专利名称：柑桔碎叶病毒巢式rt-pcr检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于一种RT-PCR检测方法及其检测用试剂盒，具体的说，涉及一种柑桔碎 叶病毒巢式RT-PCR检测方法及其试剂盒。
背景技术：
柑桔碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus, CTLV)是威胁柑桔生产的重要病原 之一。CTLV在我国浙江、湖南、福建和广西等地的局部地区曾造成比较严重的危害。应用和 推广无病毒柑桔苗木是CTLV防治的有效措施。目前，柑桔无病毒苗木三级繁育体系已在我 国多个柑桔产区建立，无病毒苗木得到了大面积的推广。为保证种苗安全，必须对采穗母本 树进行定期鉴定，并对感染病毒的良种进行脱毒处理。这必然要求快速、灵敏的病毒检测技 术。CTLV是发状病毒属(CapiIlovirus)正义单链RNA病毒，病毒粒子呈弯曲线状，大 小约为600 700nmX15nm，基因组全长约6496 nt，5’端具帽子结构，3’端具Poly (A)尾 巴。应用腊斯克枳橙等指示植物鉴定是CTLV检测的常规手段之一，但其检测周期较长(1 一 2年)并易受环境条件影响。血清学检测技术大大提高了 CTLV的检测速度，在美国、日本等 国得到广泛应用。Kawai等还制备了 CTLV单克隆抗体用于酶联免疫法检测。但抗体制备 不易，检测灵敏度有待提高。随着分子生物学的发展，RT-PCR检测方法以其速度快、灵敏度 高、特异性好等特点受到青睐。Magome等，Osvaldo等，Kirby等分别建立了 RT-PCR检测 体系，成功扩增出了 CTLV特异性片段。Hailstones等建立了 CTLV的半巢式RT-PCR检测 方法，比Kawai等酶联免疫法的灵敏度提高500倍以上。已有的报道表明，巢式PCR往往 比普通PCR具有更高的灵敏度，但关于CTLV的巢式RT-PCR检测方法尚无报道。我国可能 是CTLV的起源地，因而不同地域或品种的分离物可能存在较大变异。在对我国CTLV的实 际检测中，上述方法在检测灵敏度、检测范围上可能具有一定的局限性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有传统检测技术中的不足之处，提供一种柑桔碎叶病毒 的特异性强、灵敏度高的巢式RT-PCR检测方法，本发明还提供了一种用于检测柑桔碎叶病 毒的试剂盒，适合大规模、高通量样品检测。本发明目的是这样实现的本发明从自行设计的和已报道的检测柑桔碎叶病毒的 引物中筛选出两对特异性引物用于柑桔碎叶病毒的巢式RT-PCR检测，其碱基序列为
上游外部引物5，-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3， 下游外部引物5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3， 上游内部引物5’ -GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3’ 下游内部引物5’ - CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3，。本发明的目的可通过如下步骤来实现
(1)取适量CTLV寄主植物的叶或皮在液氮中充分研磨，加入核酸提取液提取样品总核酸或RNA ；
(2)第一步RT-PCR反应，所用特异性引物为上游外部引物 5，-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3，、下游外部引物 5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3，；反应体系总体 积 10μ L，包括2XPCR 缓冲液 5 μ L，10 μ mol/μ L 上下游引物各 0.5 μ L，50 mmol/L MgSO4 0. 3μ L,5 U/μ L RT/Taq 酶 0. 2yL，模板核酸 1 μ L，超纯水 2. 5 μ L ;RT_PCR 扩增条件为: 42°C 30 min ；94°C 2 min ；94°C 20s, 54. 5°C 20 s，72°C 45s，40 个循环；72°C 10 min;
(3)第二步PCR反应，所用特异性引物为上游内部引物 5，-GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3，、下游内部引物 5，-CTCCTAACCCTCCAGTTCCA-3，；第二步扩增 以第一步PCR产物混合液作为模板进行，反应体系为10XPCR缓冲液2.5 μ L，10 mmol/L dNTP 0.8 μ L，50 mmol/L MgSO4 0· 8 μ L，10 μ mol/μ L 弓丨物各 1 μ L，5 U/μ L Taq 酶 0. 3 μ L，超纯水17. 6 μ L，第一轮RT-PCR的反应混合液IyL ； PCR扩增条件为94°C，2 min ； 94°C, 20 s，56°C，20 s，72°C，45s，40 个循环；72°C 10 min。(4)琼脂糖凝胶或聚丙烯酰氨凝胶电泳、染色、获取电泳图谱；
