专利名称：奶山羊多胎和单胎卵巢差异表达新基因及筛选、鉴定和功能分析的制作方法
技术领域：
本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种奶山羊多胎(3羔)和单胎卵巢差异表 达新基因及其筛选、鉴定和功能分析方法，发现6个与卵泡生长发育密切相关的6个新基因 片段，其在山羊上未见报道，另外，2个新基因片段与NCBI中的所有序列都不匹配。
背景技术：
众所周知，“一杯奶强壮一个民族”，然而，由于亚洲人与西方人种的遗传差异，导 致70 %的中国人饮食牛奶发生乳糖不耐症(何伟，2006)，但饮食山羊奶不会发生乳糖不耐 症，因此，山羊奶在国内已经形成消费热，而奶山羊产羔率低，已成为制约奶羊业发展的瓶 颈问题。多胎性状是山羊重要的经济性状，提高山羊的产羔率，不仅可以降低母羊的饲养 成本，提高山羊生产的经济效益，并且可以减少粪便等废弃物的排泄量，对于我国走绿色环 保的可持续发展畜牧业道路具有非常重要的意义。发现和高效利用多胎家畜种质资源，是 动物遗传育种领域的重点研究课题之一。奶山羊是适合我国国情条件下大力发展的重要奶 畜，探索增加产羔数的有效方法是大幅度提高其经济效益、减少环境污染和节约资源的关 键。多羔性状是由微效多基因控制的数量性状，遗传力很低(约0. 23)，采用传统选育 方法，难以在较短时间内快速提高产羔率。因而，筛选和鉴定控制奶山羊多羔性状新基因， 应用分子育种等新技术，快速提高其产羔率，尽快培育出具有我国自主知识产权的奶山羊 新品种(系)，对大幅度提高我国奶山羊生产水平和促进奶山羊业的发展具有重要意义。抑制性消减杂交(SSH)是Diatchenko (1996)以基于PCR技术为基础，在差减cDNA 和RNA的基础上发展而了的筛选差异表达基因的技术。该方法用限制性酶消化测试组与驱 动组的cDNA，然后用两轮杂交和巢式PCR扩增即可完成试验。和以前的差减杂交技术相比， SSH技术的优点主要表现在五个方面。第一，特异性高，克服了不同mRNA分子拷贝数目对 杂交结果的影响，因而消减的灵敏度大大提高。第二，操作简单，不需要需采用任何中间步 骤分离单链或者双链cDNA，仅需要一轮差减杂交，差异表达的cDNA分子达到1000多倍的 富集。第三，SSH技术的最大优点假阳性率低，其两步杂交和两次PCR可保证其94%为真阳 性。第四，高灵敏性，低丰度mRNA可通过抑制性消减杂交术所做的均一化和目标片段的富 集被检测出来。第五，快速高效，几十甚至几百个差异表达基因片段可通过一次SSH同时分 离得到。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种奶山羊多胎和单胎卵巢差异表达新基因及筛选、鉴 定和功能分析方法，申请人以西农萨能奶山羊多胎(3羔)和单胎卵巢为试验材料，利用抑制 性消减杂交技术、生物信息学和实时定量PCR筛选出6个与卵泡生长发育密切相关的6个
5新基因片段，其在山羊上未见报道，另外，2个新基因片段与NCBI中的所有序列都不匹配。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案
一种奶山羊多胎和单胎卵巢差异表达新基因，是在H-L消减cDNA文库中的4个ESTs 序列和L-H消减cDNA文库中的4个ESTs序列，其中，H-L消减cDNA文库中的4个ESTs分 别核组蛋白1 (NUCB1)、鸟氨酸脱羧酶(0AZ1)、金属蛋白酶抑制剂(TIMPl)和锌指蛋白5 (CXXC5) ;L-H消减cDNA文库中的4个ESTs分别为钙蛋白酶II (calpain II)、跨膜蛋白 emp24 (TMED4)和与NCBI数据库中的所有序列都不匹配的2个基因片段；其特征在于
所述的H-L消减cDNA文库中的核组蛋白1 (NUCB1)、鸟氨酸脱羧酶(0AZ1)、金属蛋白 酶抑制剂(TIMPl)和锌指蛋白5 (CXXC5)在山羊上未见报道，但其与牛和绵羊对应基因的 同源性在90%以上，这些基因中有的与卵泡的生长发育相关；
