及 P27800。在一些实施方案中，可以由用来工程化用于生产支链醇的光合有机体的核酸分子所编码的醇脱氢酶由以下物质编码酿酒酵母的ADHl (Genbank蛋白登录号CAA58193)、ADH2 (AAA34408)、 ADH3 (CAA89229)、ADH6 (CAA90836 ；GI :984691)、ADH7 (CAA4223)、GRE2 (CAA88277)、 SFAl (CAA91578)、或 YPRl (CAA56686)；树干毕赤酵母的 ADH3 (ABN65575)、ADH6 (EAZ62840)、 ADH7 (CAA42237)、或 GRE2 (CAA88277)；结核分枝杆菌的 ADHl (ABK75278)、ADHs (AAK45115)、 或 adhb (CAE55322)；大肠杆菌的 yqhD (Genbank 登录号 YP_001745276，GI :170682079)、或马的ADHE(P00327)、或在US 2009/0288337 (通过引用结合在此)中披露的编码醇脱氢酶的任何基因。这些基因、这些基因的变体或同源物、或已知是或怀疑是编码醇脱氢酶的基因中的任何一种都可以试验用于工程化本发明的、生产一种或多种支链醇的宿主菌株。在一些优选实施方案中，重组光合微生物包括编码2-酮酸脱羧酶的异源基因以及编码醇脱氢酶(如支链醇脱氢酶)的异源基因。在一些实施方案中，光合微生物携带编码乳酸乳球菌的kdcA的异源基因以及编码酿酒酵母的adh6的异源基因。在一些实施方案中，光合微生物携带编码树干毕赤酵母的pdc6(也称为pdc6)的异源基因以及编码酿酒酵母的adh6的异源基因。包括编码2-酮酸脱羧酶的异源基因以及编码醇脱氢酶的异源基因的重组光合微生物可以用于生产支链醇，如异丁醇、2-甲基-1-丁醇或3-甲基-1-丁醇中的一种或多种。众多的多肽可以提供在整个路径中催化多个特定反应的额外的酶活性。例如，乙酰乳酸合酶是对催化丙酮酸酯到2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸酯的转化的酶的一种命名的实例。因为酶的命名在有机体之间是不同的，所以应注意以上提供的名称仅是对于一类催化该路径的特定步骤的酶而言示意性的。考虑用于本发明的这些酶是催化所展示的这些反应的那些酶并且不限于所提供的那些酶名称。此外，编码所希望的酶活性的这些基因的同源物(在基因组和宏基因组序列数据库中识别出)也可以被测试其活性并且引入光合微生物中。异源的多肽编码序列连接到适当的基因表达调节元件(即，启动子和终止子)上。 这些基因和同源物的具有增强的催化活性的经改变的形式(例如，更小的底物Km、减小的变构反馈抑制等等)也可以由无规则的或定向的诱变产生、并且接着将其引入光合微生物中。催化反应(1)、(11)和(16)的底物至产物的转化的示例性多肽包括乙酰乳酸合酶(EC 2.2.1.6)。已经识别了编码乙酰乳酸合酶的多个基因，可以测试它们的适当活性并且将其引入光合微生物之中，这些基因包括但不限于编码以下酶(UniProtKB登录号)的基因P27818、Q41768、Q6K2E8、P09342、P14874、Q41769、Q7XKQ8、P09114、P27819、P17597、 P37251、P42463、Q5KPJ5、Q6SSJ3、019929、P08142、Q09129、078518、P27696、Q04524、Q02137、 008353、Q57725、Q59498、P0A623、033112、P0A622、P69683、P69684、Q1XDF6、P36620、P27868、 Q7U5G1、P07342、P00892、P66947、P66946、067703、028555、P37252、P57320、085294、Q89AP8、 Q9TLY1、P00894、Q9MS98、078451、P45260、Q02140、Q57625、027492、Q59499、P65162、033113、 P65161、P51230、Q1XDQ7、P21622、Q55141、P57321、085293、Q89AP7、Q9RQ65、P00893、P45261、 P40811、P0ADG2、POADG1、P0ADG3、POADGO、P0ADF9、P0ADF8、以及 Q04789。催化反应⑵、(12)和(17)的底物至产物的转化的示例性多肽包括酮醇酸还原异构酶(EC 1.1.1.86)。已经识别了编码酮醇酸还原异构酶的多个基因，可以测试它们的适当活性并且将其引入光合微生物之中，这些基因包括但不限于编码以下酶(UniProtKB登
录号)的基因Q05758、P38674、082043、P84534、P78827、Q01292,P06168、Q81T69、Q73BAUQ81G13、Q63DX9、Q6HLF4、Q8G6V2、Q9Z565、Q9UWX9、Q81S27、Q73A47、Q81F27、Q63CV4、Q6HKA1、Q8G6V1、Q9FBT8、Q97YJ9、Q97X13,B0CE35、A1TRT6、Q6F821,Q1ILZ3,A5G1L8、A1W6T4,A3N3E9、A6VLU1、AOKEMl、A4STE2、Q8UDV0、Q0VSB5、Q0AB89、A6TTL2、Q2IJB7、Q8YUM5、Q3MGX7、067289、A8ERD8、028294、A0JXZ6、A8I679、A1KAB7、Q5NXP4、A7Z7B9、A7GMU0、Q9K8E7、Q65GI7、A8FFW6、Q5WEN2、P37253、A1UT97、Q6G2T6、Q6FZ98、A9IW67、Q7VRM0,Q2KWH7,Q7WCP6、Q7W566、Q7VZU4、Q89G50、A5EPB5、A4YZA6、Q2YQN2、Q57CC7、A9M637、Q8YI21、A5VRC9、B0CHG8、Q8FZU1、P57655、051888、Q89A20、Q9RQ55、Q9RQ47、Q9AQ96、Q9RQ51、Q9AQ97、Q9AQ98、Q9AQA0、Q9AQ99、Q1BUZ9,A0K937、Q0BDB6、A3MI87、A2S472、Q62IM0,A1V2K2.A3NT91、Q3JUC2、A3N7K4、Q63VP6、Q39ED2、Q2SZP8.A4JGE3,Q142I6、A4XIL7,A7ZEF1、A7GXQ8、A0RQ02、A7I0D4、A8FL53、A7H4H9、Q9PHN5,A1VYZ2、Q5HVD9、Q3AEQ7、Q9A6H4、BOiMYl、A9WC26、Q3APC3、A1BES5、Q8KER7、Q1R092,Q7P0H9、A8ACS4、A5CPY6、B0RIN6、Q97MV0、A6LPX8、Q18C83、A0Q0E9、A9KQ65、A3DIEUQ6NHN2、Q8FPXUA4QDN4、Q57179、Q4JUN9、Q47BH8,Q3Z891,A5FR44.Q3ZXI2、Q1J0T2、Q9RU74、Q30ZD3,Q24XT5,A4J179、Q72CA6、A1VE41、A8LS39,A7ZTX6、P58256、A8A6N0、A1AHU6、Q0TAU6、Q8FBR2、B1IWC4、P05793、Q1R4G3、A4WG34、A7MQH1,Q6CZD1、Q2NAU8、Q0RDI8、Q2J6V2、Q5KWJ2,Q39W76、Q74BW9、A4IRH9、A5G7V3、Q7NH80、A9GZJ4、Q5FRY8、Q0BS26、Q4QMN4,A5UE34,A5UHHUP44822、Q0I511、B0UWE8,Q2S9V9,AIffUff3、Q5V520,Q18GT4、Q17X66、Q7VGW6、Q1CUH1、Q9ZMA9、025097、A4G4H8、Q0C516,A6SZZ1,Q28T07、A6W7N6、A6TGG1、Q02138、A2RKQ6、Q02YY8、Q6AEP2、Q04P56、Q056H8、Q72M00、Q8EYH2、P97115、Q03UU4、Q92A29>Q71Y36,Q8Y5S0、A0AK91、Q2W1G2、A0L626、Q65WK8、AlTZlUQ11I83、Q8TJJ4、A7I5I8、Q46FY8,Q12Y03.Q605K9,Q1GZE9,Q2FM37、Q58938、Q8TX44、A2SR20、A4FYE4、A6VJW0、Q8PZ26、A3CXJ5、Q6LZH4、A2SHM0,A5UMJ9,Q2NI95、027491、A0B5E0、A6USF9、B0JRP2、Q2RIS6、A0QJC6、Q59500、P65150、A1KMZ6、A4TE07、033114、Q73VH7、A0QUX8、A3PXP9、A1UE95、Q1BAR7,A5U713、P65149,A0PPY3.A1T6Y9、Q3IRQ2、Q5F7E5、A9M177、Q9JTI3、Q9JYI2、A1KUZ8、QOAGMO,Q82UZ3、Q1QJU8、Q2YBU1、Q3J875、A6Q461、Q3SQ46、Q5YRW2、Q2G623、Q8EN66、A6WZX5、A1B2W3、A7HVZ2、Q9CLF1、Q3B594、A1AS39、Q4FPQ6、A9BGP6、Q7MYK9,Q6LVZ5、A1VN04、Q12B50,A4SXR3、Q9F7L6、Q6A7Z2、A3PEE9、A2C482、A8G6C6、A2CB87、A2BY22、Q319H3、Q7VAR8、Q7V8M5、Q7V0F0、A2BSN6、Q46JF6、A4SFC5、Q48N66、A6VCE7、Q02FX9、Q9HVA2、Q1I4R5、Q4K608、A4XR11、A5W952,Q3K6T1、B0KHU2、Q88DZ0、Q888N4、Q4ZY66、A4VPI6、Q4FUB6、Q1QDE6、A5WD25、Q9UZ09、Q8ZTE1、A4WLK6、A3MX05、Q8U2A3、A1RRZ8、Q0KCU2、Q473V5、Q1LPX7、Q8XXN8,A9WP08、Q2K6M2、Q1MED4、Q98KM7、Q52955、Q7UKY0、Q21T70、032414、Q2IUS3、Q07PJ7、Q6N869、Q211Z6、Q139A2,Q2RX71,A3PH14、Q3J5C0、A4WQ93、Q0S2H3、A7NJH8、Q168NUQ1ARE4、A1AW99、Q21HN0、A4FMQ5、A8M5F9、A9MJN4、Q57HU2、Q5PJZ5、A9MXE7、Q2S0M9、Q8Z38UA4X4A5、P05989、A8GL54,Q8E9D5、Q31UL0、Q329V3、Q7UB34、Q3YVJ0、Q5LTP7、Q1GE81、A6UAW6、Q2NQA9、Q02CM4、A9GW78、Q1GT37、A5V3W3、A7X4M9、A6U3E1、Q2FF68、Q2FWK4、A5IUK2、Q2YUF3、Q5HEE5、A6QIQ2、P65151、P65152、Q6GF17、Q6G7Q2、A8Z4V9、P65153、Q5HMG0、Q8CRQ6、Q4L7T9、Q49Z11、Q59818、A8AVN4、Q8DW43、Q04M32、Q97SD7、Q8DR03、A4W3V8、A3CQ86、A4VXL3、Q5LXV0、Q5M2F2、Q03IJ9、Q9F0I7、Q4J8K9、Q30T61、Q971A9、Q31MY7、Q8DGR0、Q2JXL2、Q2JKN5、Q5N667、A5GMM6、Q7U5QUA5GRI8、Q0IC80、Q3AVC2、Q3ALC5、Q0AV19、P29107、Q47SB6、Q9WZ20、A5IJM5、Q72JC8、Q5SJ03、 Q8RDK4、Q31HZ1、Q3SHE4、Q8KTR6、Q10WP7、Q83HI9、Q83GP6、Q0W834、A5CWZ1、A5F449、Q9KVI4、 Q5E1S3、Q87TN4、Q8DDC8、Q7MQH3、Q7M851、Q8PH09、Q3BPK3、Q4UYF7、Q8P5L5、Q2P757、Q5H4C1、 Q9PCF9、Q87CM2、A1JI57、A7FD32、QlCBSl、Q8ZAC2、Q1CNM0、A4TRD9、Q66G37、以及 Q9X5F8。