(5)依据上述图谱的条带特征诊断CTLV的分子变异类型。见附图1，与标准Marker 比较，电泳图谱中如出现256bp扩增条带，表明该样品中存在柑桔碎叶病毒，如果没有出现 256bp扩增条带，表明该样品中不存在柑桔碎叶病毒。在上述方案中步骤(1)的提取方法为称取5 mg病毒寄主皮或叶装入一无菌离心 管中，在液氮中研磨后依次加入60μ L TES缓冲液和60 μ L饱和酚氯仿异戊醇混合溶液， 所述酚氯仿异戊醇的体积比为25 24 :1，混勻；70°C水浴5 10分钟；室温下13 OOOrpm 离心5分钟，吸取40 μ L上清液加入由S印hadex G_50_80构成的微柱中，置于一新的无菌 离心管，5 OOOrpm离心4分钟，收集洗脱液。本发明的检测柑桔碎叶病毒的检测试剂盒由以下试剂构成由以下试剂构成缓冲 液A、RT/Taq酶、Taq酶、CTLV正对照、缓冲液B和双蒸水；其中，缓冲液A由10 mOl/L柑桔碎 叶病毒特异性上游外部引物5’ -CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3‘、10 mol/L柑桔碎叶病毒特异性下 游外部引物 5’-AGAGTGGACMACTCTA-3’、2XPCR 缓冲液、50 mmol/L MgSO4 和超纯水 1. 5 μ L 组 成；缓冲液B由10 mol/L柑桔碎叶病毒特异性上游内部引物5’ "GCTGATTTGGCTCGTGMTT-3’、 10 mol/L柑桔碎叶病毒特异性下游内部引物5’ - CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3M0XPCR缓冲 液、10 mmol/L dNTP、50 mmol/L MgSO4 和超纯水组成。单样用量的缓冲液A含Ιθμπιο /L柑桔碎叶病毒特异性上游外部引物 5，-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3，0. 5 μ L，10 μ mol/L柑桔碎叶病毒特异性下游外部引物 5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3，0. 5 μ L，2XPCR 缓冲液 5μ L,50 mmol/L MgSO4 0· 3 μ L、 超纯水1.5yL;单样用量的缓冲液B含ΙΟμπιοΙ/L柑桔碎叶病毒特异性上游内部引物 5，-GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3，1 μ LUOy mol/L柑桔碎叶病毒特异性下游内部引物5，-CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3，1 μ LUO XPCR 缓冲液 2.5 μ L, 10 mmol/L dNTP 0. 8 μ L, 50 mmol/L MgSO4 0. 8 μ L,超纯水 17. 6 μ L。与现有技术相比，本发明的优点在于
(1)实用性强、检测周期短，现有检测方法中，其中腊斯克枳橙等指示植物鉴定方法检 测周期很长，需要1-2年，且易受外界环境条件影响，血清学检测技术虽然大大提高了 CTLV 的检测速度，在美国、日本等国得到广泛应用。Kawai等还制备了 CTLV单克隆抗体用于酶联免疫法检测。但抗体制备不易，而本发明的速度得到了很大的提高，从样品制备到获检测结 果图谱可在一天之内完成，且制作简单，实用性强；
(2)操作简便，重复性好、稳定性高，同一样品的不同检测批次，不同人员操作，其结果 一致性强，适合大规模、高通量的样品分析。一次可处理样品几十个；
(3)灵敏度高，为了评估本发明检测方法的灵敏度，发明人以嫁接了CTLV毒源的大叶 大果甜橙为对象按步骤1的方法抽提样品总核酸并检测其浓度，依次做10倍梯度稀释后各 取Iy L平行进行一步法和巢式RT-PCR检测。检测结果显示，所抽提的总核酸A260 /A280 平均值为1. 28，其浓度为126. 98ng · μ L — 1 ；RT-PCR结果显示(图2)，一步法RT-PCR能够 检测到IO2倍稀释的模板，浓度约为1. 27ng · μ L_ \而巢式RT-PCR能够检测到IO5倍稀释 的模板，浓度约为1. 27pg · μ I/1，这表明本发明检测方法的检测灵敏度较一步法RT-PCR提 高1000倍。