所述的L-H消减cDNA文库中的钙蛋白酶II (calpain II)和跨膜蛋白emp24 (TMED4) 与牛和绵羊对应基因的同源性在95%以上，分别参与卵子的激活和能量代谢。上述奶山羊多胎和单胎卵巢差异表达新基因的筛选、鉴定和功能分析方法，其特 征在于，用西农萨能奶山羊经产羊多胎和单胎卵巢作为试验材料，采用抑制性消减杂交技 术构建奶山羊多胎与单胎卵巢组织正反向消减cDNA文库，以多胎奶山羊卵巢为高产测试 组，以单胎卵巢为低产驱动组，表示为H-L ；以单胎奶山羊卵巢为低产测试组，以多胎卵巢 为高产驱动组，表示为L-H，利用生物信息学分析H-L和L-H消减文库中基因的基因结构和 潜在的功能，并挑选文库中的基因，根据其序列设计PCR引物，并利用实时定量PCR验证差 异表达新基因。挑选文库中的基因分别为金属蛋白酶抑制剂(TIMP1)、锌指蛋白5 (CXXC5)、鸟氨 酸脱羧酶(0AZ1)，根据挑选出的消减文库中的金属蛋白酶抑制剂(TIMPl)基因序列设计引 物对P1，根据锌指蛋白5 (CXXC5)基因序列设计引物对P2，根据鸟氨酸脱羧酶(OAZl)基因 序列设计引物对P3;
所述的引物对Pl为
上游引物 Fl 5-CTCTTGAGGTGACGCATCTG-3 ； 下游引物 Rl 5-CCAGAAGGAGCAGGATTACC-3 ； 所述的引物对P2为
上游引物 F2 5-GGGTGCATCCGTTTGTCTTC-3 ； 下游引物 R2 5-AACCCAAAGCTGCCCTCTCT-3 ； 所述的引物对P3为 上游引物 F3 5-GCGGAGGTTTTGCTGGTTT-3 ； 下游引物 R3 :5-GAAGCAGTGGCTGTTGAGGAT-3。所述的实时定量PCR程序为:95°C预变性3 min ;94°C变性10s，60. 0°C退火30s， 72°C延伸30s，共30个循环。本发明取得如下结果
1、以多胎奶山羊卵巢为tester (高产)，以单胎卵巢为driver (低产)，表示为H-L ；以 单胎奶山羊卵巢为tester (低产)，以多胎卵巢为driver (高产)，表示为L-H。以看家基因 磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参检测2个文库的消减效率为25倍，多胎和单胎奶山羊卵 巢组织中的差异表达基因得到有效的富集。
2、在H-L消减cDNA文库中有4个ESTs (表达系列标签)序列，所有的基因片段在 山羊上未报道，但其与牛和绵羊对应基因的同源性在90%以上；通过序列比对发现这些基 因中有的与卵泡的生长发育相关。L-H消减cDNA文库中有4个ESTs序列，2个基因片段在 山羊上未报道，但其与牛和绵羊对应基因的同源性在95%以上，通过序列比对分析发现这 些基因分别参与卵子的激活和能量代谢，另外，2个基因片段与NCBI数据库中的所有序列 都不匹配。3、以持家基因β-actin作为内参，对TIMP-1、CXXC5和OAZl基因进行实时定量 PCR分析，结果显示奶山羊经产羊多胎(3羔)卵巢组织中TIMP-1、CXXC5和OAZl基因的 mRNA表达丰度比西农萨能奶山羊经产羊单胎卵巢组织的高3. 32,38. 34和1. 41倍。
图1是多胎和单胎山羊卵巢组织中RNA的质量检测结果电泳图，图中，1和2表示 多胎山羊卵巢；3和4表示单胎山羊卵巢；M表示DNA marker DL2000 ；
图2是两个消减cDNA文库部分克隆菌落PCR鉴定电泳图，图(A)表示H-L消减cDNA文 库；图(B)表示L-H消减cDNA文库；