催化反应(3)、(13)和(18)的底物至产物的转化的示例性多肽包括二羟酸脱水酶(EC 4.2.1.9)。已经识别了编码二羟酸脱水酶的多个基因，可以测试它们的适当活性并且将其引入光合微生物之中，这些基因包括但不限于编码以下酶(UniProtKB登录号)的
基因Q10318、P39522、Q6FCR9、Q5P8J4、Q7WQA2、Q7WC98、Q7W069、Q89LK8、Q394V3、Q8FPX6,Q8TPV2、Q5Z0M2>Q3IJH1、Q475B2、Q98BZ8,Q49Z08、Q6F6Q0、Q5P6F1、Q7WJP7、Q7W497、Q7VUN6、Q89KY5、Q39DS9、Q8FMR1、Q8TKM8、Q5YX61、Q3ID04,Q46YI9、Q98LB3、Q49UX2、Q5NY71、Q7WFQ5、Q89HA2、Q5YRV8>B0CEN4、A1TMA7、QlILZO、A0LSR8,A5FXD0、A3MYG9、A6VLE6、A0KQS4、Q9YG88、A4SHE9、Q8UE43、Q2IH17、A7HIA1、Q8YTE6、067009、A8EWJ4、029248、A0JXZ9、A8IES7、A1K344、A7Z5T7、A0RCL3、Q81S26、Q9XBI3、A7GNQ7、Q81F26、Q63CV3、Q5L9I8、Q64PS6、Q9K8E4、Q6HKA0、Q65IB0、A8FEC5、Q5WEM9、P51785、Q8A608,Q6G543、A9ILS3、A1A0T7,Q8G3H2,Q7VRL8、Q491Z0、Q2KZT7.Q2YNW9,Q57FS2、A9M6V2、Q8YEN0、A5VN43、BOCILl、Q8G353、P57656、051887、P59426,Q056W3、Q9RQ56、Q9RQ48、Q9RQ52、A3MLQ5、A2SAC7、Q62LG7、A1V5Z0、A3NSI6、Q3JV12.A3N6U9,Q63WB9、Q2T0B6、A4JN03、A4XHR9、A7GVT2、A0RRN7、A7I439、A8FJH6、A7H1A6、Q9PJ98、A1VX91、Q5HXE4、Q3AER0、P55186、A9WF68、Q3APB9、A1BES8、Q8KER4、Q1QU47、Q7NYJ7、A5CPY3、B0RIN3、Q97EE3、A6LTK6、A5N8V4、A0Q0E8、P31959、A9KT71,A3DIY3、Q47UN7、Q6NHN6、A4QDM9、Q8NQZ9,Q4JUN3、Q11NN5、Q47JC0、Q3Z888、A5FR35、Q3ZXH9,Q1IYZ8、Q9RV97、Q317H9、Q725QUA1V9E1、A8LKN5、A7ZTX3、Q8XAV1、A8A6M7、A1AHU3、Q0TAU9、Q8FBR5、B1IWX5、P05791、Q1R4G6、A4WG37、Q6CZC7、BOTZCO、Q2J4D1、A0Q6R5、Q5NH32,Q5KYA5、Q39W79、Q74BW7、A5G7V6、Q7NGK1、Q5FN26,Q0BQR6>Q4QMF8、A5UDY7,A5UHP2,P44851、QOIlFl,BOUff18、Q2SA20、AlWTGl、Q5V545、Q7VHW3、A4G341、Q0C2B5,A8AB39、A6SVP5、A6TGF8、Q02139,Q02YY5、Q6AEN9、Q04RA5、Q053H5,Q72TC0、Q8F219、Q03UL2、Q92A32>Q71Y38,Q8Y5S2、A0AK88、Q2W485、A0L8Q3>Q65QD4,A6W1Q9、A6UUU2、A7I7L0、Q46AU2、Q12TW7、Q606D6、Q1H4H6、Q2FMZ1、Q58672、Q8TW40、A4FZM0、A6VIV7、Q8Q078、A3CU68、Q6M0F3、A2SFL0、A5UML4、A4YEN4、Q2NE10、027498、A0B6Y9、A6URV4、B0JJP7、Q2RG93,A0QMH2、P65155、006069、Q73TT7、A3PSS2、P65154、A0PMV4、Q3IMV2、Q5F8G6、Q9JUE0、Q9JS61、A1KU04、Q0ADX6,Q82XY7、Q1QRS7、Q2YC67、Q3J9N3、A6Q182、Q3SW60、A1SM84、Q2G7E9、Q8EN63、A6WV39、A6LDP0、A1B673、A7HXI4、P57957、Q3A3A5,Q3B589、A1AS43、Q4FM19、Q7MYJ5、Q6LLH7、Q6KZ30,A1VR98、Q12BW0、A3PCI2、A8G4F2、A2CAC6、A2BW57、Q31BA3、Q7VC95、Q7TV16、Q7V1T1、A2BQQ9、Q46LF6、A4SFC2、Q48PA6、Q15MY9、A6UYF6、Q02U62、Q9I6E0、Q1IGF7、Q4K498、A4Y036、A5WAG2、Q3K559,B0KN82、Q88CQ2、Q87V83、Q4ZZ83、A4VRN4,Q4FS54、A1SRU7、Q9UZ03、Q8ZYU6、A4WN46、A3MUK8、Q8U297、A1RSI5、Q8XWR1、A9WP05,Q2K9I7,Q1MIB2、Q92M28、Q7UJ69、P31874、Q21X56、Q2ISQ1、Q07IE7、Q6N9S5、Q2RTF9,A3PRB5、Q3IXP4、A7NNA3,A5UY13,A1AWH6、Q21NV7、A8M5F5、Q57HU7、Q5PK00、A9MXE2、Q8Z377、P40810、A1SAS5、A3D9T2、A6WTI9、A9L621、Q12IN9、Q088M9、BOTJR3、A3Q9L6、Q8E9D9、A8GZD9、A4YBI7、A0KS32、A8G0Z3、Q0HNC3、Q0HQG3、A1RPG2、Q31UL3、Q329V0、Q0SYW3、Q83PI6、Q3YVJ3、Q5LN98、Q1GDP8、A6UD23、Q2NQA6、Q1GTW7、A7X4M5、A6U3D8、Q2FF71、Q2FWK7、A5IUJ9、Q2YUF6、Q5HEE8、A6QIQ0、P65156、P65157、Q6GF19、Q6G7Q4、A8Z4V6、P65158、Q5HMG3、Q8CNL6、Q4L7T6、Q82E99、069198、Q8DRT7、Q04I44、P65159、P65160、 A4W3W3、A3CR42、A4VXL9、Q5LYH1、Q5M334、Q4J860、Q30UI5、A6QD02、Q97UB2、Q96YK0、Q67KX6、 Q2LXP6、Q3IQLl、Q8DK13、A0LF54、Q2JTX6、Q2JK60、Q5N3N2、Q7U763、A5GTE2、Q3AXL0、Q3AK67、 P74689、Q47MS7、Q9WZ21、A5IJM4、Q72JA8、Q5SIY0、Q8RDJ9、Q31I28、Q8KTS9、Q11AD1、Q83HI6、 Q83GP9、A1WMU5、A5F497、Q9KVW0、Q5E1P2、Q87KB6、Q8DDG1、Q7MGI8、Q7MAN4、Q8PQI0、Q3BYS5、 Q4UZT2、Q8PDJ3、Q2NY76、Q5GUY8、Q9PH47、Q87F63、A1JI53、A7FD26、Q1CBS9、Q8ZAB3、Q1CNM8、 A4TRE8、Q66G45、以及 Q5NLJ4。催化反应(6)的底物至产物的转化的示例性多肽包括柠苹酸合酶 (EC2. 3. 1. 182)。已经识别了编码柠苹酸合酶的多个基因，可以测试它们的适当活性并且将其引入光合微生物之中，这些基因包括但不限于编码以下酶(UniProtKB登录号)的基因 Q8TJJ1、Q58787、Q8TYB1、P58966、以及 026819。催化反应(7)的底物至产物的转化的示例性多肽包括2-甲基苹果酸脱水酶 (EC4. 2. 1. 35)。已经识别了编码2-甲基苹果酸脱水酶的多个基因，可以测试它们的适当活性并且将其引入光合微生物之中，这些基因包括但不限于编码以下酶(UniProtKB登录号) 的基因:P81291 和 Q58673。催化反应(8)、(20)和的底物至产物的转化的示例性多肽包括3-异丙基苹果酸脱水酶(EC 4.2.1.33)。已经识别了编码3-异丙基苹果酸脱水酶的多个基因，可以测试它们的适当活性并且将其引入光合微生物之中，这些基因包括但不限于编码以下酶 (UniProtKB 登录号)的基因(^8316、Q89X98、Q9RTY9、Q65VS0、Q8TLF1、Q8TVF2、Q8PZT3、
