专利名称：一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的制作方法
技术领域：
本发明属于分子病理学领域，涉及一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(突变型)(下文中也称为“SCA相关基因”或“SCA相关基因突变型”)。本发明还涉及含有所述遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、所述遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的编码蛋白。本发明还涉及一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的外显子及其编码蛋白。
背景技术：
遗传性脊髓小脑共济失调(hereditaryspinocerebellar ataxias, SCA)是一种具有高度的临床和遗传异质性的神经系统退行性疾病，其遗传方式多呈常染色体显性遗传(autosomal dominant，AD)，患者多于中青年发病，临床上以小脑性共济失调为主要特征，同时还可伴有眼球运动障碍、慢眼活动、视神经萎缩、视网膜色素变性、锥体束征、 锥体外系表现、肌萎缩、周围神经病和痴呆等表现。发病率约为5-7/100，000 (khols L， et al. Autosomal dominant cerebellarataxias :clinical features，genetics，and pathogenesis. Lancet Neurol2004 ；3 :291-304. ；Tsuji S，et al. Sporadic ataxias in Japan__apopulation-based epidemiological study. Cerebellum 2008 :189—97·)。该病发病机制未完全明确，目前尚无有效的治疗方法。随着分子遗传学研究的发展，到目前已经定位了 31种亚型，其中19个遗传性脊髓小脑共济失调致病基因已被克隆，包括ATAXim、ATAXIN2、MJD、Puratrophin-I、 SPTBN2、CACNA1A、ATXN7、ATXN80S/ATXN8、ATXN10、TTBK2、PPP2R2B、KCNC3、PRKCG、 ITPRl、TBP、FGF14、AFG3L2、PLEKHG4、以及 DRPLA(Di Bella D, et al. Mutations in the mitochondrialprotease gene AFG3L2cause dominant hereditary ataxia SCA28. N atGenet 2010 ；42 :313-21. ；Matilla-Duenas A, et al. Cellular andmolecular pathways triggering neurodegeneration in thespinocerebelIar ataxias. Cerebellum 2010 ；9 148-66. ；Sato N, et al.Spinocerebellar ataxia type 31is associated with" inserted" penta-nucleotide repeats containing (TGGAA)n. Am J Hum Genet2009 ；85 :544-57.)。但是，全球范围内约有33%的SCA患者并没有上述的19个遗传性脊髓小脑共济失调致病基因突变的情况，其致病基因尚不清楚。已知转谷氨酰胺酶6 (transglutaminase 6，简称为TG6)，主要在中枢神经系统的神经元细胞内表达，其中包括小脑的浦肯野细胞。据文献报导，TG6可能参与多种疾病如帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病等发病过程(Jeitner TM, Muma NA, Battaile KP, Cooper AJ. Transglutaminase activation in neurodegenerativediseases. Future Neurol 2009 ；4 :449-67.)。尸体解剖发现，在谷蛋白共济失调患者的小脑中有TG6蛋白的沉积；动物实验也发现，血管内注射抗TG2/3/6单链抗体，可以导致小鼠共济失调样表型 (Hadjivassiliou M，Aeschlimann P，Strigun A，Sanders DS, Woodroofe N，Aeschlimann D.Autoantibodies in gluten ataxiarecognize a novel neuronal transglutaminase.Ann Neurol 2008 ；64 :332-43.以及 Boscolo S, Lorenzon A, Sblattero D, Florian F, Stebel Μ,Marzari R,et al. Anti transglutaminase antibodies cause ataxia inmice. PLoS One 2010 ；5 :e9698.)。已知上述的TG6由TGM6基因编码。TGM6基因在GenBank中有两种剪接形式，一种剪接形式的ID号为NC_000020. 10，另一种剪接形式的ID号为NT_011387. 8。NC_000020. 