图3是GAPDH cDNA消减效率电泳图，图(A)表示以多胎山羊卵巢组织为Tester，单胎 山羊卵巢组织为Driver ；图(B)表示以单胎山羊卵巢组织为Tester，多胎山羊卵巢组织为 Driver ； 1-4表示未消减cDNA产物；5-8表示消减cDNA产物；M表示DNA marker DL2000 ； 其中，4，5条带表示经过18个循环；3，6条带表示经过23个循环；2，7条带表示经过28个 循环；1，8条带表示经过33个循环；
图4是引物特异性的检测电泳图；图中，1表示TIMP-I基因；2表示CXXC5基因；3表 示 OAZl 基因；M 表示 DNA marker I ； 图5是实时定量PCR扩增曲线； 图6是实时定量PCR溶解曲线。以下通过对山羊卵巢组织中RNA提取和检测、mRNA纯化、浓缩和检测、消减文库效 率的分析、菌落PCR和实时定量PCR分析实施例来进一步说明本发明及其带来的技术效果。
具体实施例方式A、卵巢组织总RNA的提取
(1)将卵巢组织样品从液氮罐中取出，置于液氮预冷的研钵中，加入少量液氮迅速研磨 (研磨过程中应保持研钵中一直有液氮存在)，直至组织被研成细小粉末状时，将其转入经 0. 1%的DEPC水处理过并且经高压蒸汽灭菌的1.5mL的离心管中(研钵洗净烤干后用无水乙 醇灼烧5-lOmin，冷却后使用)。(2)立即加入Trizol A+ (按30 50 mg组织样品/mL的Trizol加入)，进行颠倒混 合后，室温放置5min，使组织样品充分裂解。另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%， 否则会导致DNA污染。(3)按0. 2 mL氯仿/mL Trizol加入氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3 min。(4)41条件下，12，00(^离心10 15min。样品会分三层黄色的有机相、中间层 和上层无色的水相，RNA主要在上层无色的水相中，把水相(约500 μ L)转入到新管中，在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混勻，室温放置20 min 30min。(5) 4°C条件下，12, OOOg离心lOmin，弃上清，离心前RNA沉淀经常是看不见的，离 心后在管侧和管底形成胶状沉淀。(6) ImL 75%乙醇/mL Trizol的比例加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。(7) 4°C条件下，5, OOOg 离心 3min，弃上清。(8)室温晾干或真空干燥5 lOmin。注RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。(9)用30 50 μ L经DEPC处理过的去离子水溶解RNA样品。(10)取7 μ L的RNA样品用于测OD值和1%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量(图1)， 其余样品置于-80°C冰箱中保存备用。B、卵巢组织mRNA的纯化和浓缩
反应机制如下mRNA的polyA尾巴可与生物素标记的Oligo (dT)探针杂交，杂交产物 可被链霉亲和素包裹的磁珠捕获(链霉亲和素能与生物素特异的结合)然后用磁架捕获磁 珠，再用无RNA酶的灭菌水洗脱。操作步骤如下
(1)将多胎和单胎山羊卵巢组织总RNA置于1.5 mL离心管中，加无RNA酶的灭菌水至 500μ L，65°C水浴 10 min。(2)加入3μ L生物素标记的Oligo (dT)探针和13 μ L的20XSSC后，温和混勻，