图1是本发明检测结果示意图；其中1-10代表柑桔碎叶病毒样品(阳性，具有 256bp特征性条带)，11代表负对照；M代表IOObp梯度DNA标准Marker ；
图2是巢式RT-PCR与一步法RT-PCR检测CTLV的灵敏度比较结果示意图；1_7 巢式 RT-PCR ;8-14 —步法 RT-PCR ； 1-7 和 8-14 稀释度分别依次是100，KT11KT2, 1(Γ3，1(Γ4， 1(Γ5，ΙΟ—6 ； M IOObp梯度DNA标准分子量。
具体实施例方式本发明中所使用的术语“PCR”又称聚合酶链式反应，通常需要获得感兴趣 区域端或其外延的序列信息，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物应与待扩增模板相 反链的序列相同或相似，两个引物的5’端核苷酸可以与扩增材料的两端恰好重合，PCR 技术可用来扩增全部基因组DNA中的、从全细胞RNA、噬菌体或质粒序列等转录获得的 cDNA 中的待定 RNA 序列、待定 DNA 序列。见 Mullis 等，Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 51. 263(1987)。RT-PCR 为反转录 RCR (reverse transcription PCR)和实时 PCR (real time PCR)共同的缩写。逆转录 PCR，或者称反转录 PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR), 是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为 互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。TES缓冲液指三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸生物缓冲液。dNTP 指，deoxy-ribonucleoside triphosphate (三磷酸脱氧核糖核苷)。实施例1 柑桔碎叶毒病巢式RT-PCR检测方法 (1)核酸提取
称取病毒寄主皮或叶各5啤，分别装入一无菌离心管中，在液氮中研磨后依次加入 60 μ L TES缓冲液和60 μ L饱和酚氯仿异戊醇(体积比为25 24 1 )，混勻。70°C水浴5 10 分钟。室温下13 OOOrpm离心5分钟，吸取40 μ L上清液加入由S印hadex G-50-80构成的 微柱中，置于一新的无菌离心管，5000rpm离心4分钟，收集洗脱液，得到样品1_11。(2)巢式 RT-PCR第一步RT-PCR反应，所用特异性引物为上游外部引物 5，-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3，、下游外部引物 5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3，；反应体系总体 积 10μ L，包括2XPCR 缓冲液 5 μ L，10 μ mol/μ L 上下游引物各 0.5 μ L，50 mmol/L MgSO4 0. 3μ L,5 U/μ L RT/Taq 酶 0. 2yL，模板核酸 1 μ L，超纯水 2. 5 μ L ;RT_PCR 扩增条件为: 42°C, 30 min;94°C，2 min ;94°C，20s，54. 5°C，20 s，72°C，45s，40 个循环；72°C 10 min;
第二步PCR反应，所用特异性引物为上游内部引物5’ -GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3’、 下游内部引物5’ -CTCCTAACCCTCCAGTTCCA-3，；第二步扩增以第一步PCR产物混合液作为 模板进行，反应体系为反应体系为10XPCR缓冲液2.5 yL,10 mmol/L dNTP 0.8 μ L， 50 mmol/L MgSO4 0. 8 μ L，10 μ mol/μ L 上下游引物各 1 μ L，5 U/μ L Taq 酶 0. 3 yL，超 纯水17. 6 μ L，第一轮RT-PCR的反应混合液IyL; PCR扩增条件为94°C，2 min ；94°C，20 s，56°C，20 s，72°C，45s，40 个循环；72°C 10 min。(3)电泳及图谱获取
配制1. 2%琼脂糖凝胶，将上步反应混合液5 μ L与3 μ L染料混勻后点样，同时点5 μ L 的DNA标准Marker ；电泳条件为初始电压150V，10分钟；后续电压100V，30分钟。电泳完 毕后EB染色15分钟，在凝胶成像系统中获取图谱。(4) CTLV 的诊断