10 的编码序列(codingsequence，简称为CDS)如SEQ ID NO :1所示，其由2121个碱基组成，编码的蛋白由706个氨基酸组成，所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO :2所示。ΝΤ_011387. 8 的编码序列如SEQ ID NO :3所示，其由1878个碱基组成，编码的蛋白由625个氨基酸组成， 所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。TGM6基因的两种剪接形式的编码序列(SEQ ID NO 1)或(SEQ ID NO 3)中第10号外显子如SEQID NO 5所示。新的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的克隆有利于SCA患者的分子诊断，也可为研究SCA的发病机理提供重要线索。
发明内容
本发明人经过不懈的努力，发现了一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因，并由此提供了下述发明本发明的一个方面涉及一种分离的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(突变型)，所述遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型有两种剪接形式，一种剪接形式的核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示，另一种剪接形式的核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示。遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(突变型)的第一种剪接形式(SEQ ID NO 6) 由2121个碱基组成，具体序列如下(突变后的碱基G用边框标出)ATGGCAGGGATCAGAGTCACCAAGGTGGACTGGCAGCGGTCGAGGAATGGCGCTGCCCACCACACCCAG GAGTACCCCTGCCCTGAGCTGGTGGTTCGCAGGGGCCAGTCGTTCAGCCTCACGCTGGAGCTGAGCAGAGCCCTGGA CTGTGAGGAGATCCTCATCTTCACGATGGAGACAGGACCCCGGGCTTCTGAGGCCCTCCACACCAAAGCTGTGTTCC AGACATCGGAGCTGGAGCGGGGTGAGGGCTGGACAGCAGCAAGGGAGGCTCAGATGGAGAAAACTCTGACCGTCAGT CTCGCCAGCCCTCCCAGTGCTGTCATTGGCCGCTACCTGCTGAGCATCAGGCTTTCCTCTCACCGCAAACACAGCAA CCGGAGGCTGGGCGAGTTTGTTCTCCTTTTCAACCCATGGTGTGCAGAGGACGATGTGTTTCTGGCCTCAGAGGAGG AGAGACAGGAGTACGTGCTCAGCGACAGCGGCATCATCTTCCGAGGCGTGGAGAAGCACATACGAGCCCAGGGCTGG AACTACGGGCAGTTTGAGGAGGACATCCTGAACATCTGCCTCTCCATCCTGGATCGAAGCCCCGGTCACCAAAACAA CCCAGCCACCGACGTGTCCTGCCGCCACAACCCCATCTACGTCACCAGGGTCATCAGTGCCATGGTGAACAGCAACA ACGACCGAGGTGTGGTGCAAGGACAGTGGCAGGGCAAGTACGGCGGCGGCACCAGCCCGCTGCACTGGCGCGGCAGC GTGGCCATTCTGCAGAAGTGGCTCAAGGGCAGGTACAAGCCAGTCAAGTACGGCCAGTGCTGGGTCTTCGCCGGAGT CCTGTGCACAGTCCTCAGGTGCTTGGGGATAGCCACACGGGTCGTGTCCAACTTCAACTCAGCCCACGACACAGACC AGAACCTGAGTGTGGACAAATACGTGGACTCCTTCGGGCGGACCCTGGAGGACCTGACAGAAGACAGCATGTGGAAT TTCCATGTCTGGAATGAGAGCTGGTTTGCCCGGCAGGACCTAGGCCCCTCTTACAATGGCTGGCAGGTTCTGGATGC CACCCCCCAGGAGGAGAGTGAAGGTGTGTTCCGGTGCGGCCCAGCCTCAGTCACCGCCATCCGCGAGGGTGATGTGC ACCTGGCTCACGATGGCCCCTTCGTGTTTGCGGAGGTCAACGCCGACTACATCACCTGGCTGTGGCACGAGGATGAG AGCCGGGAGCGTGTATACTCAAACACGAAGAAGATTGGGAGATGCATCAGCACCAAGGCGGTGGGCAGTGACTCCCG CGTGGACATCACTGACCTCTACAAGTATCCGGAAGGGTCCCGGAAAGAGAGGCAGGTGTACAGCAAGGCGGTGAACAGGCTGTTCGGCGTGGAAGCCTCTGGAAGGAGAATCTGGATCCGCAGGGCTGGGGGTCGCTGTCTCTGGCGTGACGAC CTCCTGGAGCCTGCCACCAAGCCCAGCATCGCTGGCAAGTTCAAGGTGCTAGAGCCTCCCATGCTGGGCCACGACCT