冷却至室温。(3)在水浴期间，准备 0. 5XSSC 禾口 0. 1XSSC0. 5 X SSC :30μ L 20XSSC+1170y 1 RNase-free H2O ；0. IXSSC 7 μ L 20 X SSC+1393 μ L RNase-free Η20。重悬链霉亲和素包 裹的磁珠，用磁架捕获磁珠(约30s)后吸去上清。(4)加入300μ L的0. 5XSSC到装有链霉亲和素包裹磁珠管中，用同样的方法，轻 轻重悬磁珠后用磁架将磁珠吸到管壁上，吸去0. 5 X SSC洗涤液，重复洗涤3次。(5)将退火的Oligo (dT)探针和RNA的杂交溶液与磁珠均勻混合，室温放置10 min，每间隔广2 min轻轻重悬磁珠以保持其悬浮状态。(6)用磁架捕获磁珠，小心的去掉上清，用0. 3mL 0. 1 X SSC根据上述方法将磁珠
清洗4次。(7)加入100 μ L无RNA酶水洗脱mRNA，重悬磁珠，用磁架捕获后，小心吸取含mRNA 的上清。(8)按照步骤(7)的方法再加入150μ L灭菌水洗脱，将两次的mRNA集中到1. 5 mL 离心管(如果颗粒与mRNA —起被转移，12000r/min离心lmin，转移RNA到新管)。(9)按照 Acryl Carrier 说明浓缩 mRNA。(10)取0. 5 μ L稀释10倍后用核酸蛋白仪测定mRNA浓度核酸浓度测定仪检测， OD260/OD■在1. 9-2. 08之间，浓度在47. 2-56. 7 ng/μ L之间，说明得到质量良好，浓度合适 的mRNA，可进行SSH试验，此mRNA用于构建cDNA消减文库。C、抑制性消减杂交(SSH)试验
本试验构建乏情期西农萨能奶山羊3羔(高产)与单羔(低产)卵巢组织消减cDNA文库 (3羔卵巢组织mRNA为测试组，单羔卵巢组织mRNA为驱动组)，表示为H-L ；单羔较3羔消减cDNA文库(单羔卵巢组织mRNA为测试组，3羔卵巢组织mRNA作为驱动组)，用L-H表示。
具体试验步骤如下 (l)mRNA的反转录
A)取出灭菌后烘干的PCR管加入以下试剂
权利要求
一种奶山羊多胎和单胎卵巢差异表达新基因，是在H L消减cDNA文库中的4个ESTs序列和L H消减cDNA文库中的4个ESTs序列，其中，H L消减cDNA文库中的4个ESTs分别核组蛋白1(NUCB1)、鸟氨酸脱羧酶(OAZ1)、金属蛋白酶抑制剂(TIMP1)和锌指蛋白5(CXXC5)；L H消减cDNA文库中的4个ESTs分别为钙蛋白酶Ⅱ(calpain II)、跨膜蛋白emp24(TMED4)和与NCBI数据库中的所有序列都不匹配的2个基因片段；其特征在于所述的H L消减cDNA文库中的核组蛋白1(NUCB1)、鸟氨酸脱羧酶(OAZ1)、金属蛋白酶抑制剂(TIMP1)和锌指蛋白5(CXXC5)在山羊上未见报道，但其与牛和绵羊对应基因的同源性在90％以上，这些基因中有的与卵泡的生长发育相关；所述的L H消减cDNA文库中的钙蛋白酶Ⅱ(calpain II)和跨膜蛋白emp24(TMED4)与牛和绵羊对应基因的同源性在95％以上，分别参与卵子的激活和能量代谢。
2.如权利要求1所述的奶山羊多胎和单胎卵巢差异表达新基因，其特征在于所述的核组蛋白1 (NUCBl)的序列如下TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTACAGAGCAGGACAGGGAGCCGTGTGAGATAAGGACAGAAAGGCTGAGGGG CTGGAACCTAATTCTGGGGTGGGGTCAGTTCTGTGACCCTTCTGGGGCTGTGGAAGGAAGGGGCTCAGAGCCATGAC AGCAGGCAGGGGGCTGAGATGGCTGGAAACCAGGGGTCAGGAGAGTCAGGGCTCCTGGGGTCAGAGCTAATCAGCGA TGCAGAGGACTCTCTGGCCCTCACACCCAGCTGTGGGGGAGACACTGTCTTTGAGGCATCACCAGTCCCACAAAAGG TAGAGACAGGTGTTGAGGGGCCACTGAAGCCCCACAGACCAGCGGAAGCTGGGCCCGGGCAGCAGGCAGGATTCCAG