专利名称：一种新的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养、组织工程领域，更具体地涉及一种血管组织工程反应器。
背景技术：
在组织工程领域，组织工程生物反应器是研究不同环境因素(物理、生化因素)对 特定细胞、组织的三维功能化培养的影响的重要技术手段，也是改进功能化组织质量、降低 生产成本(包括自动化、在线监控等)，使组织工程从实验室进入到标准的工业化规模化生 产和临床应用过程中的一个关键环节。因此，有针对性地研发先进的组织工程用生物反应 器对于组织工程的发展具有重大意义。迄今为止，自体移植、同种异体血管、异种血管、以及人工合成血管都不能够成为 理想的动脉血管替代物(特别是6mm 口径以下的血管)。近年来组织工程化动脉血管构建 和功能研究为这一领域带来了希望。图1显示了在生理状态下动脉血管所处的力学环境人体动脉血管内血液呈周期 性脉动流状态，血压和血液流动速度呈周期性脉搏波形态；压强和流速在一个心动周期内 有较大的脉动，分布在不同部位的动脉血管段这些特征也各不相同。近来的研究表明，在培 养过程中应力对组织工程化血管的力学特性有显著的影响，脉动流灌注下培养组织工程化 动脉血管平滑肌细胞和内皮细胞，与定常流流状态下的培养有显著的不同，因此建立可提 供脉动流培养环境的血管组织工程反应器成为近来血管组织工程领域的一个重要趋势。现有的血管组织工程反应器存在较大的缺陷，Hsiai (2002)所研制的实际上是脉 动流实验装置而不是组织工程反应器；Thompson研制的是脉动流式心瓣组织工程反应器； 上述反应器没有做流体回路的脉搏波仿真优化设计，没有仔细考虑流动阻抗、顺应性、阻 力、流动惯性的模拟，导致现有的反应器无法提供近似于动脉内血液脉动流状态的近生理 流动环境。图3显示了现有技术的一种脉动流环境动脉血管组织工程反应器的结构，以及 利用该反应器获得的压强波形(Thompson. C. Α.，Tissue Engineering, 8 (6)，2002)，该种反 应器模拟的脉搏波与生理状态下动脉血管脉搏波有较大的差别。本申请人提交的中国发明专利申请(CN101245314)公开了一种由储液瓶，脉动 源，阻力调节器，顺应性调节器和血管组织动态培养腔构成，由工控机控制的动脉血管组织 工程反应器近生理脉动流血管组织工程生物反应器，其中该反应器的脉动源由脉动源由两 端安装有单向止逆阀的脉动腔、直线直流电机构成，可以较好地模拟生理状态下动脉血管 的血流动力学环境。该脉动源包括一个可变形的腔体，腔体的进、出口处设置有单向止逆阀 模拟瓣膜功能，利用电机驱动一个活塞来压缩所述可变形腔体周围的液体，从而压缩腔体， 结合止逆阀的作用，形成液体的脉动和单向驱动。该反应器不仅结构比较复杂，并且对电机 的功率等参数要求较高，不适合用单个脉动源对多个培养回路提供脉动驱动。
发明内容
本发明的目的是提供一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，利用该反应器可以进行多种直径和长度的组织工程动脉血管培养，也可以进行血管细胞、血管组织 生物学的研究，以及进行血液循环系统组织植入物、组织替代物的培养及性能评价，其特点 在于采用新的动脉血管组织工程反应器设计方案和新的脉动发生器以液体驱动器驱动液 体在回路中流动，用由直线电机和脉动腔组成的脉动发生器产生脉动流，不需要瓣膜或模 拟瓣膜的单向止逆阀即可获得单向脉动流，用顺应性调节器和阻力调节器调节液体流动回 路的顺应性和流动阻力，模拟动脉血液流动的顺应性和流动阻力；模拟不同动脉段的脉动 频率、压强和流量波形，模拟高血压，高剪切应力，低剪切应力等血流动力学状况。根据本发明的一个方面，提供了一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应 器，其特征在于包括一个储液器，一个液体驱动器，一个血管组织动态培养腔，其中所述储液瓶、液体驱动器和血管组织动态培养腔 通过流体管路依次连接，从而形成一个流体循环回路，一个脉动发生器，其中，所述液体驱动器用于驱动液体培养基在所述流体循环回路中的循环流动，所述脉动发生器用于形成在所述流体循环回路中的循环流动的所述液体培养基 的脉动。