027439、Q9UZ07、Q8U2A1、Q1AZC4、Q57TE8、P15717、Q9WYC7、028084、Q89X34、Q9RTI6、Q65V07、Q8TQZ3,Q8TW29、Q8PUG1、027668、Q9V1J0、Q8U0C0、Q1AVC5、Q57SN1、Q8ZRJ0、Q9WZ24、B0CG35、A1TLH6、Q6FEW0、Q1IMI3、A3M1S8、A0LVA3、A5G0G6、A1WAS7、A3MYL1、A6VQL0、Q44427、A0KGM7、A4SR64、Q8UBY9、QOVPIO、Q0A9B0、Q2IJC2、A7HBI2、Q8YX02、Q3M614、067078、A8EQZ0、A1R7K0、A0JXX8、Q74ZM9、A1K4A1、Q5P1J8、P96195、A7Z7B6、A0RBL4、Q81T66、Q73B98、A7GMU3、Q81G10、Q63DX6,Q5LAB1、Q64QP1、Q9K8F0、Q6HLF1、Q65GJ0、A8FFW3、Q5WEN5、P80858、Q8A6L7、A6L1V8、A0ZZS7,Q8G4W2、Q7VQJ8,Q493R2,Q7WKH6、Q7W931、Q7VY75、Q2YLP7、Q57AZ0、A9M8P2、Q8YJC9、A5VSN3、B0CIF7、Q8FYG9、P56934、085065、P59519、Q5WPZ8、085072、Q9EVG2、P58945、P48573、031293,Q9EVG5、Q9EVE0、Q9EVH4、Q9EVH7、Q9AQC6、Q9EVG8、Q9EVI6、Q9EVI0、Q9EVI3、Q1BM55、A0AZ60、Q0BAC8、A3MBT5、A2S127、Q62AI6,A1UZ32、A3P7N9、Q3JKG6、A3NM77、Q63JK9、Q393X2,Q2T7H8、A4JMB6、A8MDY8、A4XJ48、A7ZFP0、A7H0L8、A0RMG7、A7HZP6、A8FP33、A7H665、Q9PLWUA1W1X0,Q5HS78、Q00464、Q9ABN0、Q7NUB6、A8ALM7、Q97EE0、A6LPX4、Q18AJ2、A5MZ75、A9KT79、A3DHI4、Q47WG2、Q6NHL0、Q8FPR3、A4QDS8、P58946、Q4JUX2、Q11NN8,Q47HR4,Q30WD3,Q24XT4,Q726X4、A1VAE7、A8LKJ1、A7ZHG4、Q8XA00、A7ZW23、A1A7C0、Q0TLR7、P0A6A7、B1IRA6、P0A6A6、Q1RGC5、A4W6H7、A7MIC7、Q6D0G6、A5FKC6、Q0RDK7、Q2J6W9、Q5KWJ5、Q39W70、Q74BX5、A4IRH6、A5G7U4、Q7NFV7、Q5FUG3、Q0BRH4、Q4QLS2,A5UD83、P44968、Q0I2G3.B0USF4.Q2SJD8,A1WY14、Q5V518、Q7ZAG7、Q7VH31、A4G4F5、A6T015,Q28W60,A6T4L7,Q02142、A2RKR3、Q02YY1、Q6AFK7、Q72RC4,Q8F4E6、Q03UM2、Q92A26、Q71Y33,Q8Y5R7、A0AK94、Q2VZV4.A0L8J4.A1U0Y0,Q0AT09、A6VX34、Q11CQ6、A7IA28、Q606F2、Q1H0L4,P81291、A4YF03、B0JY97、Q2RG98、A0QJB7、Q7TXH6、A1KMY2、A4TE23、033123、Q73VI7、Q938C9、A3PXR2、A1UEA8、Q1BAQ4、A5U6Z9、053237、A0PPZ6、A1T700、Q3IRQ4、Q5F8T1、A9LZF7、Q9JU82、Q9JZI5、A1KU80、Q82WI9、Q1QHI4、Q3J716、A6Q5L6、Q3SNV3、Q5YRY0,AISLff5,Q2G958、Q8EN69、A6WXG4、Q04DA3、A1B513、A7HT10、Q9CJN7、Q4FP15、Q7N127、Q6LV26、P18250、Q6L0K5、AlVRRO、Q126M9、A4SWW8、A3PAX7、A2C088、A8G2R6、A2CCJ0、A2BUN7、Q31CS6,Q7VDT0、Q7V4U5、Q7V336、A2BP55、Q46HB8、Q48K99、Q15QR2、A6V2V3,Q02PT4,Q9HZA3、QlICWO、Q4KF08、Q3IJS4、A4XVW2、B0KF81、Q88LE8、Q884C2、Q4ZUZ6、A4VKE7、Q4FRU7、Q1QAF2、A5WGT5、Q8ZW4UA4WMI6、A3MWJ4、059391、A1RVH3、Q5JFV6、Q46YV7、Q44023、Q8XXX3、Q2K376、Q8VMA6、Q1MAJ9、Q98EF1、Q92L76、P55811、P5525UP17279、Q7UIA7、Q2J3A1、Q07UU3、Q6ND69、Q21CT4、Q13DU7、Q2RV55、A3PMQ9、Q3IZI8、A4WNV5、A7NJH2、Q16CH7、A5UUP5、A1AW36、Q21IY3,A4FMP2、A8M5I3、A9MQE0、Q5PDG3、Q2S0M6、Q8Z9I2、A4X4C8、014289,A8G9Q9、A1S2E2、A3CZK7、A6WIB7、A9KY15、Q07WHUB0TQM2、A3QIN8、Q8E9N4、A8H999、A4Y2M2、A0L1Q8、A8FQ85、Q0HE67、Q0HZT2、A1REY2、Q326G3、Q32K22、Q0T8C6、Q821C2、Q3Z5T8、Q5LX06,Q1GDM6、A6UE05、Q2NVW5、Q01Z81、A9GL99、Q1GR84、A7X4N3、A6U3E4、Q2FF65、Q2FWKUA5IUK5、Q2YUF0、Q5HEE2、A6QIQ5、P63435、P63436、Q6GF14、Q6G7P9、A8Z4W2、P58947.Q5HMF7,Q8CNL1、Q4L7U2、Q49Z14、Q82JR8、086534、A8AWP5、Q9AIM3,Q8DTG4、A3CMJ2、Q5LZF4、Q5M406、Q03KB3,Q4JC09、Q30NZ0、A6Q6J8、Q97VY2、Q974R0、Q67MJ2、Q2LWJ2、Q31LZ1、Q8DKF0、Q2JQU3、Q2JPG2、Q5MZY3、A5GIG7、Q7U9J4、A5GWH5、Q0IDD5、Q3AW2UQ3AN00、P54384、Q47SA3、Q72JB3、Q9ZND5、Q8RDK2、Q3mi2、Q3SHL1、P4960UA5CX27、A5F5E2、Q9KP81、Q5E858、A7MWC3、Q87SS9、Q8DED9、Q7MP79,Q7M9Z9,P58948、Q3BPJ6,Q4UYG5、P58949、Q2P765、Q5H4D1、Q9PAX0,Q87BP9、P07264、A1JJH5、A7FM86、Q1C1Z4、Q8ZIH0、Q1CMP7、A4TQA4、Q66EM3、Q5NRC5、029626,Q7WKH5、Q7W930、Q7VYIUQ7NW22,Q9RTY5,Q65VR9、Q8TJM9、Q8TX94、Q8PZ49,026917,Q9UZ06、Q8U2A0、Q57TE9、P04787、Q9WYC8、028513,Q7WIN3、Q7W749、Q7VY74、Q7NUB8、Q9RTI0、Q65V08、Q8TU71、Q8TW3UQ8PWT6、027440、Q9V1I9、Q8U0B9、Q57SN0、Q8ZRI9、Q9WZ25、Q8TRF7、A1TLH5、Q6FEV8、Q1IMI4,A3M1S9、A0LVA2、AlWATO、A3MYL0、A6VQL1、Q44428,A0KGM6、A4SR65、Q8UBR0、QOVPI1、Q0A9A9、Q2IJC3、A7HBI3、Q8YX03,067399、A8ETJ8、A1R7J9、A0JXX7、A8ILN3、A1K4A2、Q5P1J7、P96196、A7Z7B5、Q81T65、Q73B97、A7GMU4、Q81G09、Q63DX5、Q9K8F1、Q6HLF0、Q65GJ1、A8FFW2、Q5WEN6,P94568,A0ZZS8,Q8G4WUQ7VQJ9、Q493R3,Q2KYL4,Q89X27、A5E8Z8、Q2YL51、Q579A4、A9MCG4、P65275、A9WVP8、P65276、P56935、085066、P59516、085073、Q9ZEZ5、P59019、P48574、031294,Q0BAC6、A3MBT7、A2S129、Q62AI8、A1UZ33,A3P7N7、Q3JKG8、A3匪75、Q63JL1、Q2T7H7、A4XJ49、A8FP32、A7H664、Q9PLW2、A1W1W9,Q5HS79、Q9ABN1、B0T3B7、A9WC30、Q1QUQ9、A8ALM8、A5CQN3、BOREYl、Q97EE1、Q18AJ1、P31960、Q47WGUQ6NHK9、Q8FPR2、A4QDS9、Q8NQV7、Q4JUX3、Q11NN7、Q47HR2、Q30WD2、Q726X3、A1VAE6、A8LKI9、A7ZHG3、Q8XA01、A7ZW22、A1A7B9、Q0TLR8、Q8FL79、B1IRA7,P30126,Q1RGC6、A4W6H6、A7MQ53、Q6D0G5、Q2NC39、Q0RDK8、B0TW84、Q2J6X0、A7NES0、Q2A1A1、A0Q406、Q0BK19、Q5KWJ6,A9HS54、Q5FUG4、Q0BRH5、A0M367、Q4QLS1、A5UD82、A5UIC6,P44438、Q0I2G4、B0USF3、Q2SJD7,Q7VH32、Q28W72,A6W7Q8,A6T4L6,Q02144、A2RKR1、Q6AFK6,Q04RN8,Q051Y3,Q72RC5,Q8F4E5、Q03UM3、Q92A25、Q71Y32,Q8Y5R6,A0AK95、Q2VZV3、A0L8J5、A1U0X9、A6VX35、Q606F3、Q8RP98、Q1H0L5、Q58673、A2SHT0、A4YF02、Q2RG99、A0QJB6、P65278、AlKMYl、A4TE22、033124、Q73VI8、Q938C8、A3PXR3、A1UEA9、Q1BAQ3、A5U6Z8,P65277、A0PPZ7、A1T701、Q5F8T3、Q50974、P50181、A9LZF9、Q9JU81、Q9JZI6、A1KU82、QOAGYl、Q82WI7、Q1QHH8、Q3JCC5、Q3SNU7、Q5YRYUAISLff4,Q2G955、Q8EN70、A6X449、Q04DA2、Q9LCR5、A1B515、A7HT11、Q9CJN8、Q4FP16、Q7N126、Q6LV27、A1VRR1、Q126M8、A4SWX0、Q48K98、A6V2V4、Q02PT3、Q9HZA4、Q1ICV9、Q4KF07、 Q31JS5、A4XVW1、B0KF82、Q88LE7、Q884C1、Q4ZUZ5、A4VKE8、Q4FRU8、Q1QAF3、A1SVE8、A5WGT4、 