CAGCTGTGGGGATGCGGGATGCTGGAGTGGCCACAACCTGGGGGTCAAGGCCAAACCAACTAGAAAGGCAGGTGTGA GCAGACCCTCCCTGGAGGGAGGGGGCTTCCCTAAGTGAAGCTGAGGCCAGTGAGCACTCAACTGGATACGAGAAGGC AAGTCCCTTGGAGGGGAACAGAAAGAGGGGACCACAGACTGGAAGACTGTGGAGGCTGAGGCGGCAGATATGGGGCC CGGGCAGCAGTATGAGAAGGAAGCAGCCAGCCTGTTCCCCCTCCCCCAGGAGGCCACAGTTGTGGCGGGGTCCCCAG AGGAGGTTGATTGTGACACTCCACCCCCACTCCCATCAGCCTTGGGAGGAACCCTGAGTGCTGGGATCCTGGAATGA TCACAGGTGCTGTGAATCCAGCTGGGGGAGGCTCAGGGGTCTGTTCTGGGACCTTCTTTTCTGAAGCAACCACATCC TTCTGGTCACCGGGCTGGAGCTGGGACGGGTGCATCATCTGTGTCCGGTGGAAACTTGAGCTGTCCCTCGGGGCCCG GGGGCTGGGGTTGTTGTGGCTTTTGCTGCTGCTGTTTTCCTCTGTTCCAATTTTGC ；所述的鸟氨酸脱羧酶(OAZl)的序列如下TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTGCGGCGGCGCGGAGAAGCGCAGCGGAGGTTTTGCTGGTTTCGGACCCCAG CGGCCGGATGGTGAAATCCTCCCTGCAGCGGATCCTCAACAGCCACTGCTTCGCCAGAGAGAAGGAAGGGGATAAAC CCAGCGCCACCGTCCACGCCACCCGCACCATGCCGCTCCTTAGCCTGCACAGCCGCGGAGGCCGCAGCAGCGAGAGT TCCAGGGTCTCCATCAACTGCTGTAGTAACCTGGGTCCAGGGCCTCGGTGGTGCTCCTGATGTCCCTCACCCACCCC TGAAGATCCCAGGTGGGCGAGGGAATAGTCAGAGGGATCACAATCTTTCAGCTAATTTATTTTACTCTGATAATCGG CTGAATGTAACAGAGGAACTAACGTCTAATAACAAGACGAGGATTTTTAATGTCCAGTCCAGGCTCACAGAGGCCAA ACATATTAACTGGAGAGCGGTGCTGAGCAACAGCTGCCTCTACATCGAGATCCCGGGCGGCCGCTCGA ；所述的金属蛋白酶抑制剂(TIMPl)的序列如下TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTACCTGCATCCCACCCCACCCACAGACGGCCTTCTGCAACTCCGAAGTCGT CATCAGGGCCAAGTTCGTGGGGACCGCAGAAGTCAATGAGACTGCCTTATACCAGCGTTATGAGATCAAGATGACTA AGATGTTCAAAGGGTTCAGTGCCTTGAGGGATGCCCCAGACATCCGATTCATCTACACCCCTGCCATGGAGAGCGTC TGCGGATACTTCCACAGGTCCCAGAATCGCAGTGAGGAGTTTCTCATAGCTGGACAATTGTCAAATGGGCACCTGCA CATCACCACCTGCAGTTTTGTGGCTCCCTGGAACAGCATGAGTTCTGCTCAGCGCCGGGGATTCACCAAGACCTATGCTGCTGGTTGTGAGGAATGCACAGTGTTTCCCTGCTCATCTATCCCCTGCAAACTGCAGAGCGACACTCATTGCTTG