根据本发明的一个方面，提供了一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应 器，其特征在于包括血管组织动态培养腔，可以被其它的实验段替代，所述的实验段为能够与反应器 上下游管路连接的密闭的反应单元如心脏瓣膜实验腔、人工血管实验腔等。所述的实验段用于血液循环系统中组织植入物、组织替代物的培养及性能评价， 如心脏瓣膜、动脉的瓣膜、人工血管、组织工程血管支架等。根据本发明的另一个方面，提供了一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应 器，其特征在于包括多条并行的流体循环回路，所述流体循环回路用于液体培养基的循环流动，其中 每一个所述流体循环回路均包括通过流体管路依次连接的一个储液器、一个液体驱动器、 一个血管组织动态培养腔，一个脉动发生器，所述脉动发生器包括与所述多条并行的流体循环回路分别连通的多个脉动腔，所述脉动腔是一个体积 固定的密闭腔，所述密闭腔与其所在的所述流体循环回路的所述血管组织动态培养腔上游 的所述流体管路相连通，每个所述密闭腔内有一个密闭活塞，一个单一的直线电机，连接各所述密闭活塞和所述直线电机的驱动轴的拉杆。
图1显示了人体动脉血管内血液呈周期性脉动流状态，血压和血液流动速度呈周 期性脉搏波形态；
5
图2示意显示了根据本发明的一个实施例的近生理脉动流环境动脉血管组织工 程反应器的结构；图3显示了现有技术的一种脉动流环境动脉血管组织工程反应器的结构，以及利 用该反应器获得的压强波形。图4显示了根据本发明的一个实施例的实验测得的流经血管组织的压力波形的 截屏，与生理状态下人主动脉脉搏波的压力波形近似；图5示意显示了根据本发明的一个实施例的血液循环脉动流发生器，用于评价心 脏瓣膜
具体实施例方式本发明针对动脉血管组织生长的体内力学环境，提出了一种新颖、简单、稳定的动 脉血管组织工程反应器设计方案，其中，以液体驱动器驱动液体在回路中流动，用由直线步 进电机和脉动腔组成的脉动发生器产生脉动流，用顺应性调节器和阻力调节器调节液体流 动回路的顺应性和流动阻力，模拟动脉血液流动的顺应性和流动阻力；模拟不同动脉段的 脉动频率、压强和流量波形，模拟高血压，高剪切应力，低剪切应力等血流动力学状况。另 外，本发明提供的血管组织工程反应器，其液体驱动器可以同时为1-6路独立的培养回路 提供液体驱动，脉动发生器可以同时为1-6路独立的培养回路提供脉动，大大提高了反应 器的使用效率。另外，本发明提供的血管组织工程生物反应器不需要瓣膜或模拟瓣膜的单 向止逆阀即可提供单向的近生理脉动流。如图2所示，根据本发明的一个实施例的一种近生理脉动流环境动脉血管组织工 程反应器能够在流动回路上模拟动脉血液流动的顺应性、流动惯性和流动阻力等阻抗特 性，产生近生理脉动流，并能够用于组织工程动脉血管的培养，该反应器包括储液瓶27、液 体驱动器21、顺应性调节器22、第一阻力调节器23，脉动发生器24和血管组织动态培养腔 25、第二阻力调节器26 ；储液瓶27、液体驱动器21、顺应性调节器22、第一阻力调节器23， 脉动发生器24和血管组织动态培养腔25、第二阻力调节器26通过流体管路依次连接，从而 形成一个流体循环回路。根据本发明的一个实施例，该反应器可由一个工控机(未显示) 控制。在根据如图2所示的本发明实施例的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应 器中a.培养基从储液瓶27出发，经过液体驱动器21、顺应性调节器22、第一阻力调节 器23后进入脉动发生器24，产生脉动后流入血管组织动态培养腔25中的血管组织培养物 (28)，流出血管组织动态培养腔25后经第二阻力调节器26，回到储液瓶21，从而完成了一 个血管内循环；该流路构成可以使流经血管组织培养物28的培养基具有近生理脉动流的 特性；b.储液瓶27经由无菌空气交换器(未显示)与瓶外空气相通；储液瓶27可以与 PH计(未显示)相连接，可以在线检测瓶中液体的pH值；储液瓶27有换液装置(未显示)， 便于更换培养基；c.培养基由液体驱动器21驱动在管路中流动，液体驱动器21可包括蠕动泵、往复 泵等能够使液体产生流动的设备；
