专利名称：野山参与栽培参多重pcr检测试剂盒及鉴定方法
技术领域：
本发明涉及中药检测技术领域，更具体地说，是一种野山参与栽培参DNA检测试剂盒及鉴定方法。
背景技术：
人参(panax ginseng C. A. Meyer)具有滋补强壮、补气养血等多种功效，被誉为“ 百药之王"，在我国已有2000多年的应用史和栽培史。一股被分为三种类型野山参、移山参和栽培参。野山参是驰名中外的名贵药材，疗效卓著，价格昂贵，主要分布在我国东北地区，朝鲜和俄罗斯。目前，我国野生人参的主要资源进一步萎缩，已被列为国家珍稀濒危植物。由于森林面积的大幅度缩小和过分采挖，野山参的价格不断上涨，而且用移山参、栽培参冒充野山参，造成了市场混乱，损伤了消费者的利益。因此，鉴别野山参的真伪就显得十分重要。传统观点和现代研究都认为野山参在疗效上远优于栽培参，两者在形态性状、生理特性和化学成分上存在差别。我国人参栽培地域广阔，生态条件千差万别，加上长期的人工选择，形成了种类繁多的农家类型。由于植物学、生药学的发展，鉴定药材的方法拓展到了从基源，显微，理化鉴别的层面、角度，从而建立了比较客观的品质评价体系。但是，这些检测技术方法很难从根本上代表人参药材变异的遗传标记(genetic marker)。然而由于人参具有生活周期长、常异花授粉等特性，其群体为混杂体，个体为杂合体，且由于人参本身的生物学特征所限制。这种状况严重制约了人参质量研究的进一步发展，故迄今为止还没有获得能够稳定、有效地区分野山参与栽培参的特异性DNA分子标记。本发明人遵循线粒体DNA(mtDNA)作为遗传信息的载体，是研究动植物起源进化及对群体进行遗传分析的理想对象，子代的mtDNA基本上都是来自卵细胞，所以mtDNA是母性遗传(maternal inheritance)，且不发生DNA重组，因此，具有相同mtDNA序列的个体必定是来自一位共同的雌性祖先。线粒体基因组作为细胞核外的遗传系统，具有完整性、多态性、自主性和小型性等特点，其进化速率是核基因的5-10倍，常用于系统发生学和群体遗传学的研究。线粒体细胞色素b (cytochrome，cyt b)基因进化速度适中，是分析种内、种间遗传多样性和进化关系的适当的DNA片段，可应用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究。选择线粒体细胞色素b基因合适分子遗传学标记技术为野山参与栽培参的鉴别提供了一条新的途径。多重PCR在一个反应体系中加入多对特异性引物，针对多个模板扩增多个目的片段的PCR技术。对珍稀植物野山参鉴定具有节约样本等优势，具有节省时间、降低成本和提高效率的特点。
发明内容
本发明的目的是在建立野山参与栽培参线粒体DNA的基因组文库基础上，采用生物信息学技术对野山参与栽培参线粒体DNA基因组进行筛选，设计可有效地区分野山参与
3栽培参的特异性DNA序列，利用多重PCR技术在一个反应体系中加入二对特异性引物，针对二个模板可扩增二个具有差异的目的片段。提供一种能够准确鉴别野山参与栽培参特异性分子标志，使用方便的野山参与栽培参多重PCR检测试剂盒，具有节省时间、降低成本和提高效率的特点，并提供其简便、快速、检测结果可靠的鉴定方法。本发明的目的是由以下技术方案来实现的一种野山参与栽培参多重PCR检测试剂盒，其特征是，它包含(a)鉴定反应体系总体系为100 μ L，其中含有缓冲液10 μ L，12. 5mMdNTP 4-10 μ L，0. ImM引物1禾口弓丨物2中的一种1.5-4. 0 μ L，Taq DNA聚合酶2-10 μ L，待检样本 DNA 2-5 μ L，余为双蒸馏水；(b)阳性对照反应体系总体系为IOOyL,其中含有缓冲液10μ ，12.5πιΜ dNTP4-10y L,0. ImM引物1禾口弓丨物2中的一禾中1.5-4. 0 μ L，Taq DNA聚合酶2-10 μ L，野山参与栽培参DNA按1 1混合物2-5 μ L，余为双蒸馏水；(C)阴性对照反应体系总体系均为IOOyL,含有缓冲液10yL，12. 5mM dNTP