TGGACGGACCAGCTGCTCACAGGCTCTGACAAGGGGTTCCAGAGCCGCCACCTGGCCTACCTGCCCGGGCGGCCGCT CGA ；所述的锌指蛋白5 (CXXC5)的序列如下TCGAGCGGGCCGCCCGGGCAGGTTGGAGATGTTAAAACGACAACAAAAAATATATATATAAAAACAGGAATG AAATCTGTGAGAGAATATTTTTGGTTCTAAAGACGGGTGCATCCGTTTGTCTTCGCCCGAATCCCTTGCCGGAGACC ACACGAGCAGTGACATTGCACAGAGAGGGCAGCTTTGGGTTCCCGCCGCCGTCACTGAAACCACCGGAAGGCGGCTC CCGTCGGAAGCATCACCTTCTCCAGAGCAGCGGAAGGCTTCTTTTTGAGTTCCTCACATTTTCTGAATTTGCAAATC TGATGGCCAGTCTTTCGGTTCCTACAACTGCTGCACTGCTCGCAGTTGATGCGCCGCCGGCAGGGCGCACACATGCC GCAGCGTTTCCGCTTCTTCTTGCCGGAGCTGATGGCGGAGGCCAGCTCTCCCCGCATGGGGTATTCAGCCAGGCCGG CCATGTGCAGCGCGCTCTCAGCCAGGAACACGCCCGCGGGGGTCATGATGAAGGGGCCTGGGTTGATGGGAAAGGCG CCCAGGTAGGGGAAGTCGGACTGGCCATTGAGTGCTTCGGCACCCGCCACAGCCTCCATGTCGGGCAGGCCGGCGCC CGCTTCGCTCATCAGCGGTAGGTGCTCCTGCACCACGCGCTTCAGCATCTCCGTGGACTGCGCAAACTGCTGCAGTG TCAGCTGTCCCTCGGCCGCGACCACGCT ；所述的钙蛋白酶II (calpain II)的序列如下TACTTGTGGAACAACATCAAAAAGTGGCAGGCCATATACAAACAGTTTGATGTTGACCGTTCAGGGACCAT TGGCAGCAGTGAACTCCCGGGGGCCTTTGAGGCAGCAGGATTCCACCTGAATGAACATCTCTACAACATGATCATC CGACGCTACTCAGATGAGGGAGGGAACATGGATTTTGACAATTTCATCAGTTGCCTGGTCAGACTGGATGCCATGT TCCGTGCCTTCAAATCTCTTGACAAAGATGGCACTGGACAAATCCAGGTGAACATCCAGGAGTGGCTGCAGCTGAC CATGTAC ；所述的2个与NCBI数据库中的所有序列都不匹配的基因片段序列分别为TTTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTACTAGATCCCACGTGCCACAACCAAGACCCACTGCAGCCAAATAAATT AAAAAAACACAACTGCTCTGAGACACTGCCTTGACACCTGGGATACCAGGTCTCTTCATCATGGCCACAGTCAGAAG ACAGAAAACTCCTAAGCACTCCCAGGGTCCCCAGCTGCCCAGGAGGAACAGGTTGGCAGAGGCCAGATGAGGGGCTT TCCAGCAACAAACACAGACCTCCCTTCCACACCTCCACAGGGAAGAATATTCAAACATGTCCCTGACTATCTTTCCC AATTAGCCATCACGCTGCTCTCCCCCAGCCCTCTCTCCTTCTCTCCTAACCCCAGTGTATTTTCTTAAAGGTGTTTA