专利名称：一种适合三种宿主系统的表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组蛋白表达技术，具体地涉及一种表达载体，尤其涉及一种可用于大肠杆菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞三种宿主系统的表达载体。
背景技术：
随着生物医药领域研究和产业的迅猛发展，对于重组蛋白的需求越来越多。不同的重组蛋白在不同的表达宿主中的表达量，纯化难度以及活性有很大的差别。为了得到高表达，高活性的重组蛋白，常常需要在不同的表达系统进行尝试。由于不同的表达系统使用的不同表达元件(如启动子等)，进行尝试时通常需要克隆到宿主特定的表达载体中，工作量和成本都比较高，耗时长。因此，一种适合于多个表达系统的载体，对于重组蛋白的生产具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种适合三种宿主系统的表达载体，其可用于大肠杆菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞表达重组蛋白，其使得表达系统特异的表达载体不再必需，大大降低表达载体构建的成本，缩短获得重组蛋白的时间。本发明采用如下技术方案本发明提供的一种适合三种宿主系统的表达载体，含有大肠杆菌，昆虫细胞和哺乳动物细胞表达元件，将重组蛋白编码序列克隆至此载体，能在上述三种宿主系统中表达重组蛋白；该表达载体还含有bacmid穿梭质粒转座特异元件。所述哺乳动物细胞表达元件含有一个启动子，可以是各种常用的启动子，如SV40 启动子，小鼠甘油磷酸激酶启动子，beta-actin启动子，人泛肽启动子，人EF-I启动子，人巨细胞病毒早期启动子，优选使用的启动子是经改进的人巨细胞病毒早期启动子，其序列如SEQ ID NO. 1所示。为了增强在哺乳动物细胞中的表达，一个内含子序列被插入上述启动子的下游。优选使用的内含子如SEQID NO. 2所示。在哺乳动物细胞启动子的下游，含有一个大肠杆菌系统所用的启动子，可以是各种常用的启动子如he，T7，Trp等，优选使用的启动子是T71ac，如SEQID NO. 3所示。在哺乳动物细胞启动子的下游，还含有一个昆虫细胞杆状病毒表达系统所用的启动子，这个启动子可以是Polyhedrin promoter,plO gp64，p6. 9等常用的启动子，优选使用的启动子是Polyhedrin promoter，如SEQ ID N0. 4所示，这个启动子可以位于大肠杆菌启动子的上游或者下游，优选地，位于大肠杆菌启动子的下游，如SEQ ID N0. 5所示。大肠杆菌启动子和昆虫细胞杆状病毒表达启动子可位于内含子上游，或者下游， 或者包含于内含子之内，优选地位于内含子中，如SEQ ID N0. 2所示。本发明提供的表达载体还可以含有一个病毒复制起点，这一复制起点可以在带有反式复制因子的哺乳动物细胞中复制，使得质粒在细胞中的存续时间延长，细胞培养后2 个月仍能检测到质粒的存在和重组蛋白的表达。可用复制系统有SV40，EBV, BKV复制起点和反式元件，优先选用EBV OriP复制起点(SEQ IDN0. 6)和含有EBNA-I蛋白的哺乳动物细胞。本发明提供的表达载体含有与bacmid穿梭质粒转座特异的位点，优选地使用 Tn7R(SEQ ID NO. 7)和和 Tn7L(SEQ ID NO. 8)。本发明提供的表达载体在大肠杆菌中进行表达时，采用质粒直接转化的方法，使用IPTG或半乳糖进行诱导表达。优选的使用BL21菌株。本发明提供的表达载体在昆虫细胞中进行表达时，首先要将其与bacmid穿梭质粒进行转座，将表达框架转座到bacmid上，获得的kicmid转染昆虫细胞获得杆状病毒，病毒感染昆虫细胞表达重组蛋白，优选的使用昆虫细胞sf9。本发明提供的表达载体在哺乳动物细胞中进行表达时，可使用上述昆虫杆状病毒感染哺乳动物细胞，该病毒感染后不能产生新的病毒。但由于EBV OriP复制起点(OriP) 的存在，病毒DNA可以以附加体的形式进行复制。表达质粒也可以以瞬时转染的形式表达重组蛋白，由于OriP的存在，质粒也可以以附加体的形式进行复制。优选的使用细胞 293-EBNAo本发明优选的表达载体为载体PNP3P，其序列如SEQ ID NO. 10所示。本发明的有益效果在于，提供一种适合大肠杆菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞三种宿主系统表达载体，其可用于大肠杆菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞表达重组蛋白，该表达载体质粒可应用于重组蛋白表达，快速筛选合适的表达宿主，以及随后的重组蛋白的大量表达与制备。本发明使得表达系统特异的表达载体不再必需，大大降低表达载体构建的工作量和成本，缩短获得重组蛋白的时间。