Q8ZW36、A3MWK3、059393、A1RVI0、Q5JFV7、Q46YV9、Q44022、Q8XXX4、Q2K2V2、Q1MA52、Q98E51、 Q92LA1、Q7UIA6、Q21XI0、Q2J3A7、Q07UT6、Q6ND74、Q21CT1、Q13DV3、Q2RV54、A3PMQ7、Q3IZJ0、 A4WNV6、A7N JH1、Q16D18、A5UUP4、Q1AZC3、A1AW3 5、Q211Y4、A4FMP1、A8M514、A9MQE1、Q5PDG4、 Q8Z913、A4X4C9、A8G9Q8、AlS2E3、A3CZK8、A6WIB8、A9KY16、Ql2SE4、Q07WH2、B0TQM3、A3QIN7、 Q8E9N5、A8H998、A4Y2M3、AOL1Q7、A8FQ86、Q0HE68、QOHZT1、A1REY3、Q326G4、Q32K23、Q0T8C7、 P59714、Q3Z5T9、Q5LX07、Ql⑶M5、A6UDX5、Q2NVW6、QO1Z80、Q1GR82、A7X4N4、A6U3E5、Q2FF64、 Q2FWK0、A5IUK6、Q2YUE9、Q5HEE1、A6QIQ6、P65279、P65280、Q6GF13、Q6G7P8、A8Z4W3、Q8NVI9、 Q5HMF6、Q4L7U3、Q49Z15、Q82JR9、086535、A8AWP6、Q9AIM2、Q8DTG5、Q97QF9、A4W420、A3CMJ3、 A4VXS3、Q5LZF5、Q5M407、Q03KB4、Q4JClO、Q30RK1、A8Z5R9、Q97VY3、Q974Q9、Q67MJ3、Q2LWJ1、 P74207、Q47SA2、Q72JB2、Q9ZND4、Q8RDK1、Q3SHL2、A5CX59、A5F5E3、Q9KP80、Q5E859、A7MWB9、 Q87ST0、Q8DED8、Q7MP80、Q7M887、Q8PH04、Q3BPJ7、Q4UYG4、Q8P5K9、Q2P764、Q5H4D0、Q9PAX1、 Q87BQ0、A7FM87、Q1C1Z3, Q8ZIH1、Q1CMP8、A4TQA5、Q66EM4、以及 Q5NRC4。
催化反应(9)和0 的底物至产物的转化的示例性多肽包括3-异丙基苹果酸脱氢酶(EC 1. 1. 1. 85)。已经识别了编码3-异丙基苹果酸脱氢酶的多个基因，可以测试它们的适当活性并且将其引入光合微生物之中，这些基因包括但不限于编码以下酶(UniProtKB 登录号)的基因Q9SA14、Q7WNM3、Q89XA0、Q47HR1、P93832、Q7WKH4、Q89X19、Q479H7、 Q9FMT1、P87256、P87257、Q6FEV6、P24404、Q2IJK7、Q8YXA2、Q3M8T9、066607、029627、Q8NKB8、 060027、Q5P1J6、P96197、Q81T67、Q73B99、P05644、P12010、Q81G11、Q63DX7、Q5LAB4、P54354、 Q9K8E9、Q6HLF2、Q65GI9、P41019、Q5WEN4、P05645、Q8A6M0、Q8G500、Q7VQJ7、Q493R1、Q2KYL5、 Q7W929、Q7VY73、P29102、Q2YL58、Q579B1、Q8YCX4、Q8FVF3、P56933、085064、P59515、Q5WPZ9、 085071、Q9EVG3、P59027、P48572、031292、Q9EVG6、Q9EVE1、Q9EVH5、Q9EVH8、Q9AQC8、Q9EVG9、 Q9EVI7、Q9EVI1、Q9EVI4、Q845W3、Q62AI9、Q3JKG9、Q63JL2、Q393X4、Q2T7H6、Q9PLW0、Q5HS77、 P87186、QO1987、014429、P07139、Q6PY58、Q9HDQ5、Q3AEQ2、Q9ABN3、Q12545、Q3APC4、P59028、 QlQURO、Q7NUC2、A5CPZ4、B0RIP4、Q97EE2、P31958、Q47WG3、Q6NHM7、Q8FPV5、A4QDP9、P94631、 Q4JUQ0、Q6B458、Q3Z896、Q3ZXI7、QlIZK2、Q9RTH9、Q30WD0、Q24XT2、Q6ANR1、Q726X1、Q8X9Z9、 Q8FL76、P30125、Q1RGC4、Q6D0G7、Q2J6V8、Q5KWJ4、Q39Y29、Q748X2、Q7NFH4、Q5FUG5、Q4QLS3、 P43860、Q2SJD6、Q9HDQ1、Q7VH33、Q28W67、P23390、P41766、Q02143、Q6AEP6、Q72RH7、P24015、 Q92A27、Q71Y34、Q8Y5R8、Q2VZV2、Q65V05、Q606F4、Q58130、027441、Q2RGA0、A0QJC2、P94929、 A1KMY9、A4TE12、Q9Y897、033117、Q73VI1、A3PXQ2、A1UE98、Q1BAR4、A5U706、P95313、A0PPY6、 A1T6Z4、Q5F8T6、P50180、Q9JU79、Q9JZI9、P34738、Q82WI6、Q2Y7Q8、Q3JCC4、Q3SNU3、Q5YRX2、 Q2G4X5、Q8EN68、Q9CJN6、Q3A3B2、Q3B595、Q4FP17、059930、Q7N128、Q6LV25、P34733、P08791、 094114、Q31B91、Q7VC80、Q7V842、Q7V1R9、Q46LE2、Q48K97、Q51375、Q4KF05、Q3IJS3、Q3KF21、 Q88LE5、Q884C0、Q4ZUZ4、Q4FRV0、Q1QAF5、Q46YW0、Q1LKH7、Q8XXX5、Q2K2V0、Q1MA50、Q98E57、 Q92KY8、Q7UIE1、Q21XI1、Q2J3B4、Q6ND82、Q21CS1、Q2RV53、Q3IZJ3、Q0S2H1、Q21IY5、A4FMQ2、 Q96WT9、Q57TE7、Q5PDG2、Q2S0M8、Q8Z9I1、P37412、P18869、Q8E9N3、Q326G2、Q32K21、Q83SP1、 Q3Z5T7、Q5LWZ5、Q2NVW4、P29696、Q6TWC4、Q00412、Q2FF66、Q2FWK2、Q2YUF1、Q5HEE3、P65100、 P65101、Q6GF15、Q6G7Q0、Q8NVJ0、Q5HMF8、Q8CNL2、Q4L7U1、Q49Z13、Q82JN6、086504、Q8DTG3、Q8DPJ4、Q5LZF3、Q5M405、Q30RK2、Q9UXB2、P50455、Q67JY2、Q31N34、P59029、Q2JTN8、Q2JL30、 Q5MZ40、Q7U840、Q3AYS1、Q3AIH4、P73960、P24098、Q47SB4、Q9WZ26、P61494、Q5SIY4、P61495、 Q8RDK0、Q3IHIO、Q3SHL3、Q56268、Q9KP82、Q5E857、Q87SS8、Q8DEE0、Q7MP78、Q7M886、Q8PH05、 Q3BPJ8、Q4UYG2、Q8P5L1、Q2P762、Q5H4C7、Q9PAX3、Q87BQ1、P41926、P18120、P04173、Q8ZIG9、 Q66EM2、Q9P3Y0、Q96WI0、以及 Q5NPQ9。催化反应(10)的底物至产物的转化的示例性多肽包括苏氨酸脱氨酶 (EC4. 3. 1. 19)。已经识别了编码苏氨酸脱氨酶的多个基因，可以测试它们的适当活性并且将其引入光合微生物之中，这些基因包括但不限于编码以下酶(UniProtKB登录号)的基因P09367、P25379、Q9ZSS6、Q9KC63、P37946、P53607、Q39469、Q04513、P04968、P46493、 Q02145、P66898、Q9X7F1、P66897、Q9CKJ2、P20506、P25306、P31212、Q2FF63、Q2FWJ9、Q2YUE8、 Q5HEE0、Q99SJ1、Q7A4H2、Q3V7T5、Q3V7T4、Q8NVI8、Q5HMF5、Q8CNK9、Q4L7U4、Q49Z16、P0AGF8、 P0AGF7、P0AGF6、P11954、P0AGF9、Q2FH01、Q2FYJ3、Q2YY67、Q5HFY5、Q99U50、Q7A5L8、Q6GGX0、 Q6G9C4、Q8NWQ4、042615、094634、P00927、以及 P55664。催化反应(19)的底物至产物的转化的示例性多肽包括2-异丙基苹果酸合酶 (EC2.3.3. 13)。已经识别了编码2-异丙基苹果酸合酶的多个基因，可以测试它们的适当活性并且将其引入光合微生物之中，这些基因包括但不限于编码以下酶(UniProtKB登录号) 的基因Q9LPR4、029305、Q8TKQ6、Q57926、Q8TW28、P58967、027667、Q9UZ08、Q8XXP1、Q97ZE0、 Q974X3、Q8RDK3、Q9C550、030020、Q8THA5、Q58595、Q8TYM1、P58968、027525、Q9V1Jl、Q8XSZ5、 Q97W36、Q971S5、Q8RCF9、004973、004974、Q8UD63、P48575、067862、A0JX36、Q81T68、Q9K8E8、 Q8RL85、P94565、Q7VQJ6、Q89GB0、Q8YIJ3、Q8FZC4、Q9ZEY8、085063、Q89A49、Q5WQ01、085070、 Q9EVG4、P58898、P48571、031287、Q9EVH6、Q9EVE3、Q9EVH0、Q9EVI8、Q9PLV9、Q9A823、Q7P0H2、 Q97MC5、Q8FU05、A4QAP0、P42455、P85362、Q9RUA9、Q8X9Z8、Q8FL75、P09151、Q7NI93、P43861、 Q7VH30、A6WDF2、Q02141、Q72RL9、Q8F445、Q92A28、Q71Y35、Q8Y5R9、P94907、Q7TVV6、Q9CB76、 P96420、A0PVE6、Q9JUK6、Q9JZG1、Q820M0、Q8EN67、Q9CJN5、Q7N129、Q7VBG1、Q7TUV5、Q7V121、 Q48LY5、A6V0X2、Q9HXK5、Q115K2、Q4K6V7、A4XY24、A5VZB6、Q3K7C3、B0KRD9、Q88P28、Q886Y1、 Q4ZX14、A4VNV6、Q8ZW35、Q8U2A2、059390、Q1MDH6、Q98HN3、Q9X7L2、Q7UI51、Q8Z9IO、P15875、 059736、Q8E9N2、Q83SP0、Q39891、Q5HEE4、P63476、P63477、Q6GF16、Q6G7Q1、P58899、Q5HMF9、 Q8CNL3、Q4L7U0、Q49Z12、Q82BV3、031046、Q8DJ32、Q7U892、P48576、Q9WZ23、Q56216、Q9KP83、 Q87SS7、Q8DEE1、Q7MP77、Q7M9W4、P58900、P58901、Q9PCG3、Q87CL8、P06208、Q8ZIG8、Q66EM1、 以及 Q12166。