d.培养基经过脉动发生器24成为脉动流状态；脉动发生器24包括脉动腔241、拉 杆242、直线步进电机243 ；脉动腔241为体积固定的密闭腔，密闭腔内的一个密闭活塞244 与直线电机243的驱动轴通过一个拉杆242相连，密闭腔241与所述血管组织动态培养腔 25上游的所述流体管路相连通；e.在流动回路的上游，在液体驱动器21和脉动发生器24之间设有一个顺应性调 节器22，用于调节流体在管路中的流动惯性；f.在流动回路的上游，在顺应性调节器22和脉动发生器24之间有一个第一阻力 调节器23，用于调节回路中的流动阻力；g.血管组织动态培养腔25为两端有接头的密闭腔，密闭腔两端的接头连接上下 游反应器管路和血管组织培养物28 ；h.在流动回路的下游，在血管组织动态培养腔25和储液瓶27之间有一个第二阻 力调节器26，用于调节回路中的流动阻力；通过脉动发生器24、顺应性调节器22和第一和第二阻力调节器23、26，可以在一 定范围内调整脉搏波波形、压强和流量范围、及搏动频率，对培养的血管模拟不同动脉段的 脉动频率、压强和流量波形，模拟高血压，高剪切应力，低剪切应力等血流动力学状况。如图5所示，根据本发明的一个实施例的一种血液循环中的脉动流发生器能够在 流动回路上模拟血液循环中的脉动流，并能够用于血液循环系统中的组织植入物、组织替 代物的培养及性能评价(如心脏瓣膜、动脉的瓣膜、人工血管、组织工程血管支架等)，该反 应器包括储液瓶57、液体驱动器51、顺应性调节器52、第一阻力调节器53，脉动发生器54 和血管组织动态培养腔55、第二阻力调节器56 ；储液瓶57、液体驱动器51、顺应性调节器 52、第一阻力调节器53，脉动发生器54和实验段55、第二阻力调节器56通过流体管路依次 连接，从而形成一个流体循环回路。根据本发明的一个实施例，该反应器可由一个工控机 (未显示)控制。所述的实验段为能够与反应器上下游管路连接的密闭的反应单元如心脏瓣膜实 验腔、人工血管实验腔等，用于血液循环系统中的组织植入物、组织替代物的培养及性能评 价(如心脏瓣膜、动脉的瓣膜、人工血管、组织工程血管支架等)。本发明的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器可用于组织工程动脉血管 的培养；该动脉血管的管材包括-经过脱细胞处理的动物血管，-由胶原、蚕丝纤维、羊毛纤维等天然材料构成的管材-由PLGA、PLA、PLG、海藻酸钠、聚四氟乙烯等高聚物构成的管材，上述动脉血管的直径在2-10mm之间，长度在4-30cm之间；血管管材上的细胞包括 血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和外膜成纤维细胞。储液瓶材质可以为玻璃、不锈钢、塑料、聚碳酸酯等；储液瓶的容量在0.2L-2L之 间；储液瓶经由无菌空气交换器与瓶外空气相通；储液瓶与PH计(未显示)相连接，可以在 线检测瓶中液体的PH值；储液瓶有换液装置，便于换液。脉动发生器由脉动腔、直线步进电机构成；脉动腔为体积固定的密闭腔，密闭腔的 一端通过密闭活塞与直线直流电机的拉杆相连，密闭腔的另一端与上下游的反应器管路相 连。其中直线步进电机的往复运动带动脉动腔一端的密闭活塞往复运动，模拟心脏射血入主动脉的过程，不需要瓣膜或模拟瓣膜的单向止逆阀即可提供单向的脉动流；在一定范围 内可以调节脉动流的脉动频率、流量和压强，其中脉动频率控制在0-200次/分钟，流量范 围控制在O-IOOOml/分钟，压强控制在0-250mmHg。血管组织动态培养腔为密闭腔，用于培养血管组织；密闭腔两端有接头连接反应 器管路和血管组织培养物，培养基在血管组织培养物内脉动流动，为培养的细胞提供营养 物质并提供近生理状态的压强和剪切应力；血管组织动态培养腔的材质可以为玻璃、不锈 钢、塑料、或聚碳酸酯，容量在0-200ml之间，长度在5-50cm之间；密闭腔两端连接血管组织 培养物的接头直径在2-15mm之间，接头间距在5-50cm之间，材质可以为不锈钢、塑料、或聚 碳酸酯。