4-10μ L，0. ImM引物1和引物2中的一种1. 5-4. OyL, Taq DNA聚合酶2-10 μ L，五加科同属植物DNA 1 1混合物2-5 μ L，余为双蒸馏水。野山参与栽培参多重PCR鉴定方法，其特征是，它包含下述步骤(1)设计野山参与栽培参线粒体DNA 二对特异寡核苷酸引物，如下引物1和引物2 中的一种引物15' TACACATGTAACTGTAACTCTAC 3'5’ GCAGATCATCTACAGCTAACGA 3’引物25’ CGACCCAGACTCGTGAGAGTC 3’5， ATCGTCATATTAGATAGCTCAT 3’(2)人工合成线粒体DNA对特异寡核苷酸引物，采用ΑΒΙ3900高通量合成仪，固相亚磷酰胺三酯法合成；(3)确定反应程序分别将野山参与栽培参PCR检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各IOOyL加入反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行94°C预变性 5-7min，94°C 30s，退火 57°C 30s,72°C lmin_30s，30 个循环，72°C延伸
5-8min,4°C；(4)结果判定反应产物使用1. 5-1. 8%琼脂糖凝胶，在DYY-III型水平电泳仪上电泳，60_70mV 电泳45min-lh，分子量100_1500bp的DNA Marker作参照，凝胶成像分析系统观察和分析得
出结果ο本发明的野山参与栽培参鉴定试剂盒是利用野山参与栽培参线粒体DNA与细胞色素b具有的种属特异性，能够准确同时区别野山参与栽培参的特异性；鉴定方法具有简便、快速、检测结果可靠等优点。
图1为试剂盒检测野山参结果示意图。图2为试剂盒检测栽培参结果示意图。其中1为阴性结果，2为标准分子量，3为阳性对照、为260bp和120bp，4为野山参结果；5为栽培参结果，6为标准分子量，7为阳性对照、为^Obp和120bp，8为阴性结果。
具体实施例方式下面利用实施例对本发明作进一步描述。一种野山参与栽培参多重PCR检测试剂盒，它包含(a)鉴定反应体系总体系为100 μ L，含有缓冲液10 μ L, 12. 5mM dNTP4_10 μ L， 0. ImM引物1和引物2中的一种1. 5-4. OyL, Taq DNA聚合酶2-10 μ L，待检样本DNA 2-5 μ L，余为双蒸馏水补至100 μ L ；(b)阳性对照反应体系总体系为100 μ L，含有缓冲液10 μ L，12. 5mMdNTP 4-10 μ L，0. ImM引物1和引物2中的一种1. 5-4. 0 μ L, Taq DNA聚合酶Q-IO μ L，野山参与栽培参DNA (1 1)混合物2-5 μ L，余为双蒸馏水补至100 μ L ；(C)阴性对照反应体系总体系为100 μ L，含有缓冲液10 μ L，12. 5mMdNTP
4-10μ L，0. ImM引物1和引物2中的一种1.5-4. 0 μ L，Taq DNA聚合酶2-10 μ L，五加科同属植物DNA按1 1混合构成的混合物2-5 μ L，余为双蒸馏水补至100 μ L。鉴定反应体系、阳性对照反应体系和阴性对照反应体系所用的缓冲液为现有试剂500mM KCl，IOOmM Tris-HCl、PH8. 4，15mM MgCl2 市场有售；12. 5mMdNTP 为 12. 5mM 脱氧核苷三磷酸，市场有售；Taq DNA聚合酶，市场有售。野山参与栽培参多重PCR鉴定方法，它包含下述步骤(1)设计野山参与栽培参线粒体DNA 二对特异寡核苷酸引物，要求只含有野山参与栽培参DNA序列，不含同属DNA序列，如下引物1和引物2中的一种5' TACACATGTAACTGTAACTCTAC 3'5’ GCAGATCATCTACAGCTAACGA 3’引物25’ CGACCCAGACTCGTGAGAGTC 3’5， ATCGTCATATTAGATAGCTCAT 3’(2)人工合成线粒体DNA 二对特异寡核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成仪，固相亚磷酰胺三酯合成。固相亚磷酰胺三酯由上海生物工程公司合成，为市场有售。(3)确定反应程序分别将野山参与栽培参多重PCR检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各IOOyL加入500yL反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行94°C预变性 3-7min，94°C 30s，退火 57°C 30s，72°C lmin_30s，30 个循环，72°C延伸