宿主生物用于制备本发明的培养物的宿主细胞包括任何能够将无机碳转化到底物中(该底物进而被转化成支链醇)的光合微生物的细胞。这些有机体包括原核生物以及真核有机体，如藻类和硅藻。二氧化碳(其与碳酸、碳酸氢盐和/或碳酸盐一起定义了术语“无机碳”) 在光合过程中被转化为还原的碳分子。可以使用无机碳源为光合微生物供应无机碳，其中该无机碳源包括以任何方式传递的无机碳、任选地是与任何其他的化合物组合混合，这些化合物不用作主要的碳原料、而是仅作为一种混合物或载体(例如，来自生物燃料(如，乙醇)工厂、发电厂、精炼厂的排放物，以及大气来源)存在。宿主生物包括真核微藻以及蓝细菌(蓝绿藻)。代表性的藻类包括绿藻(chlorophytes)、红藻、 藻、草參录藻(prasinophytes)、灰藻、chlorarachniophytes、^果藻、 杂色藻(chromophytes)、以及甲藻。多种蓝细菌物种是已知的并且是已使用分子生物学技术进行操纵，包括单细胞蓝细菌集胞藻PCC6803和细长聚球藻PCC7942，其基因组已被完全测序。可以使用以下属的蓝细菌一个组包括管孢藻属(Chamaesiphon)、色球藻属(Chroococcus)、蓝细菌属(Cyanobacterium)、蓝菌属(Cyanobium)、蓝纤维藻属 (Dactylococcopsis)、粘杆菌属(Gloeobacter)、粘球藻属(Gloeocapsa)、粘杆藻属 (Gloeothece)、微囊藻属(Microcystis)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、原绿藻属 (Prochloron)、聚球藻属(Synechococcus)、以及集胞藻属(Synechocystis)。另一组包括拟色球藻属(Chroococcidiopsis)、蓝囊胞菌属(Cyanocystis)、小皮果蓝细菌属 (Dermocarpella)、黏囊藻属(Myxosarcina)、Pleurocapsis、史坦尼尔蓝菌属(Stanieria)、 以及异球藻属(Xenococcus)。又另一个组包括节旋藻属(Arthrospira)、博氏藻属 (Borzia)、发毛针藻属(Crinalium)、吉特勒氏线状蓝细菌属(Geitlerinema)、盐螺旋藻属(Halospirulina)、瘦鞘丝藻属(L印tolyngbya)、湖生蓝丝藻属(Limnothrix)、鞘丝藻属 (Lyngbya)、微鞘藻属(Microcoleus)、颤藻属(Oscillatoria)、浮丝藻属(Planktothrix)、 原绿发藻属(ftOchlorothrix)、假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、螺旋藻属(Spirulina)Jjf 塔尔氏蓝细菌属(Marria)、束藻属(Symploca)、束毛藻属(Trichodesmium)、以及灰线蓝细菌属(Tychonema)。又另一个组包括鱼腥藻属(Anabaena)、项圈藻属(Anabaenopsis)、 束丝藻属(Aphanizomenon)、眉藻属(Calothrix)、蓝螺菌属(Cyanospira)、拟筒孢藻属(Cylindrospermopsis)、筒抱藻属(Cylindrospermum)、节球藻属(Nodularia)、以及念珠藻属(Nostoc)；并且另一个组包括拟绿胶蓝细菌属(Chlorogloeopsis)、费氏藻属(Fischerella)、吉特勒氏蓝细菌属(Geitleria)、拟念珠藻属(Nostochopsis)、 Iyengariella、真枝藻属(Stigonema)、胶须藻属(Rivularia)、伪枝藻属(Scytonema)、以及单歧藻属(Tolypothri)。此外，可以采用不同的藻类，包括硅藻类以及绿藻类。可以用于本发明的方法中的真核微藻可以包括但不限于曲壳藻属(Achnanthes)、茧形藻属(Amphiprora)、双眉藻属(Amphora)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、星胞藻属(Asteromonas)、Boekelovia、 Borodinella、葡萄藻属(Botryococcus)、Bracteococcus、角毛藻属(Chaetoceros)、 卡德藻属(Carteria)、衣藻属(Chlamydomonas)、绿球藻属(Chlorococcum)、绿梭藻属(Chlorogonium)、小球藻属(Chlorella)、蓝隐藻属(Chroomonas)、金球藻属(Chrysosphaera)、王求 I丐藻属(Cricosphaera)、 甲藻属(Crypthecodinium)、 隐藻属(Cryptomonas)、小环藻属(Cyclotella)、杜氏藻属(Dunaliella)、椭球藻属(Ellipsoidon) > Emiliania> 独 求藻属(Eremosphaera) > Ernodesmius> 1 藻属 (Euglena)、被朿丨J 藻属(Franceia)、脆杆藻属(Fragilaria)、Gloeothamnion、红球藻属 (Haematococcus)、Halocafeteria、膜胞藻属(Hymenomonas)、等鞭金藻属(Isochrysis)、 鳞孔藻属(L印ocinclis)、微茫藻属(Micractinium)、单针藻属(Monoraphidium)、微绿球藻属(Nannochloris)、微拟球藻属(Nannochloropsis)、舟形藻属(Navicula)、 新绿藻属(Neochloris)、肾鞭藻属(Nephrochloris)、肾藻属(Nephroselmis)、菱形藻属(Nitzschia)、棕鞭藻属(Ochromonas)、鞘藻属属(Oedogonium)、卵囊藻属(Oocystis)、Ostreococcus、巴夫藻属(Pavlova) > Parachlorella、Pascheria、揭指藻属 (Phaeodactylum)(Phagus)、扁藻(Platymonas)、颗石藻(Pleurochrysis)、|i]i求
藻属(Pleurococcus)、原壁菌属(Prototheca)、Pseudochlorella、塔胞藻(Pyramimonas) > 桑椹藻属(Pyrobotrys)、栅藻属Gcenedesmus)、骨条藻属(Skeletonema)、水绵属 (Spyrogyra)、裂丝藻属(Stichococcus)、扁藻(Tetraselmis)、海链藻(Thalassiosira)、 Viridiella或团藻属(Volvox)的种类。宿主生物的转化光合微生物可以通过任何适当的方法来转化，作为非限制性实例包括天然DNA 摄入(Chung，et al. (1998)FEMS Microbiol. Lett. 164 :353-361 ；Frigaard, et al. (2004) Methods Mol. Biol. 274 :325-40 ；Zang, et al. (2007) J. Microbiol. 45 :241-245)；配合、转导、玻璃珠转化(Kindle, et al. (1989) J. Cell Biol. 109 :2589-601 ；Feng, et al. (2009) Mol. Biol. Rep. 36 :1433-9 ；U. S.专利号 5，661，017)；碳化硅晶须转化(Dunahay, et al. (1997)Methods Mol. Biol. (1997)62 :503-9)；生物轰击(biolistics) (Dawson, et al. (1997)Curr. Microbiol. 35 :356-62 ；Hallmann, et al. (1997)Proc.Natl. Acad. USA 94 :7469-7474 Jakobiak, et al. (2004)Protist 155 :381-93 ；Tan, et al. (2005) J. Microbiol. 43 :361-365 ；Steinbrenner, et al. (2006)Appl Environ. Microbiol. 72 7477-7484 ；Kroth (2007)Methods Mol. Biol. 390 :257-267 ；U. S.专利号 5，661，017)； 电穿孑L (Kjaerulff, et al. (1994)Photosynth. Res. 41 :277-283 ；Iwai, et al. (2004) Plant Cell Physiol. 45 :171-5 ；Ravindran, et al. (2006) J. Microbiol. Methods 66 174-6 ；Sun, et al. (2006)Gene 377 :140-149 ；Wang, et al. (2007)Appl. Microbiol. Biotechnol. 76 :651-657 ；Chaurasia, et al. (2008)J. Microbiol. Methods 73 :133-141 ； Ludwig,et al. (2008) Appl. Microbiol. Biotechnol. 78 :729-35)；激光介导的转化、或在任一种聚(酰胺基胺)树枝状化合物的存在下或在用其预处理之后用DNA温育(I^supathy， et al. (2008)Biotechnol. J. 3 :1078-82)；聚乙二醇(Ohnuma, et al. (2008)Plant Cell Physiol. 49 :117-120)；阳离子类脂(Muradawa, et al. (2008) J. Biosci. Bioeng. 