整个血管组织动态培养腔可拆卸、可高温消毒。反应器用于模拟近似于生理脉动流的整体波形、二次波、幅度和时相，和/或模拟 类似于高血压的高管内压强、高剪切应力等血流动力学环境。阻力调节器23、26可以调节 血管组织动态培养腔的培养液灌注压强和培养液灌注压强波形、波幅；顺应性调节器22可 以调节组织动态培养腔的流动惯性；通过阻力调节器23、26和顺应性调节器22的共同调 节，可获得近似于生理脉动流的整体波形、二次波、幅度和时相，获得类似于高血压的高管 内压强、高剪切应力等血流动力学环境，和/或模拟动脉血管在低剪切应力时的血流动力 学状况。可通过把根据本发明的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器的整个循环 管路放入动物细胞培养箱，而在所述整个循环管路上维持37°C，5-15% C02，95%相对湿度 的培养条件。根据本发明的整个反应器系统具有安装、拆卸方便的优点；包括循环通道管路和 接头的整个反应器可拆卸、可消毒，消毒条件为诸如130°C，3个大气压，时间1小时。根据本发明的一个进一步的实施例的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应 器包括多条并行的流体循环回路，其中每一个所述流体循环回路均包括通过流体管路依 次连接的一个储液器27、一个液体驱动器21、一个血管组织动态培养腔25，一个脉动发生器24，所述脉动发生器包括与所述多条并行的流体循环回路分别连通和对应的多个脉动腔241，所述脉动腔 241是一个体积固定的密闭腔，并与其所在的所述流体循环回路的所述血管组织动态培养 腔25上游的所述流体管路相连通，每个所述密闭腔内有一个密闭活塞244，一个单一的直线电机243，拉杆242，该拉杆242连接各所述密闭活塞244和所述直线电机243的驱动轴。根据本发明的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，与现有反应器相比， 有如下有益效果1.本发明所提供的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器克服了常用的动 脉血管组织工程反应器无法模拟动脉血管血液流动的顺应性、流动惯性和流动阻力等阻抗 特性，无法提供近似于动脉内血液脉动流环境的缺点，能够在流动回路上模拟动脉血液流 动的顺应性、流动惯性和流动阻力等阻抗特性，能够在流动回路上模拟不同动脉段血流的 压强和流量脉搏波，产生近生理脉动流；能够模拟高血压，高剪切应力，低剪切应力等血流 动力学状况；
8
2.本发明所提供的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，采用了新的流路 设计方案和新的脉动发生器，以液体驱动器驱动液体在回路中流动，用由直线步进电机和 脉动腔组成的脉动发生器产生脉动流，不需要瓣膜或模拟瓣膜的单向止逆阀即可提供单向 的脉动流；用顺应性调节器和阻力调节器调节液体流动回路的顺应性和流动阻力，模拟动 脉血液流动的顺应性和流动阻力，使设备更加简单，性能更加稳定；3.本发明所提供的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，一个液体驱动器 可以同时为1-6路独立的培养回路提供液体驱动，且一个脉动发生器可以同时为1-6路独 立的培养回路提供脉动，大大提高了反应器的使用效率；4.本发明所提供的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器既可用于培养动 脉血管组织，也可用作血液循环系统中的组织植入物、组织替代物的培养及性能评价(如 心脏瓣膜、动脉的瓣膜、人工血管、组织工程血管支架等)，具有较大的推广应用前景和较大 的潜在社会经济效益。下文提供了实施例进一步说明本发明，但本发明不仅限于以下实施例。