TCTTTTTCAGAGCTTATCAGTGACCTCGGCCGCGACCACGCT ；GGTACCATGAAACTGGAGTTGGCTCAGTATCGTGAGGTTGCTGCTTTTGCCCAGTTCGGTTCTGACCTTGA TGCTGCCACTCAACAACTCTTGAGTCGTGGTGTGCGTTTGACTGAGTTGCTCAAGCAAGGACAGTATTCTCCCATG GCTATTGAAGAGCAAGTGGCTGTTATCTATGCGGGTGTCAGGGGGTATCTTGACAAGCTGGAGCCCAGCAAGATCA CAAAATTTGAGAATGCTTTCTTGTCGCACGTTATCAGCCAACATCAAACTCTGTTGGGCAAAATCAGGACCGATGG AAAGATCTCAGAAGAGGCAGATGCAAAGCTGAAAGAGATTGTAACAAACTTCTTGGCTGGATTTGAAGCTTAAAC TCCTGTGGATTCATATCAAATGCCAGTTTGGTTTTGTCATTGTTTCTTCTAGTTTCATTTGTAAAAGGATTACTC CAATACTGCAGATGTAC。
3.权利要求1所述的奶山羊多胎和单胎卵巢差异表达新基因的筛选、鉴定和功能分 析方法，其特征在于，用西农萨能奶山羊经产羊多胎和单胎卵巢作为试验材料，采用抑制性 消减杂交技术构建奶山羊多胎与单胎卵巢组织正反向消减cDNA文库，以多胎奶山羊卵巢 为高产测试组，以单胎卵巢为低产驱动组，表示为H-L ；以单胎奶山羊卵巢为低产测试组， 以多胎卵巢为高产驱动组，表示为L-H，利用生物信息学分析H-L和L-H消减文库中基因的基因结构和潜在的功能，并挑选文库中的基因，根据其序列设计PCR引物，并利用实时定量 PCR验证差异表达新基因。
4.如权利要求3所述的奶山羊多胎和单胎卵巢差异表达新基因的筛选、鉴定和功能 分析方法，其特征在于，所述的挑选文库中的基因分别为金属蛋白酶抑制剂(TIMP1)、锌 指蛋白5 (CXXC5)、鸟氨酸脱羧酶(0AZ1)，根据挑选出的消减文库中的金属蛋白酶抑制剂 (TIMPl)基因序列设计引物对P1，根据锌指蛋白5 (CXXC5)基因序列设计引物对P2，根据鸟 氨酸脱羧酶(OAZl)基因序列设计引物对P3 ；所述的引物对Pl为上游引物 Fl 5-CTCTTGAGGTGACGCATCTG-3 ； 下游引物 Rl 5-CCAGAAGGAGCAGGATTACC-3 ； 所述的引物对P2为上游引物 F2 5-GGGTGCATCCGTTTGTCTTC-3 ； 下游引物 R2 5-AACCCAAAGCTGCCCTCTCT-3 ； 所述的引物对P3为 上游引物 F3 5-GCGGAGGTTTTGCTGGTTT-3 ； 下游引物 R3 :5-GAAGCAGTGGCTGTTGAGGAT-3。
5.如权利要求3所述的奶山羊多胎和单胎卵巢差异表达新基因的筛选、鉴定和功能分 析方法，其特征在于，所述的实时定量PCR程序为95°C预变性3min ；94°C变性10s，60. 0°C 退火30s，72°C延伸30s，共30个循环。
全文摘要
本发明公开了一种奶山羊多胎和单胎卵巢差异表达新基因及其筛选、鉴定和功能分析方法，以西农萨能奶山羊为试验材料，采用抑制性消减杂交技术构建奶山羊多胎(3羔)和单胎乏情期卵巢组织正反向消减cDNA文库，筛选差异表达基因片断，利用实时定量PCR验证差异表达基因，并利用生物信息学分析基因结构和潜在的功能。
文档编号C12N15/10GK101967484SQ20101019926
公开日2011年2月9日 申请日期2010年6月12日 优先权日2010年6月12日
发明者侯金星, 安小鹏, 宋宇轩, 曹斌云, 杨明明, 王建刚 申请人:西北农林科技大学