GAGACTGGCCCTGTGCT ^GGCCAACCTCACCTCCCGGGCCCAGCGGGTGAGGGTCAACCTGAGCGGTGCCACCATC
CTCTATACCCGCAAGCCAGTGGCAGAGATCCTGCATGAATCCCACGCCGTGAGGCTGGGGCCGCAAGAAGAGAAGAG AATCCCAATTACAATATCTTACTCTAAGTATAAAGAAGACCTGACAGAGGACAAGAAGATCCTGTTGGCTGCCATGT GCCTTGTCACCAAAGGAGAGAAGCTTCTGGTGGAGAAGGACATTACTCTAGAGGACTTCATCACCATCAAGGTTCTG GGCCCAGCCATGGTGGGAGTGGCAGTTACAGTGGAAGTGACAGTAGTCAACCCCCTCATAGAGAGAGTGAAGGACTG TGCGCTGATGGTGGAGGGCAGCGGCCTTCTCCAGGAACAGCTCAGCATCGACGTGCCTACCCTGGAGCCTCAGGAGA GGGCCTCAGTCCAGTTTGACATCACCCCCTCCAAAAGTGGCCCAAGGCAGCTGCAGGTGGACCTTGTAAGCCCTCAC TTCCCGGACATCAAGGGCTTTGTGATCGTCCATGTGGCCACTGCCAAGTGA (SEQ ID NO 6)突变型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(SEQ ID NO 6)与野生型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(SEQ ID NO 1)在序列上的区别是野生型SCA相关基因(SEQ ID NO 1)第1550位的碱基为T，突变型SCA相关基因(SEQ ID NO 6)的第1550位碱基突变为G。遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(突变型)的第二种剪接形式(SEQ ID NO 8) 由1878个碱基组成，具体序列如下(突变后的碱基G用边框标出)ATGGCAGGGATCAGAGTCACCAAGGTGGACTGGCAGCGGTCGAGGAATGGCGCTGCCCACCACACCCAG GAGTACCCCTGCCCTGAGCTGGTGGTTCGCAGGGGCCAGTCGTTCAGCCTCACGCTGGAGCTGAGCAGAGCCCTGGA CTGTGAGGAGATCCTCATCTTCACGATGGAGACAGGACCCCGGGCTTCTGAGGCCCTCCACACCAAAGCTGTGTTCC AGACATCGGAGCTGGAGCGGGGTGAGGGCTGGACAGCAGCAAGGGAGGCTCAGATGGAGAAAACTCTGACCGTCAGT CTCGCCAGCCCTCCCAGTGCTGTCATTGGCCGCTACCTGCTGAGCATCAGGCTTTCCTCTCACCGCAAACACAGCAA CCGGAGGCTGGGCGAGTTTGTTCTCCTTTTCAACCCATGGTGTGCAGAGGACGATGTGTTTCTGGCCTCAGAGGAGG AGAGACAGGAGTACGTGCTCAGCGACAGCGGCATCATCTTCCGAGGCGTGGAGAAGCACATACGAGCCCAGGGCTGG AACTACGGGCAGTTTGAGGAGGACATCCTGAACATCTGCCTCTCCATCCTGGATCGAAGCCCCGGTCACCAAAACAA CCCAGCCACCGACGTGTCCTGCCGCCACAACCCCATCTACGTCACCAGGGTCATCAGTGCCATGGTGAACAGCAACA ACGACCGAGGTGTGGTGCAAGGACAGTGGCAGGGCAAGTACGGCGGCGGCACCAGCCCGCTGCACTGGCGCGGCAGC GTGGCCATTCTGCAGAAGTGGCTCAAGGGCAGGTACAAGCCAGTCAAGTACGGCCAGTGCTGGGTCTTCGCCGGAGT CCTGTGCACAGTCCTCAGGTGCTTGGGGATAGCCACACGGGTCGTGTCCAACTTCAACTCAGCCCACGACACAGACC AGAACCTGAGTGTGGACAAATACGTGGACTCCTTCGGGCGGACCCTGGAGGACCTGACAGAAGACAGCATGTGGAAT TTCCATGTCTGGAATGAGAGCTGGTTTGCCCGGCAGGACCTAGGCCCCTCTTACAATGGCTGGCAGGTTCTGGATGC CACCCCCCAGGAGGAGAGTGAAGGTGTGTTCCGGTGCGGCCCAGCCTCAGTCACCGCCATCCGCGAGGGTGATGTGC ACCTGGCTCACGATGGCCCCTTCGTGTTTGCGGAGGTCAACGCCGACTACATCACCTGGCTGTGGCACGAGGATGAG AGCCGGGAGCGTGTATACTCAAACACGAAGAAGATTGGGAGATGCATCAGCACCAAGGCGGTGGGCAGTGACTCCCG CGTGGACATCACTGACCTCTACAAGTATCCGGAAGGGTCCCGGAAAGAGAGGCAGGTGTACAGCAAGGCGGTGAACA GGCTGTTCGGCGTGGAAGCCTCTGGAAGGAGAATCTGGATCCGCAGGGCTGGGGGTCGCTGTCTCTGGCGTGACGAC CTCCTGGAGCCTGCCACCAAGCCCAGCATCGCTGGCAAGTTCAAGGTGCTAGAGCCTCCCATGCTGGGCCACGACCT