实施例1.1.按照图2连接反应器部件，包括储液瓶27、液体驱动器21、顺应性调节器22、第 一阻力调节器23、脉动发生器24、血管组织动态培养腔25、第二阻力调节器26 ；2.消毒反应器，消毒条件为130°C，3个大气压，时间1小时；3.在血管组织动态培养腔25内安装组织工程血管培养物；4.按照培养要求配制培养基，将无菌培养基注入储液瓶；5.设定液体驱动器的流速，设定直线步进电机运动频率为70次/分钟，电机增益 1-5%之间，设定初始位置；启动液体驱动器和直线步进电机，开始灌注培养；6.调节阻力调节器23、26和顺应性调节器22，控制流经血管组织动态培养腔的培 养基压强、流量波形其中进口压强在80-150mmHg之间，出口压强在60-120mmHg之间；流 量在 0-1. 6ml/s ；实施例2.1.按照图2连接反应器部件，包括储液瓶27、液体驱动器21、顺应性调节器22、第 一阻力调节器23、脉动发生器24、血管组织动态培养腔25、第二阻力调节器26 ；2.消毒反应器，消毒条件为130°C，3个大气压，时间1小时；3.在血管组织动态培养腔安装组织工程血管培养物；4.按照培养要求配制培养基，将无菌培养基注入储液瓶；5.设定液体驱动器21的流速，设定直线步进电机运动频率为70次/分钟，电机增 益1-5%之间，设定初始位置；启动液体驱动器和直线步进电机，开始灌注培养；6.调节阻力调节器23、26和顺应性调节器，控制流经血管组织动态培养腔25的压 强、流量波形其中进口压强在IlO-HOmmHg之间，出口压强在85-110mmHg之间。图4显示了根据本发明的一个实施例的实验测得的流经血管组织的压力波形的 截屏，其与生理状态下人主动脉脉搏波的压力波形近似。实施例3.1.按照图5连接反应器部件，包括储液瓶57、液体驱动器51、顺应性调节器52、第 一阻力调节器53、脉动发生器54、心脏瓣膜实验腔55、第二阻力调节器56 ；
9
2.在心脏瓣膜实验腔安装待测试的心脏瓣膜58 ；3.将缓冲液注入储液瓶；4.设定液体驱动器21的流速，设定直线步进电机运动频率为70次/分钟，电机增 益1-5%之间，设定初始位置；启动液体驱动器和直线步进电机，开始灌注测试；5.调节阻力调节器53、56和顺应性调节器，控制流经心脏瓣膜实验腔55的压强、 流量波形其中进口压强在IlO-HOmmHg之间，出口压强在85-110mmHg之间。应当理解的是，在以上叙述和说明中对本发明所进行的描述只是说明而非限定性 的，且在不脱离如所附权利要求书所限定的本发明的前提下，可以对上述实施例进行各种 改变、变形、和/或修正。
10
权利要求
一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，其特征在于包括一个储液器(27)，一个液体驱动器(21)，一个血管组织动态培养腔(25)，其中所述储液瓶(27)、液体驱动器(21)和血管组织动态培养腔(25)通过流体管路依次连接，从而形成一个流体循环回路，一个脉动发生器(24)，其中，所述液体驱动器(21)用于驱动液体培养基在所述流体循环回路中的循环流动，所述脉动发生器(24)用于形成在所述流体循环回路中的循环流动的所述液体培养基的脉动。
2.根据权利要求1所述的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，其特征在于所 述脉动发生器(24)进一步包括一个脉动腔(241)，所述脉动腔(241)是一个体积固定的密闭腔， 所述脉动腔内的一个密闭活塞(244)， 一个直线步进电机(243)，一个拉杆(242)，该拉杆把所述密闭活塞(244)与所述直线步进电机(243)的驱动轴相连，其中所述密闭腔与所述血管组织动态培养腔(25)上游的所述流体管路相连通。
3.根据权利要求2所述的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，其特征在于进 一步包括设置在所述液体驱动器与所述脉动发生器之间的所述流体循环回路上的一个顺应性 调节器(22)，设置在所述液体驱动器与所述脉动发生器之间的所述流体循环回路上的一个第一阻 力调节器(23)，设置在所述血管组织动态培养腔(25)与所述储液器(27)之间的所述流体循环回路上 的一个第二阻力调节器(26)。