105 77-80)；葡聚糖、磷酸钙、或氯化钙(Mendez-Alvarez，et al. (1994) J. Bacteriol. 176 7395-7397)；任选地在用细胞壁降解酶对细胞进行处理之后(Perrone，et al. (1998)Mol. Biol. Cell 9 :3351-3365)。农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化也可以在藻类细胞上进行，例如在去除或损伤藻类细胞壁之后(例如，WO 2000/62601 ；Kumar, et al. (2004) Plant Sci. 166 :731-738)。生物轰击方法对于植物和真核藻类物种的叶绿体的转化是特别成功的 (例如参见Ramesh，et al. (2004)Methods Mol. Biol. 274 :355-307 ；Doestch，et al. (2001) Curr. Genet. 39 :49-60 ；U. S 专利号 7，294，506 ；WO 2003/091413 ；WO 2005/005643 ；以及 WO 2007/133558，全都通过引用以其全文结合在此)。在本发明的一些优选实施方案中，将对参与到导致合成支链醇的路径中的酶(如在此披露的酶)进行编码的基因克隆到表达载体中，用于转化成为藻类或光合细菌。该载体包括促进感兴趣的转基因表达的多个序列(如启动子)并且其中该工程化的宿主菌株是真核微藻、可以任选地包括用于将所表达的酶导向所转化的真核细胞的叶绿体的转运肽编码序列、内含子序列、具有多腺苷酸化信号的序列等等。可替代地，如果该载体不包含与感兴趣的基因可操作地连接的启动子，则该基因可以被转化入细胞从而使得它通过同源重组或载体整合变成可操作地连接到内源启动子上。在一些实施方案中，将载体设计为用于将该异源核酸序列整合到宿主基因组之中。例如，载体可以是1)通过包括使能同源重组到染色体中的侧翼序列而被靶向为用于整合到藻类或蓝细菌染色体之中、幻通过包括使能同源重组到内源质粒中的侧翼序列而被靶向为用于整合到内源宿主质粒之中、或者；3)被设计为使得这些表达载体在选定的宿主内复制。在对参与到支链醇的合成中的酶进行编码的多于一个的基因被转化成有机体时， 也可以将人工染色体载体用于光合微生物的转化。在对真核宿主生物的细胞核进行转化的一些情况下，可以有利地在异源基因构建体中包括编码叶绿体转运肽的序列。该转运肽序列可以衍生自该宿主生物的内源基因、或者可以衍生自来自另一物种的基因。在可以有利地转化真核藻类的叶绿体的情况下，可以将载体设计为具有在该转基因(例如，2-酮酸脱羧酶基因)侧翼的序列区域，这些区域与叶绿体序列是同源的以促进感兴趣的序列的同源重组和整合。在这些实施方案中，该载体优选地包括用于表达该转基因的启动子，其中该启动子在叶绿体中起作用。被设计用于在微藻中表达基因的载体在一些情况下可以包括在微藻中是活性的、 可操作地连接到所引入的外源基因上的启动子。在绿色藻类中起作用的多种基因启动子和终止子可以用在表达载体中，包括但不限于来自衣藻属和其他藻类(参见例如Plant Cell Physiol 49 :625-632(2008))的启动子和终止子、来自病毒的启动子和终止子、以及合成的启动子和终止子。表达构建体还可以任选地包括内含子，如来自宿主生物、被插入外源基因中的内含子序列，用于该基因在该宿主中的最优表达。对于硅藻类的转化，可以在这些表达载体中利用多种在硅藻中起作用的基因启动子，包括但不限于1)来自海链藻(Thalassiosira)和其他不等鞭毛藻的启动子、来自病毒的启动子、以及合成启动子。来自假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)的启动子 (将适合用于表达载体中)包括α微管蛋白启动子、β微管蛋白启动子、以及肌动蛋白启动子。来自三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的启动子(将适合用于表达载体中)包括α微管蛋白启动子、β微管蛋白启动子、以及肌动蛋白启动子。与这些基因、其他硅藻基因、或特殊的异源基因相关联的终止子可以用于停止转录并且为多腺苷酸化提供适当的信号。在一些情况下，可以有利地在转基因的宿主的生长过程中在某个点表达异源酶， 以使对该转基因有机体的生长的任何有害影响最小化和/或使支链醇的生产最大化。在这些情况下，被引入该转基因的有机体中的一个或多个外源基因可以可操作地连接到一个诱导型启动子上。该启动子可以是Iac启动子、tet启动子(例如，美国专利号5，851，796)、包含tet或Iac启动子的部分或这两个部分的杂合启动子、激素应答启动子(例如，蜕皮激素应答启动子，例如美国专利号6，379，945)、金属硫蛋白启动子(美国专利号6，410，828)、或可以响应于化学物质(例如像水杨酸、乙烯、硫胺素、或BTH(美国专利号5，689，044)的病程相关(PR)启动子。诱导型启动子还可以响应于光或黑暗(美国专利号5，750，385、美国专利号 5，639，952)或温度(美国专利号 5，447，858 ；Abe，et al. ,Plant Cell Physiol. 49 625-632(2008) ；Shroda, et al.，Plant J. 21 121-131 (2000))、或铜的水平(Surzycki,et al.，Proc Natl Acad Sci U S A. 104 17548-17553 (2007)) 以上清单是示例性的而非限制性的。这些启动子序列可以来自任何有机体，前提是它们在宿主生物中是具有功能的。如在本发明的构建体中使用的诱导型启动子可以使用上述启动子或融合至不同启动子 (该启动子在宿主生物中运作以将可诱导性赋予在宿主生物中运作的启动子)的至少一部分上的其他诱导型启动子的一个或多个部分或一个或多个结构域。可以在这些表达载体中利用多种在蓝细菌中起作用的基因启动子，包括但不限于1)这些通过添加异丙基β -D-I-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)可诱导的lac、tac和trc 启动子，幻本质上与携带转座子或细菌染色体的抗生素抗性基因(新霉素磷酸转移酶、氯霉素乙酰转移酶、大观霉素腺苷酸转移酶等等)相关联的启动子，3)多种异源细菌和天然蓝细菌基因的启动子，4)来自病毒和噬菌体的启动子，以及幻合成的启动子。从蓝细菌中分离的已经成功使用的启动子包括以下各项--SecA(分泌液；受细胞的氧化还原状态控制)-rbc (核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)操纵子)—psaAB-(PSI反应中心蛋白；光调节的)—ρsbA-(PSII的Dl蛋白；光可诱导的)--nirA-(硝酸盐还原酶，NH3/N03调节的)同样，对于表达载体构建体可以使用多种多样的转录终止子。可能的终止子的实例包括但不限于psbA、psaAB、rbc、secA、以及T7外壳蛋白。转化载体优选地还包括选择性标记，例如但不限于耐药基因、耐除草剂基因、代谢酶或宿主生存所要求的因子(例如，营养缺陷型标记)等等。所转化的细胞可以任选地基于在存在抗生素或其他选择性标记存在时、在缺乏耐受性盒或营养缺陷型标记的细胞不能生长的条件下生长的能力进行选择。在一些实施方案中，非选择性标记可以存在于载体上，如对荧光蛋白或产生可检测的反应产物的酶进行编码的基因。在一种可替代的转化策略中，选择性或非选择性标记可以被提供在单独的构建体上，在这里感兴趣的基因构建体和该选择性标记构建体二者均用于转化方案中，并且对选定的转化体分析该包括感兴趣基因的构建体的共同转化(参见例如 Kindle (1990) Proc. Natl. Acad. ki. USA 87 :1228-32 ； Jakobiak, et al. (2004)Protist 155:381-93)。生产支链醇的方法本发明的另一个方面是用于生产支链醇的方法，其中该方法包括对如在此提供的重组光合微生物进行培养以生产支链醇。该光合微生物可以是，例如，这样的光合微生物 它携带了对至少一个催化底物至产物的转化而导致合成异丁醇的多肽进行编码的异源基因、对至少一个催化底物至产物的转化而导致合成2-甲基-1-丁醇的多肽进行编码的异源基因、或对至少一个催化底物至产物的转化而导致合成3-甲基-1-丁醇的多肽进行编码的异源基因。在一些优选实施方案中，用于生产一种或多种支链醇的光合微生物包括对支链的2-酮酸脱羧酶进行编码的异源核酸序列以及对醇脱氢酶进行编码的异源核酸序列。该光合微生物可以混合营养式地进行培养，其中该微生物在光照下生长其生长周期的至少一部分、并且还被供应了还原的碳源，或者可以光能自养地进行培养。在一些实施方案中，该光合微生物是在光能自养的条件下培养的，其中该培养基缺乏被还原的碳源并且有机体在培养中的至少一部分时间内被供应光或将其暴露于光中。该光能自养的培养基在一些实施方案中被供应无机碳，如CO2、碳酸或碳酸盐。也可以提供无机碳源，如烟气或空气。在优选实施方案中，这些用于生产支链醇的方法包括使用无机碳作为唯一的碳源用于掺入生物质或藻类产物中来光能自养地培养光合微生物。在这些实施方案中，用于光能自养式生长的培养基缺乏糖、有机酸、或其他形式的可以用作能源的还原碳，尽管它可以包含一种或多种还原碳分子，其量值不足以对该培养基供应支持细胞分裂和/或生物量累积的能量源(例如，维生素，如维生素bl)。在这些方法中使用的光合微生物(包括编码支链2-酮酸脱羧酶的异源核酸序列和编码醇脱氢酶的异源核酸序列)可以进一步包括编码以下各项中一种或多种的至少一个异源核酸序列乙酰乳酸合酶(EC 2. 2. 1. 6)、酮醇酸还原异构酶(EC 1. 1. 1. 86)或二羟酸脱水酶(EC 4. 2. 1. 9)。该培养基在一些优选实施方案中产生了异丁醇、2-甲基-1-丁醇、 或3-甲基-1-丁醇、或其组合。在一些实施方案中，该光合微生物产生3-甲基-1-丁醇。在一些实施方案中， 该光合微生物产生3-甲基-1- 丁醇并且被工程化以便除了编码支链2-酮酸脱羧酶的异源核酸序列和编码醇脱氢酶的异源核酸序列之外，还包括编码以下酶中的一种或多种的至少一个异源核酸序列2-异丙基苹果酸合酶(EC 2. 3. 3. 13)、3_异丙基苹果酸脱水酶(EC 4. 2. 1. 33)或3-异丙基苹果酸脱氢酶(EC 1. 1. 1. 85)。