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CTCTATACCCGCAAGCCAGTGGCAGAGATCCTGCATGAATCCCACGCCGTGAGGCTGGGGCCGCAAGAAGAGAAGAG AATCCCAATTACAATATCTTACTCTAAGTATAAAGAAGACCTGACAGAGGACAAGAAGATCCTGTTGGCTGCCATGTGCCTTGTCACCAAAGGAGAGAAGCTTCTGGTGGAGAAGGACATTACTCTAGAGGACTTCATCACCATCAAGCGTGCC TACCCTGGAGCCTCAGGAGAGGGCCTCAGTCCAGTTTGA (SEQ ID NO 8)突变型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的第二种剪接形式(SEQ ID NO 8)与野生型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因对应的剪接形式(SEQ ID NOd)在序列上的区别是野生型SCA相关基因(SEQ ID NO⑶第1550位的碱基为T，突变型SCA相关基因(SEQ ID NO 8)的第1550位碱基突变为G。本发明的又一方面涉及遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型的两种剪接形式(SEQ ID NO :6和SEQ ID NO 8)所编码的蛋白质，其氨基酸序列分别如SEQ ID N0:7和 SEQ ID NO 9 所示。其中，遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型第一种剪接形式所编码的蛋白质由706个氨基酸组成，具体序列如下(突变后的色氨酸用边框标出)(SEQ ID NO 7)MAGIRVTKVDWQRSRNGAAHHTQEYPCPELVVRRGQSFSLTLELSRALDCEEILIFTMETGPRASEALH TKAVFQTSELERGEGWTAAREAQMEKTLTVSLASPPSAVIGRYLLSIRLSSHRKHSNRRLGEFVLLFNPWCAEDDVF LASEEERQEYVLSDSGIIFRGVEKHIRAQGffNYGQFEEDILNICLSILDRSPGHQNNPATDVSCRHNPIYVTRVISA MVNSNNDRGVVQGQWQGKYGGGTSPLHWRGSVAILQKWLKGRYKPVKYGQCWVFAGVLCTVLRCLGIATRVVSNFNS AHDTDQNLSVDKYVDSFGRTLEDLTEDSMWNFHVWNESWFARQDLGPSYNGWQVLDATPQEESEGVFRCGPASVTAI RE⑶VHLAHDGPFVFAEVNADYITWLWHEDESRERVYSNTKKIGRCISTKAVGSDSRVDITDLYKYPEGSRKERQVY
SKAVNRLFGVEASGRRIWIRRAGGRCLWRDDLLEPATKPSIAGKFKVLEPPMLGHDLRLALC @ ANLTSRAQRVRVN LSGATILYTRKPVAEILHESHAVRLGPQEEKRIPITISYSKYKEDLTEDKKILLAAMCLVTKGEKLLVEKDITLEDF ITIKVLGPAMVGVAVTVEVTVVNPLIERVKDCALMVEGSGLLQEQLSIDVPTLEPQERASVQFDITPSKSGPRQLQV DLVSPHFPDIKGFVIVHVATAK(SEQ ID NO 7)遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型第一种剪接形式所编码的蛋白质(SEQ ID NO 7)与野生型SCA基因所对应的剪接形式编码的蛋白质(SEQ ID NO 2)在序列上的区别是SEQ ID NO 3第517位的氨基酸为亮氨酸(Leu)，SEQ ID NO 7的第517位的氨基酸为色氨酸CTrp)。遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型第二种剪接形式所编码的蛋白质(SEQ ID NO 9)所示的蛋白质由625个氨基酸组成，具体序列如下(突变后的色氨酸用边框标出)MAGIRVTKVDWQRSRNGAAHHTQEYPCPELVVRRGQSFSLTLELSRALDCEEILIFTMETGPRASEALH TKAVFQTSELERGEGWTAAREAQMEKTLTVSLASPPSAVIGRYLLSIRLSSHRKHSNRRLGEFVLLFNPWCAEDDVF LASEEERQEYVLSDSGIIFRGVEKHIRAQGffNYGQFEEDILNICLSILDRSPGHQNNPATDVSCRHNPIYVTRVISA MVNSNNDRGVVQGQWQGKYGGGTSPLHWRGSVAILQKWLKGRYKPVKYGQCWVFAGVLCTVLRCLGIATRVVSNFNS AHDTDQNLSVDKYVDSFGRTLEDLTEDSMWNFHVWNESWFARQDLGPSYNGWQVLDATPQEESEGVFRCGPASVTAI RE⑶VHLAHDGPFVFAEVNADYITWLWHEDESRERVYSNTKKIGRCISTKAVGSDSRVDITDLYKYPEGSRKERQVY