4.根据权利要求3所述的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，其特征在于 所述反应器由一个工控机控制。
5.根据权利要求3所述的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，其特征在于 所述血管组织动态培养腔(25)包括一个密闭腔，该密闭腔的两端有用于连接所述流体管路和待培养的血管组织培养物的接头，从而使所述液体培养基在所述待培养血管组织 培养物内脉动流动；所述的血管组织动态培养腔，可以被其它的实验段替代，所述的实验段为能够与反应 器上下游管路连接的密闭的反应单元如心脏瓣膜实验腔、人工血管实验腔等；所述的实验 段用于血液循环系统中组织植入物、组织替代物的培养及性能评价，如心脏瓣膜、动脉的瓣 膜、人工血管、组织工程血管支架等。
6.一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，其特征在于包括多条并行的流体循环回路，所述流体循环回路用于液体培养基的循环流动，其中每一 个所述流体循环回路均包括通过流体管路依次连接的一个储液器(27)、一个液体驱动器(21)、一个血管组织动态培养腔(25)，一个脉动发生器(24)，所述脉动发生器包括与所述多条并行的流体循环回路分别连通的多个脉动腔(241)，所述脉动腔(241)是 一个体积固定的密闭腔，所述脉动腔与其所在的所述流体循环回路的所述血管组织动态培 养腔(25)上游的所述流体管路相连通，每个所述密闭腔内有一个密闭活塞(244)， 一个单一的直线电机(243)，连接各所述密闭活塞(244)和所述直线电机(243)的驱动轴的拉杆(242)。
7.根据权利要求6所述的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，其特征在于每 个所述流体循环回路进一步包括设置在所述液体驱动器与所述脉动发生器之间的所述流体循环回路上的一个顺应性 调节器(22)，设置在所述液体驱动器与所述脉动发生器之间的所述流体循环回路上的一个第一阻 力调节器(23)，设置在所述血管组织动态培养腔(25)与所述储液器(27)之间的所述流体循环回路上 的一个第二阻力调节器(26)。
8.根据权利要求7所述的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，其特征在于 所述反应器由一个工控机控制。
9.根据权利要求7所述的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，其特征在于 每个所述血管组织动态培养腔(25)包括一个密闭腔，该密闭腔的两端有用于连接所述流体管路和待培养的血管组织培养物的接头，从而使所述液体培养基在所述待培养血管 组织培养物内脉动流动。
全文摘要
一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，包括储液器27，液体驱动器21，血管组织动态培养腔25，其中储液瓶27、液体驱动器21和血管组织动态培养腔25通过流体管路依次连接成流体循环回路，脉动发生器24，其中液体驱动器21驱动液体培养基的循环流动，脉动发生器24形成循环流动的所述液体培养基的脉动。脉动发生器24包括脉动腔241，它是体积固定的密闭腔；脉动腔内的密闭活塞244；直线步进电机243；拉杆242，该拉杆把密闭活塞244与直线步进电机243的驱动轴相连，其中密闭腔与培养腔25上游的流体管路相连通。
文档编号C12M3/00GK101974423SQ20101025854
公开日2011年2月16日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者李晋川, 樊瑜波, 贡向辉, 邹远文, 黄学晋 申请人:北京航空航天大学;四川大学