检测结果如图1所示，通过与DNA标准Marker比较，可以看出 样品1 一 10电泳图谱中出现256bp特征性条带，表明样品中存在柑桔碎叶病毒，而负 对照11未出现256bp特征性条带，表明样品中不存在柑桔碎叶病毒。实施例2 —种同时检测柑桔碎叶病毒的巢式RT-PCR试剂盒
该试剂盒由以下试剂组成(100样)
其中，缓冲液A由ΙΟμπιοΙ/L柑桔碎叶病毒特异性上游外部引物 5’ -CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3\ 10 μ mol/L柑桔碎叶病毒特异性下游外部引物 5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3\2XPCR 缓冲液、50 mmol/L MgSO4 和超纯水组成，它们 的体积比为5:5:5:3:1.5 ；冲液B含ΙΟμπιοΙ/L柑桔碎叶病毒特异性上游内部引物 5’ -GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3’、10 μ mol/L柑桔碎叶病毒特异性下游内部引物5’ -CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3，、10 XPCR 缓冲液、10 mmol/L dNTP、50 mmol/L MgSO4 和超纯 水，它们的体积比为10 10 25 8 8 176。 单样用量的缓冲液A含ΙΟμπιοΙ/L柑桔碎叶病毒特异性上游外部引物 5，-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3，0. 5 μ L，10 μ mol/L柑桔碎叶病毒特异性下游外部引 物 5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3，0. 5 μ L，2 X PCR 缓冲液 5 μ L, 50 mmol/L MgSO4 0. 3 μ L 超纯水1.5yL;单样用量的缓冲液B含ΙΟμπιοΙ/L柑桔碎叶病毒特异性上游内部引物 5，-GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3，1 μ LUOy mol/L柑桔碎叶病毒特异性下游内部引物5，-CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3，1 μ LUO XPCR 缓冲液 2.5 μ L, 10 mmol/L dNTP 0. 8 μ L, 50 mmol/L MgSO4 0. 8 μ L,超纯水 17. 6 μ L。
权利要求
一种柑桔碎叶病毒巢式RT PCR检测方法，其特征在于以柑桔碎叶病毒特异性上游外部引物、下游外部引物进行对待测样品第一轮RT PCR扩增，再以柑桔碎叶病毒特异性上游内部引物、下游内部引物进行第二轮PCR扩增，最后电泳鉴定；所述柑桔碎叶病毒的特异性引物为上游外部引物5’ CCCTCTCAGCTAGAATTGAA 3’下游外部引物5’ AGAGTGGACAAACTCTA 3’上游内部引物5’ GCTGATTTGGCTCGTGAATT 3’下游内部引物5’ CTCCTAACCCTCCAGTTCCA 3’。
2.根据权利要求1所述柑桔碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤(1)取适量CTLV寄主植物的叶或皮在液氮中充分研磨，加入核酸提取液提取样品总核 酸或RNA ；(2)第一步RT-PCR反应，所用特异性引物为上游外部引物 5，-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3，、下游外部引物 5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3，；反应体系总体 积 10μ L，包括2XPCR 缓冲液 5 μ L，10 μ mol/μ L 上下游引物各 0.5 μ L，50 mmol/L MgSO4 0· 3 μ L，5 U/μ L RT/Taq 酶 0· 2 μ L，模板核酸 1 μ L，超纯水 2. 5 μ L ；RT-PCR 扩增条件为:42°C 30 min ；94°C 2 min ；94°C 20s, 54. 5°C 20 s，72°C 45s，40 个 循环；72°C 10 min;(3)第二步PCR反应，所用特异性引物为上游内部引物 5，-GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3，、下游内部引物 5，-CTCCTAACCCTCCAGTTCCA-3，；第二步扩增 以第一步PCR产物混合液作为模板进行，反应体系为10XPCR缓冲液2.5 μ L，10 mmol/L dNTP 0.8 μ L，50 mmol/L MgSO4 0· 8 μ L，10 μ mol/μ L 弓 |物各 1 μ L，5 U/μ L Taq 酶 0· 3 μ L，超纯水17. 6 μ L，第一轮RT-PCR的反应混合液IyL;PCR 扩增条件为94°C，2 min ；94°C,20 s，56°C，20 s，72°C，45s，40 个循环；72°C 10min ；(4)琼脂糖凝胶或聚丙烯酰氨凝胶电泳、染色、获取电泳图谱；(5)依据上述图谱的条带特征诊断CTLV的分子变异类型。