SKAVNRLFGVEASGRRIWIRRAGGRCLWRDDLLEPATKPSIAGKFKVLEPPMLGHDLRLALC @ ANLTSRAQRVRVN
LSGATILYTRKPVAEILHESHAVRLGPQEEKRIPITISYSKYKEDLTEDKKILLAAMCLVTKGEKLLVEKDITLEDF ITIKRAYPGASGEGLSPV(SEQ ID NO :9)遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型第二种剪接形式所编码的蛋白质(SEQID NO 9)与野生型与野生型SCA基因所对应的剪接形式编码的蛋白质(SEQ ID NO 4)在序列上的区别是=SEQ IDNO :4第517位的氨基酸为亮氨酸(Leu)，SEQ ID NO 9的第517位的氨基酸为色氨酸(Trp)。本发明所述一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(突变型)的两种剪接形式， 并不局限于上述SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 8所示的具体核苷酸序列。考虑到遗传密码的兼并性，本发明所述SCA相关基因(突变型)的两种剪接形式，包括分别编码SEQ ID NO 7 或SEQID NO 9所示氨基酸序列的任一核苷酸序列。在本发明的一个具体的实施方式中，本发明人检测了一个SCA疾病患者家系，发现SCA患者中本发明所述遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的第1550位碱基均由T变为 G，其所编码的蛋白质第517氨基酸相应的由亮氨酸(Leu)突变为色氨酸(Trp)。本发明的又一方面涉及一种重组载体，其含有本发明的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型；本发明的还一方面涉及一种重组细胞，其含有该重组载体。本发明还涉及一种分离的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型的外显子(10 号外显子)，其核苷酸序列如SEQ ID N0:10所示(突变后的碱基G用边框标出)GGTCCCGGAAAGAGAGGCAGGTGTACAGCAAGGCGGTGAACAGGCTGTTCGGCGTGGAAGCCTCTGGAA GGAGAATCTGGATCCGCAGGGCTGGGGGTCGCTGTCTCTGGCGTGACGACCTCCTGGAGCCTGCCACCAAGCCCAGC
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TCACCTCCCGGGCCCAGCGGGTGAGGGTCAACCTGAGCGGTGCCACCATCCTCTATACCCGCAAGCCAGTGGCAGAG ATCCTGCATGAATCCCACGCCGTGAGGCTGGGGCCGCAAGAAG (SEQ ID NO 10)与野生型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的10号外显子(SEQID NO 5)相比， 突变型的10号外显子(SEQ ID NO 10)的第214碱基由T突变为G。本发明的又一方面涉及突变型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因外显子(SEQ ID NO :10)编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO :12所示(突变后的色氨酸用边框标出)。GSRKERQVYSKAVNRLFGVEASGRRIWIRRAGGRCLWRDDLLEPATKPSIAGKFKVLEPPMLGHDLRLA LC @ ANLTSRAQRVRVNLSGATILYTRKPVAEILHESHAVRLGPQE(SEQ ID NO 12)与野生型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的10号外显子编码蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :11)相比，突变型所编码的蛋白中第72位的氨基酸由亮氨酸突变为色氨酸。本发明所述一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(突变型)的10号外显子，并不局限于上述SEQ ID NO 10所示的具体核苷酸序列。考虑到遗传密码的兼并性，本发明所述SCA相关基因(突变型)的外显子包括编码SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的任一核苷酸序列。本发明的又一方面涉及一种重组载体，其含有本发明的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型的10号外显子。