图1是本发明实施例中使用的表达载体示意图；图2是本发明实施例中人神经生长因子(hbeta-NGF)在大肠杆菌BL21中的表达情况示意图，其中，1表示诱导前，2表示诱导后，MW表示分子量标准；图3是本发明实施例中hbeta-NGF在昆虫细胞sf9中的表达情况示意图，其中，1 表示空白，2表示hbeta-NGF ；图4是本发明实施例中Iibeta-NGF在哺乳动物细胞293-EBNA中的表达情况示意图，其中，1表示空白质粒，2表示tibeta-NGF，MW表示分子量标准。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例人神经生长因子(hbeta-NGF)在三种表达体系中的表达人神经生长因子编码序列加上kozak sequence (SEQ ID NO. 11)和大肠杆菌RBS 序列(SEQ ID NO. 12)形成SEQ ID NO. 9所示序列，通过BamHI，HindIII克隆到本发明优选载体pNP3P(SEQ ID NO. 10)上，在大肠杆菌BL21 (购自Novagen公司)，昆虫细胞sf9 (购自ATCC公司)，哺乳动物细胞293-EBNA (购自ATCC公司)中表达，SDS-PAGE加考马斯亮蓝染
色显示在三种系统中均有明显表达(见图2-图4)。载体pNP3P的示意图见图1。
如图2所示，该实施例中人神经生长因子(hbeta-NGF)在大肠杆菌BL21中有明显表达；
如图3所示，该实施例中Iibeta-NGF在昆虫细胞sf9中有明显表达；
如图4所示，该实施例中Iibeta-NGF在哺乳动物细胞293-EBNA中有明显表达O
序列表
权利要求
1.一种适合三种宿主系统的表达载体，其特征在于，含有大肠杆菌，昆虫细胞和哺乳动物细胞表达元件，将重组蛋白编码序列克隆至此载体，能在上述三种宿主系统中表达重组蛋白；该表达载体还含有bacmid穿梭质粒转座特异元件。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述哺乳动物细胞表达元件含有启动子，该启动子是经改进的人巨细胞病毒早期启动子，其序列如SEQ IDN0. 1所示。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述哺乳动物细胞表达元件含有一个内含子，其序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌启动子是T71ac，其序列如 SEQ ID NO. 3 所示。
5.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述昆虫细胞启动子是polyhedrin promoter，其序列如 SEQ ID NO. 4 所示。
6.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述昆虫细胞启动子位于大肠杆菌启动子下游，该昆虫细胞启动子的序列如SEQ ID NO. 5所示。
7.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌启动子和昆虫细胞杆状病毒表达启动子位于所述内含子内部。
8.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述bacmid转座特异元件为Tn7L， Tn7R, Tn7R的序列如SEQ ID NO. 7所示，Tn7L的序列如SEQ ID NO. 8所示。
9.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，该表达载体还含有病毒复制起点。
10.如权利要求9所述的表达载体，其特征在于，所述病毒复制起点为EBVOriP，其序列如SEQ ID N0. 6所示，所述哺乳动物细胞含有EBNA-I蛋白。
11.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体在大肠杆菌中进行表达时，采用质粒直接转化的方法，使用IPTG或半乳糖进行诱导表达，该大肠杆菌采用BL21菌株。
12.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体在昆虫细胞中进行表达时，首先要将其与bacmid穿梭质粒进行转座，将表达框架转座到bacmid上，获得的l^acmid 转染昆虫细胞获得杆状病毒，病毒感染昆虫细胞表达重组蛋白，该昆虫细胞采用昆虫细胞 sf9。
13.如权利要求12所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体在哺乳动物细胞中进行表达时，可使用所述昆虫杆状病毒感染哺乳动物细胞，该病毒感染后不能产生新的病毒， 但由于EBV OriP复制起点的存在，病毒DNA可以以附加体的形式进行复制，表达质粒也可以以瞬时转染的形式表达重组蛋白，由于EBV OriP复制起点的存在，质粒也可以以附加体的形式进行复制；该哺乳动物细胞采用细胞^3-EBNA。
14.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为载体PNP3P，其序列如 SEQ ID NO. 10 所示。
全文摘要
本发明公开一种可以在三种宿主系统中表达蛋白的载体质粒，包括大肠杆菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞。该表达载体(质粒)包含三种启动子适合于不同载体系统的转录启动，并包含转座元件以便于将表达框架定点转移到Bacmid穿梭质粒上。该质粒可应用于重组蛋白表达，快速筛选合适的表达宿主，以及随后的重组蛋白的大量表达与制备。
文档编号C12N15/85GK102260710SQ20101018713
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月31日 优先权日2010年5月31日
发明者丁旭, 刘程 申请人:上海欣百诺生物科技有限公司