3.根据权利要求2所述柑桔碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法，其特征在于步骤(1) 的提取方法为称取5啤病毒寄主皮或叶装入一无菌离心管中，在液氮中研磨后依次加入 60μ L TES缓冲液和60μ L饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液，混勻，所述酚氯仿异戊醇的体 积比为25 24 1 ；70°C水浴5 10分钟；室温下13000rpm离心5分钟，吸取40 μ L上清液加 入由S印hadex G-50-80构成的微柱中，置于一新的无菌离心管，5000rpm离心4分钟，收集 洗脱液。
4.根据权利要求2所述柑桔碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法，其特征在于所述柑桔碎 叶病毒特异性引物巢式扩增产物大小为256bp。
5.一种检测柑桔碎叶病毒的检测试剂盒，其特征在于由以下试剂构成缓冲液A、RT/ Taq酶、Taq酶、CTLV正对照、缓冲液B和双蒸水；其中，缓冲液A由10 μ mol/L柑桔碎叶病 毒特异性上游外部引物5’ -CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3’、10 μ mol/L柑桔碎叶病毒特异性下 游外部引物 5，-AGAGTGGACAAACTCTA-3，、2XPCR 缓冲液、50 mmol/L MgSO4 和超纯水组成；冲液B含10 μ mo 1 /L柑桔碎叶病毒特异性上游内部引物5 ’ -GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3，、 10 μ mol/L柑桔碎叶病毒特异性下游内部引物5，- CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3，UOXPCR 缓冲液、10 mmol/L dNTP、50 mmol/L MgSO4 和超纯水。
6.根据权利要求5所述检测柑桔碎叶病毒的检测试剂盒，其特征在于单样用量的缓 冲液A含10 μ mo 1 /L柑桔碎叶病毒特异性上游外部引物5 ’ -CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3 ’ 0. 5 μ L，10 μ mol/L柑桔碎叶病毒特异性下游外部引物5’ -AGAGTGGACAAACTCTA-3’ 0. 5 μ L，2 XPCR 缓冲液 5yL，50 mmol/L MgSO4 0. 3 μ L、超纯水 1. 5 μ L ；单样用量的缓冲 液B含10 μ mo 1 /L柑桔碎叶病毒特异性上游内部引物5 ’ -GCTGATTTGGCTCGTGAATT-3，1 μ L、10ymol/L柑桔碎叶病毒特异性下游内部引物5’ - CTCCTAACCCTCCAGTTCCA -3’ 1 μ LU0XPCR 缓冲液 2.5 μ L, 10 mmol/L dNTP 0.8 μ L,50 mmol/L MgSO4 0.8 yL，超纯 水 17. 6 μ L0
全文摘要
本发明公开了一种检测柑桔碎叶病毒的巢式RT-PCR检测方法和试剂盒，属于生物技术领域。本方法通过提取核酸，应用柑桔碎叶病毒特异性上游外部引物、下游外部引物对待测样品进行第一轮RT-PCR扩增，再以柑桔碎叶病毒特异性上游内部引物、下游内部引物进行第二轮PCR扩增，最后电泳判断检测样品中是否存在柑桔碎叶病毒电泳图谱中如出现256bp特征性条带，表明该样品中存在柑桔碎叶病毒，如果没有出现256bp特征性条带，表明该样品中不存在柑桔碎叶病毒。本发明还相应地建立了检测试剂盒，可特异、灵敏、高效地检测柑桔碎叶病毒，适用于田间样品检测、CTLV流行监控、脱毒苗木鉴定等多种用途。
文档编号C12Q1/70GK101914633SQ20101028155
公开日2010年12月15日 申请日期2010年9月15日 优先权日2010年9月15日
发明者刘科宏, 周常勇, 唐科志, 宋震, 李中安, 杨方云 申请人:西南大学