在一些实施方案中，该光合微生物产生2-甲基-1-丁醇。在一些实施方案中，该光合微生物产生2-甲基-1- 丁醇并且被工程化以便除了编码支链2-酮酸脱羧酶的异源核酸序列和编码醇脱氢酶的异源核酸序列之外，还包括编码以下酶中的一种或多种的至少一个异源核酸序列高丝氨酸脱氢酶(EC 1. 1. 1. 3)、高丝氨酸激酶(EC 2. 7. 1. 39)、苏氨酸合酶(EC 4. 2. 3. 1)、或苏氨酸脱氨酶(EC 4. 3. 1. 19)。在一些实施方案中，该方法包括从该培养基中回收该支链醇，例如使用诸如液液萃取、汽提、蒸汽汽提、或全蒸发的方法(Qureshi，et al.，Biotechnol Prog. 15 594-602 (1999) ；Jitesh, et al. ， Bioseparation 9 :145-154(2000) ；Ezeji, et al. , Bioprocess Biosyst Eng.27 :207-214(2005) ；Qureshi, et al. , Bioprocess Biosyst Eng.27 :215-222(2005) ；Ezeji, et al. , J Ind Microbiol Biotechnol 34 771-777(2007) ；Izak,et al. , Appl Microbiol Biotechnol. 78 :597-602(2008) ；Zeng,et al. ,J Ind Microbiol Biotechnol 36 :1127-1138 Q009))。可以将这些方法中的任何一种与蒸馏结合使用。这些方法在一些实施方案中可以用于从连续培养中提取产物。在另一方面，在本发明的范围内包括通过在此提供的这些方法制成的支链醇。通过重组光合微生物生产的支链醇可以是例如异丁醇、2-甲基-1-丁醇、或3-甲基-1-丁醇。 还包括了包含通过如在此披露的重组体光合有机体所生产的支链醇的组合物。该组合物可以是例如燃料或溶剂。在本发明的另一个实施方案中，这些支链醇可以被化学脱水成对应的α烯烃。例如，可以使用异丁醇来生产2-甲基丙烯(异丁烯)或异辛烷，可以使用2-ΜΒ0来生产2-甲基-1-丁烯，并且可以使用3-ΜΒ0来生产3-甲基-1-丁烯。此类化合物具有本领域中(例如在石油行业中)已知的用途。此类化合物可以进一步用于生产其他化合物，例如，2-甲基-1- 丁烯和3-甲基-1- 丁烯二者均可以用于生产3，3，5-三甲基戊烷。所有这些支链醇还都可以用于生产其对应的醚。来自某些化合物(如2-MB0或3-MB0)的酯可以用作调味剂或香料。提供以下实例来阐释本发明而非进行限制。实例1在蓝细菌聚球藻中牛产异丁醇、2-甲某-1- 丁醇、以及3-甲某-1- TS合成包含有功能性操纵子的DNA片段使得它以给定的顺序包括以下元件l)trc 启动子、对于在细长聚球藻PCC 7942中表达进行了密码子优化的酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因(PDCLGenBank登录号X77316)、细长聚球藻KaiBC基因区间、同样对于在细长聚球藻中表达进行了密码子优化的酿酒酵母醇脱氢酶基因(ADH2，GenBank登录号J01314)、以及 rrnB终止子。这种功能性操纵子的核苷酸序列提供在SEQ IDN0:1(图幻中。密码子优化是通过使用DNA2. 0，Inc提供的“基因设计器(Gene Designer) ” (版本1. 1. 4. 1)软件程序而进行的。通过将该操纵子插在载体PAM2314中的SpeI与^cI限制位点之间来构建质粒 PSGI-BL3 (Mackey, et al.，Methods Mol. Biol. 362 :115-29)，这使能通过整合到细长聚球藻PCC 7942染色体的“NS1”位点之中而进行细长聚球藻的转化。构建了额外的载体以使得能进行不同的2-酮酸脱羧酶基因、乳酸乳球菌KDCa基因(GenBank登录号AYM8760)、与密码子改性的酿酒酵母ADH2基因相结合的表达和测试。 这种KDCa/ADH2功能性操纵子的核苷酸序列提供在SEQ ID N0:2(图4)中。这个操纵子被置于质粒PAM2314中的SpeI与^icI限制位点之间以形成pSGI_BL19。构建了额外的载体以使得能进行不同的醇脱氢酶基因(酿酒酵母ADH6基因，基因 ID号855368，编码以Genbank登录号NP_014051. 1 GI :6323980提供的蛋白)、与密码子优化的酿酒酵母PDCl基因相结合的表达和测试。这种PDC1/ADH6功能性操纵子的核苷酸序列提供在SEQ ID NO :3(图5)中。这个操纵子被置于质粒pAM2314中的SpeI与McI限制位点之间以形成PSGI-BL20。构建了额外的载体以使得能进行乳酸乳球菌KDCa基因与酿酒酵母ADH6基因相结合的表达和测试。这种KDCa/ADH6功能性操纵子的核苷酸序列提供在SEQ IDN0:4(图6) 中。这个操纵子被置于质粒PAM2314中的SpeI与SacI限制位点之间以形成pSGI_BL21。如Golden 和 Sherman 所说明的(J. Bacteriol. 158 :36-42)用质粒 pSGI_BL3、 PSGI-BL19、pSGI-BL20、以及pSGI_BL21来转化细长聚球藻PCC 7942。将重组体和野生型对照菌株二者在20mL的BG-Il培养基中在旋转摇床(150rpm)上于30°C以恒定的光照 (30 μ Einsteins m-2sec_l)预培养至对数中期(0D730nm = 0. 7-0. 9)。通过将以下物质组合成一升的总体积来制备BG-Il培养基10ml的 “ 100XBG-11” ；Iml 的 6mg/ml 柠檬酸铁铵；Iml 的 2% Na2CO3 ；以及 Iml 的 3. 05% K2HPO40 在一升的最终体积中，“100XBG-Il” 的组分是 149. 60g 的 NaN03、7. 49gMgS04 · 7Η20、3· 60g CaCl2 ·2Η20、0· 60g 柠檬酸(或 0. 89g 柠檬酸钠，脱水物)；1. 12ml 0. 25M Na2EDTA^pH 8. 0 ； 以及IOOml的痕量矿物。(痕量矿物的溶液每升包括:2. 86g/L H3BO3,1. 81g/L MnCl2 ·4Η20 ； 0. 222g/L ZnSO4 · 7H20 ；0. 39g/LNa2Mo04 · 2H20 ；0. 079g/L CuSO4 · 5H20 ；以及 0. 0494g/L Co (NO3) 2 · 6H20)。将对数中期的培养物接种在含ImM IPTG的BG-11中以得到40mL具有0. 3-0. 4的初始培养物0D730nm的培养物。在与预培养相同的条件下进行培养。适当时在重组体培养物中包括大观霉素(5 μ g/ml)。每48小时收集4mL培养物并以6，OOOg离心10分钟。将培养物上清液转移到干净的1. 5mL微量离心管中用于气相色谱分析。将2-甲基-1- 丁醇和3-甲基-1- 丁醇通过液液萃取从该培养物上清液中分离出，使用1体积的培养物上清液对2体积的CH2Cl2用于气相色谱-质谱分析。将IuL样品以20 1的分流比注入一个Rtx-6M柱上(Restek，20mX180ymXlym)，使该柱平衡 0. 5min然后使用以下温度梯度进行操作70°C持续lmin、10°C /min至110°C持续0. 5min然后20°C /min至140°C持续0. 5min、140°C下7. 5min的运行时间、以及200°C下^iiin的运行后时间(0. 75mL/min He)。对于异丁醇的分析，使培养物上清液通过0.2μπι PVDF过滤器并接着通过气相色谱使用火焰离子化检测直接进行分析。使一个HP-Irm0wax柱(Agilent， 15mX250 μ mXO. 25 μ m)平衡0. 5min并且然后使用以下温度梯度进行操作35°C持续 2min，25°C /min至180°C持续0. ^iiin，220°C下Snin的运行时间以及^iin的运行后时间 (0. 75ml/minHe)。将IuL样品按40 1的分流比以250°C的注入口温度注入。表1中示出了结果，表明在培养物接种和诱导96小时之后细长聚球藻PCC 7942 培养物中2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1- 丁醇、以及异丁醇的含量。表 1细长聚球藻PCC 7942中的支链醇产量(以μ M计)
\野生型PCC 7942pSGI-BL3 (PDC1/ADHpSGI-BL19 (KDCa/ADHpSGI-BL20 (PDC1/ADHpSGI-BL21 (KDCa/ADH2)2)6)6)2-甲基-1- 丁醇NDNDNDND313-甲- 丁醇NDND6.5ND103异丁醇NDND18ND394注意=ND表示“未检测到” (< 5uM)。通过GC-MS识别出了 2-甲基丁醇和3_甲基丁醇并对其进行了定量。通过GC-FID识别出了异丁醇并且对其进行了定量。实例2在蓝细菌集朐藻中牛产异丁醇、2-甲某-1- 丁醇、以及3-甲某-1- 丁醇。将该包含密码子修饰的酿酒酵母PDCl和ADH2基因(如SEQ ID NO :1中展示的)的功能性操纵子(表达盒)通过限制性内切酶Bgl II和McI来消化并且插入质粒PSGI-YC3 中的限制位点BamHI与McI之间以形成质粒pSGI_BL7，这使得能将该功能性操纵子整合到蓝藻属PCC 6803染色体中的“RS1”重组位点中(Williams, Methods Enzymol. 167 766-778)。质粒pSGI-BL22包含酿酒酵母的、密码子改性的PDCl和天然ADH6基因(如SEQID NO 3中展示的)并且是通过将来自质粒pSGI-BL20的Spel/&icl片段插入Spel/&icl 消化的PSGI-YC3之中而制得的。质粒pSGI-BL23包含乳酸乳球菌KDCa和酿酒酵母的天然 ADH6基因(如SEQ ID NO :4中展示的)并且是通过将来自质粒pSGI_BL21的Spel/SacI片段插入Spel/&icl消化的pSGI-YC3之中而制得的。质粒pSGI_BLM包含乳酸乳球菌KDCa 和密码子改性的、酿酒酵母ADH2基因(如SEQ IDNO 2中展示的)并且是通过将来自质粒 PSGI-BL19的Spel/&icl片段插入Spel/&icl消化的pSGI_YC3之中而制得的。如Zang 等人所说明的(Microbiology 45 :241-245)，用质粒 pSGI_BL7、 PSGI-BL22、以及pSGI-BL23来转化集胞藻PCC 6803细胞。将重组体和野生型对照菌株二者在20mL的BG-Il培养基中在一个旋转摇床(150rpm)上于30°C以恒定的光照 ((30 μ Einsteins m-2sec_l)预培养至对数中期(0D730nm = 0. 7-0. 9)。将对数中期的培养物接种在含ImM IPTG的BG-Il中以得到40mL的具有0. 3-0. 4的初始培养物OD73tlnm的培养物。在与预培养相同的条件下进行培养。适当时在重组体培养物中包括卡那霉素(5μ g/ ml)。每48小时收集4mL培养物并以6，OOOg离心10分钟。如实例1中说明的，将培养物上清液转移到干净的1. 5mL微量离心管中用于气相色谱分析。表2中示出了结果，表明了在培养物接种144小时之后集胞藻PCC 6803培养物中 2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1- 丁醇、和异丁醇的含量。表2集胞藻某种(Synechocystis sp. )PCC 6803中的支链醇产量(以μ M计)