5-8min,4°C；(4)结果判定
反应产物使用1. 5-1. 8%琼脂糖凝胶，在DYY-III型水平电泳仪上电泳，60_70mV 电泳45min-lh，分子量100_1500bp的DNA Marker作参照，凝胶成像分析系统观察和分析得
出结果ο1. 5-1. 8%琼脂糖凝胶为市场有售；DYY-III型水平电泳仪为北京市六一仪器厂制造；分子量100-1500bp的DNA Marker为标准分子量，市场有售；凝胶成像分析系统为市
场有售。参照图1，为试剂盒检测野山参结果示意图，只有野山参出现阳性结果。参照图2，为试剂盒检测栽培参结果示意图，只有栽培参出现阳性结果。
权利要求
1.一种野山参与栽培参多重PCR检测试剂盒，其特征是，它包含(a)鉴定反应体系总体系为100μ L，其中含有缓冲液10 μ L，12. 5mMdNTP 4-10 μ L, 0. ImM引物1和引物2的一种1. 5-4. 0 μ L，Taq DNA聚合酶2-10 μ L，待检样本DNA 2-5 μ L， 余为双蒸馏水；(b)阳性对照反应体系总体系为100μ L，其中含有缓冲液10 μ L，12. 5mM dNTP4-10y L,0. ImM 引物 1 和引物 2 的一种 1. 5-4. OyL, Taq DNA 聚合酶 2-10 μ L，野山参与栽培参DNA按1 1混合物2-5 μ L，余为双蒸馏水；(c)阴性对照反应体系总体系均为100μ L，含有缓冲液10 μ L，12. 5mMdNTP 4-10 μ L， 0. ImM引物1和引物2的一种1. 5-4. OyL, Taq DNA聚合酶2-10 μ L，五加科同属植物DNA 1 1混合物2-5 μ L，余为双蒸馏水。
2.一种野山参与栽培参DNA鉴定方法，其特征是，它包含下述步骤(1)设计野山参与栽培参线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物，如下引物1和引物2中的一种引物1.5， TACACATGTAACTGTAACTCTAC 3，.5' GCAGATCATCTACAGCTAACGA 3'引物2.5' CGACCCAGACTCGTGAGAGTC 3'.5， ATCGTCATATTAGATAGCTCAT 3，(2)人工合成野山参与栽培参线粒体DNA对特异寡核苷酸弓丨物，采用ABI3900高通量合成仪，固相亚磷酰胺三酯合成；(3)确定反应程序分别将野山参与栽培参DNA检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各IOOyL加入反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行94°C预变性 3-7min，94°C 30s，退火 57°C 30s, 72°C lmin_30s，30 个循环，72°C延伸 5-8min,4°C ；(4)结果判定反应产物使用1. 5-1. 8%琼脂糖凝胶，在DYY-III型水平电泳仪上电泳，60-70mV电泳 45min-lh,分子量100_1500bp的DNA Marker作参照，凝胶成像分析系统观察和分析得出结
全文摘要
一种中药检测领域的野山参与栽培参多重PCR检测试剂盒，其特点是，含有缓冲液，12.5mM dNTP，0.1mM引物1和引物2的一种，Taq DNA聚合酶，待检样本DNA，双蒸馏水的鉴定反应体系；含有缓冲液，12.5mM dNTP，0.1mM引物1和引物2的一种，Taq DNA聚合酶，野山参与栽培参DNA 1∶1混合物，双蒸馏水的阳性对照反应体系；含有缓冲液，12.5mM dNTP，0.1mM引物1和引物2的一种，Taq DNA聚合酶，五加科同属DNA 1∶1混合物，双蒸馏水的阴性对照反应体系；其检测鉴定方法是设计野山参与栽培参线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物、人工合成野山参与栽培参线粒体DNA对特异寡核苷酸引物、确定反应程序和结果判定等步骤。能够准确同时区别野山参与栽培参的特异性，检测结果可靠。
文档编号C12Q1/68GK102191308SQ20101011882
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月1日 优先权日2010年3月1日
发明者夏薇, 张丽华, 李明成, 王冰梅 申请人:北华大学