本发明的又一方面涉及一种重组细胞，其含有该重组载体。发明的有益效果本发明发现了一种新的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因，对该基因的检测可能用于SCA患者的辅助诊断，特别是产前诊断，指导优生优育，并且可能有利于明确SCA患者的分子诊断及分子分型。本发明可以对SCA的发病机理提供重要线索，对SCA的诊断治疗具有十分重要的意义。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1 遗传性脊髓小脑共济失调相关基因与SCA疾病关系的验证发明人采集到一个四代遗传的常染色体显性SCA家系，家系内患者表现为进行性加重的行走困难和小脑性构音障碍，绝大部分患者存在腱反射活跃/亢进，部分患者伴有手部震颤和痉挛性斜颈，头部核磁共振成像检查(MRI)示小脑中度萎缩及脑干轻度萎缩。分别对该家系内18名正常人(男7名，女11人)、9名SCA患者(男5名，女4 名)、以及3名临床诊断不明确者(男2名，女1名)的基因组中遗传性脊髓小脑共济失调相关基因进行检测，通过PCR扩增，产物纯化，测序的方法获得遗传性脊髓小脑共济失调相关基因10号外显子的序列，根据序列测定结果属于突变型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(SEQ ID NO 10)还是野生型遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(SEQ ID N0:5)，验证遗传性脊髓小脑共济失调相关基因与SCA的相关性。具体步骤如下1) DNA 提取分别采取上述的18名正常人、9名SCA患者、以及3名临床诊断不明确者的外周静脉血，每人5mL，经枸橼酸钠抗凝，常规酚/氯仿法提取基因组DNA，分光光度计测DNA含量， 并稀释至20ng/ μ L ；2) PCR 检测根据遗传性脊髓小脑共济失调相关基因10号外显子的核苷酸序列设计如下的引物正向引物5'gCCAgTTTgACTTCCATgAgCC 3' (SEQ IDNO 13)反向引物5'CCTCTgACCTCCACAACCCTCC 3‘ (SEQ IDNO 14)PCR 反应体系10 μ LLA Taq 酶(5U/ μ L)0. 1 μ L2 X GC Buffer I (加入了 Mg2+) 5. 0 μ L2mM dNTP0. 4 μ L正向引物(lOOng/μL)0. 2 μ L反向引物(lOOng/μL)0. 2 μ LDNA 模板1 μ LddH20力口至 10 μ L反应条件如下面的表1所示表1 :PCR反应条件
权利要求
1.一种分离的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型，其编码SEQ ID NO :7或SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型，其核酸序列如SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 8 所示。
3.—种重组载体，其含有权利要求1所述的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型。
4.一种重组细胞，其含有权利要求3所述重组载体。
5.一种分离的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO :7或SEQ IDNO :9所示。
6.一种分离的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型外显子，其编码SEQ ID NO 12 所示的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型外显子，其核酸序列如 SEQ ID NO 10 所示。
8.—种重组载体，其含有权利要求6所述的遗传性脊髓小脑共济失调相关基因突变型外显子。
9.一种重组细胞，其含有权利要求8所述重组载体。
10.一种分离的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID N0:12所示。
全文摘要
本发明属于分子病理学领域，涉及一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因(突变型)。具体地，所述遗传性脊髓小脑共济失调相关基因编码SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所示的氨基酸序列，更具体地，所述脊髓小脑共济失调相关基因的核酸序列如SEQ ID NO6或SEQ ID NO8所示。本发明还涉及含有所述脊髓小脑共济失调相关基因的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、以及所述脊髓小脑共济失调相关基因的编码蛋白。此外，本发明还涉及一种遗传性脊髓小脑共济失调相关基因的外显子及其编码蛋白。本发明为遗传性脊髓小脑共济失调的辅助分子诊断、分子分型、产前诊断、药物靶点选择和临床治疗提供了依据。
文档编号C12N15/11GK102220337SQ20101028632
公开日2011年10月19日 申请日期2010年9月19日 优先权日2010年9月19日
发明者唐北沙, 张朋, 王俊岭, 翁翎, 苏政, 金鑫 申请人:中南大学, 深圳华大基因科技有限公司