权利要求
1.一种重组光合微生物，包括至少一个异源核酸序列，其中所述异源核酸序列编码至少一种多肽，该多肽催化底物至产物的转化，该转化选自由以下各项组成的组a)丙酮酸酯至2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸酯；b)2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸酯至2，3- 二羟基-3-甲基丁酸酯；c)2，3- 二羟基-3-甲基丁酸酯至3-甲基-2-氧代丁酸酯；d)3-甲基-2-氧代丁酸酯至2-甲基-1-丙醛；以及e)2-甲基-1-丙醛至异丁醇O-甲基-1-丙醇)； 其中所述重组光合微生物产生异丁醇。
2.一种重组光合微生物，包括至少一个异源核酸序列，其中所述异源核酸序列编码至少一种多肽，该多肽催化底物至产物的转化，该转化基于选自由以下各项组成的组的途径a)丙酮酸酯至2-甲基苹果酸酯；b)2-甲基苹果酸酯至2-甲基马来酸酯；c)2-甲基马来酸酯至D-赤-3-甲基苹果酸酯；d)D-赤-3-甲基苹果酸酯至2-氧代丁酸酯；e)苏氨酸至2-氧代丁酸酯；f)丙酮酸酯和2-氧代丁酸酯至2-羟基-2-乙基-3-氧代丁酸酯；g)2-羟基-2-乙基-3-氧代丁酸酯至2，3- 二羟基-3-甲基戊酸酯；h)2，3- 二羟基-3-甲基戊酸酯至3-甲基-2-氧代戊酸酯；i)3-甲基-2-氧代戊酸酯至2-甲基-1- 丁醛；以及 j) 2-甲基-1- 丁醛至2-甲基-1- 丁醇；其中所述重组光合微生物产生2-甲基-1- 丁醇。
3.—种重组光合微生物，包括至少一个异源核酸序列，其中所述异源核酸序列编码至少一种多肽，该多肽催化底物至产物的转化，该转化选自由以下各项组成的组a)丙酮酸酯至2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸酯；b)2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸酯至2，3- 二羟基-3-甲基丁酸酯；c)2，3- 二羟基-3-甲基丁酸酯至3-甲基-2-氧代丁酸酯；d)3-甲基-2-氧代丁酸酯至2-异丙基苹果酸酯；e)2-异丙基苹果酸酯至2-异丙基马来酸酯；f)2-异丙基马来酸酯至3-异丙基苹果酸酯；g)3-异丙基苹果酸酯至4-甲基-2-氧代戊酸酯(2-酮基异己酸酯)；h)4-甲基-2-氧代戊酸酯至3-甲基-1- 丁醛；以及i)3-甲基-1- 丁醛至3-甲基-1- 丁醇；其中所述重组光合微生物产生3-甲基-1- 丁醇。
4.一种重组光合微生物，包括至少一个异源核酸序列，该异源核酸序列编码支链2-酮酸脱羧酶，其中该重组光合微生物产生支链醇。
5.如权利要求4所述的重组光合微生物，其中该支链2-酮酸脱羧酶选自由以下各项组成的组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)PDCl基因产物、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)PDCl基因产物、酿酒酵母PDC5基因产物、酿酒酵母PDC6基因产物、酿酒酵母AR010基因产物、酿酒酵母THI3基因产物、树干毕赤酵母PDC 3-6Kivd基因产物、树干毕赤酵母PDC2基因产物、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis) KDC基因产物、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)KDCa基因产物、以及其任何一种的变体或同源物。
6.如权利要求5所述的重组光合微生物，其中该异源核酸序列编码乳酸乳球菌KDCa基因产物或其变体。
7.如权利要求5所述的重组光合微生物，其中该异源核酸序列编码乳酸乳球菌 KDCa-S286Y、KDCa S286U、或F381W基因产物、或其任何一种的变体。
8.如权利要求5所述的重组光合微生物，其中该异源核酸序列编码树干毕赤酵母 PDC3-6基因产物或其变体。
9.如权利要求4所述的重组光合微生物，其中该异源核酸序列编码醇脱氢酶。
10.如权利要求9所述的重组光合微生物，其中该异源核酸序列编码支链醇脱氢酶。
11.如权利要求9所述的重组光合微生物，其中该醇脱氢酶选自由以下各项组成的组酿酒酵母ADHl基因产物、酿酒酵母ADH2基因产物、酿酒酵母ADH3基因产 物、酿酒酵母 ADH6基因产物、酿酒酵母ADH7基因产物、酿酒酵母GRE2基因产物、酿酒酵母SFAl基因产物、酿酒酵母YPRl基因产物、树干毕赤酵母AdH3基因产物、树干毕赤酵母ADH6基因产物、 树干毕赤酵母ADH7基因产物、GRE2基因产物、结核分枝杆菌ADHl基因产物、结核分枝杆菌 ADH基因产物、结核分枝杆菌ADHb基因产物、大肠杆菌(E. coli) yqhD基因产物、马(Equus caballus) ADHE基因产物、以及其任何一种的变体或同源物。
12.如权利要求11所述的重组光合微生物，其中该异源核酸序列编码酿酒酵母ADH6基因产物。
13.如权利要求5所述的重组光合微生物，其中所述至少一个异源核酸序列进一步编码一种或多种选自下组的基因产物，该组由以下各项组成乙酰乳酸合酶基因产物、酮醇酸还原异构酶基因产物、以及二羟酸脱水酶基因产物，并且进一步地，其中所述重组光合微生物产生异丁醇、2-甲基-1- 丁醇、或3-甲基-1- 丁醇。
14.如权利要求13所述的重组光合微生物，其中所述一种或多种基因产物是乙酰乳酸合酶基因产物。
15.如权利要求5所述的重组光合微生物，其中所述至少一个异源核酸序列进一步编码一种或多种选自下组的基因产物，该组由以下各项组成2-异丙基苹果酸合酶基因产物、3-异丙基苹果酸脱水酶基因产物、以及3-异丙基苹果酸脱氢酶基因产物，并且进一步地，其中所述重组光合微生物产生3-甲基-1-丁醇。
16.如权利要求15所述的重组光合微生物，其中所述一种或多种基因产物是2-异丙基苹果酸合酶基因产物。
17.如权利要求5所述的重组光合微生物，其中所述至少一个异源核酸序列进一步编码一种或多种选自下组的基因产物，该组由以下各项组成高丝氨酸脱氢酶基因产物、高丝氨酸激酶基因产物、苏氨酸合酶基因产物、以及苏氨酸脱氨酶基因产物，并且进一步地，其中所述重组光合微生物产生2-甲基-1- 丁醇。
18.如权利要求17所述的重组光合微生物，其中所述至少一个异源核酸序列进一步编码苏氨酸脱氨酶基因产物。
19.一种用于生产支链醇的方法，所述方法包括(i)提供包括碳源的培养基，(ii)在所述培养基中在光能自养条件下培养如权利要求4所述的重组光合微生物，以及(iii)从所述培养基中回收支链醇。
20.如权利要求19所述的方法，其中该培养基提供无机碳作为实质上唯一的碳源。
21.如权利要求20所述的方法，其中该培养基中的无机碳是C02。
22.如权利要求19所述的方法，其中该支链醇选自由以下各项组成的组异丁醇、2-甲基-1- 丁醇、以及3-甲基-1- 丁醇。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述至少一个异源核酸序列进一步编码一种或多种选自下组的基因产物，该组由以下各项组成乙酰乳酸合酶基因产物、酮醇酸还原异构酶基因产物、以及二羟酸脱水酶基因产物。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述至少一个异源核酸序列进一步编码乙酰乳酸合酶基因产物。
25.如权利要求22所述的方法，其中该支链醇是异丁醇。
26.如权利要求22所述的方法，其中该支链醇是3-甲基-1-丁醇。
27.如权利要求沈所述的方法，其中所述至少一个异源核酸序列进一步编码一种或多种选自下组的基因产物，该组由以下各项组成2-异丙基苹果酸合酶基因产物、3-异丙基苹果酸脱水酶基因产物、以及3-异丙基苹果酸脱氢酶基因产物。
28.如权利要求沈所述的方法，其中所述至少一个异源核酸序列进一步编码2-异丙基苹果酸合酶基因产物。
29.如权利要求22所述的方法，其中该支链醇是2-甲基-1-丁醇。
30.如权利要求四所述的方法，其中所述至少一个异源核酸序列进一步编码一种或多种选自下组的基因产物，该组由以下各项组成高丝氨酸脱氢酶基因产物、高丝氨酸激酶基因产物、苏氨酸合酶基因产物、以及苏氨酸脱氨酶基因产物。
31.如权利要求四所述的方法，其中所述至少一个异源核酸序列进一步编码苏氨酸脱氨酶基因产物。
32.如权利要求19所述的方法，其中回收该支链醇包括气体汽提、蒸汽汽提、或全蒸发。
33.通过权利要求19所述的方法制成的一种支链醇。
全文摘要
本发明提供了基因、多肽及其表达构建体、重组光合微生物，以及其使用方法，例如用于为多种用途而生产支链醇类(包括2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、以及异丁醇)及其衍生物。
文档编号C12P7/16GK102245780SQ200980149831
公开日2011年11月16日 申请日期2009年12月10日 优先权日2008年12月10日
发明者J·R·克里斯托福, P·G·罗斯勒, 刘博 申请人:合成基因组股份有限公司